龔詩(shī)媚，鄧雅妮，張曼，王東偉，王凱，趙雷，胡卓炎

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)

貝氏酵母(Saccharomycesbayanus)是一種常用于發(fā)酵西打果酒的酵母菌，已在蘋(píng)果西打果酒商業(yè)中得以應(yīng)用。研究顯示，貝氏酵母在果酒發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，增加酒體的香氣[1]。JANUSZEK等[1]將貝氏酵母發(fā)酵的蘋(píng)果白蘭地與釀酒酵母(Saccharomycescereisiae)發(fā)酵的果酒進(jìn)行比較，結(jié)果表明前者中的香氣成分(包括醋酸酯、乙酸異戊酯、棕櫚酸乙酯)濃度明顯增加。EGLINTON等[2]將貝氏酵母應(yīng)用于葡萄酒發(fā)酵，結(jié)果顯示在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了更多的甘油、乙醛和較少的乙酸、蘋(píng)果酸等物質(zhì)，并在感官方面，賦予了果酒“熟橘皮”、“堅(jiān)果”等風(fēng)味。此外，有研究人員為使酒體的揮發(fā)性物質(zhì)更加豐富，將貝氏酵母與其他菌株混合應(yīng)用到獼猴桃酒的發(fā)酵[3]?？梢?jiàn)利用貝氏酵母發(fā)酵的果酒具有更高的風(fēng)味強(qiáng)度，增加果酒風(fēng)味的豐富性。

荔枝(LitchichinensisSonn.)屬于無(wú)患子科熱帶和亞熱帶水果，因其誘人的顏色、獨(dú)特的風(fēng)味、豐富的營(yíng)養(yǎng)和保健作用而受到人們的喜愛(ài)[4]。荔枝果肉含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，如碳水化合物、蛋白質(zhì)、必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，其含量因荔枝品種而異[5]。由于新鮮荔枝采后壽命短，貯藏時(shí)間過(guò)久會(huì)導(dǎo)致其中的活性成分迅速流失，極大地影響其貯藏性和市場(chǎng)價(jià)值[6]。釀酒是荔枝深加工的重要途徑，通過(guò)發(fā)酵不僅可以保留原始果汁中的大部分營(yíng)養(yǎng)成分，還可產(chǎn)生包含氨基酸在內(nèi)的其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[7]，在合理利用荔枝資源的同時(shí)提高荔枝產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

目前已有研究者探討荔枝果酒和啤酒的風(fēng)味成分和抗氧化特性[8-10]，但將貝氏酵母應(yīng)用于荔枝酒發(fā)酵的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道，因而研究貝氏酵母對(duì)荔枝酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響對(duì)提高荔枝果酒的品質(zhì)有重要意義。采用電子鼻和氣相色譜-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS)等技術(shù)分析食品的揮發(fā)性成分特征備受重視[11-12]。故本文采用貝氏酵母發(fā)酵制備荔枝果酒，利用電子鼻和GC-IMS技術(shù)對(duì)其發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味成分的變化進(jìn)行分析，以期為荔枝酒的開(kāi)發(fā)利用及其品質(zhì)的控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝，品種為妃子笑 (LitchichinensisSonn c.Feizixiao)，產(chǎn)地為海南，鮮果當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，并于-20 ℃以下凍藏備用；貝氏酵母(商品名SafCider)，法國(guó)Fermentis酵母公司。

PEN3電子鼻系統(tǒng)，德國(guó)Airsense公司；LHS-HC-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣州市深華生物技術(shù)有限公司；BS110S電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Flaour Spec 1H1-00053型風(fēng)味分析儀，配有分析軟件包括LA(Laboratory Analytical iewer)、Reporter 插件、Gallery Plot插件以及GC×IMS Library Search)，德國(guó)G.A.S公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

選擇充分成熟，無(wú)腐爛變質(zhì)的荔枝去皮去核后打漿處理并過(guò)濾，隨后離心得荔枝清汁。發(fā)酵條件參照文獻(xiàn)[1,8-9]，為抑制雜菌繁殖，加入120 mg/L偏重亞硫酸鉀，調(diào)整糖度為20°Brix，加入0.3 g/L貝氏酵母于20 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵。于0、2、4、6、8、10 d采集發(fā)酵液，制備分析樣品，立即于-80 ℃下保存，待分析。

1.2.2 電子鼻分析

表1為PEN3型電子鼻10個(gè)金屬傳感器的陣列及性能描述。參照CAO等[11]方法，稍作修改。準(zhǔn)確量取5 mL樣品于30 mL樣品瓶中，加密封蓋，室溫富集30 min后將進(jìn)樣針插入樣品瓶采用頂空吸氣法進(jìn)行電子鼻分析試驗(yàn)。測(cè)試前對(duì)電子鼻參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，傳感器清洗時(shí)間100 s，傳感器歸零時(shí)間5 s，樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s，進(jìn)樣流量 150 mL/min，檢測(cè)時(shí)間120 s。完成每次檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行清零和標(biāo)準(zhǔn)化后再測(cè)試下一個(gè)樣品，每種樣品重復(fù)3次測(cè)定，采用電子鼻軟件WinMuster對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)和載荷分析。

表1 PEN3傳感器陣列及性能描述Table 1 Sensor arrays and performance specification of electronic nose PEN3

1.2.3 氣相色譜-離子遷移譜分析

參考陳小愛(ài)等[12]的方法，并稍加修改。

制樣方法：稱(chēng)取1 mL樣品，置于20 mL頂空瓶中待分析；頂空孵化溫度70 ℃，孵化時(shí)間15 min，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min，進(jìn)樣體積200 μL，進(jìn)樣針溫度85 ℃。

GC條件：MXT-WAX(30 m×0.53 mm，1 μm)色譜柱，色譜柱溫60 ℃，運(yùn)行時(shí)間30 min，載氣為高純度N2；載氣流速：起始2 mL/min保持2 min，在2～20 min線(xiàn)性增加至100 mL/min，保持10 min。

IMS條件：在500 /cm的電場(chǎng)下施加氚源，漂移管長(zhǎng)度為9.8 cm，漂移氣為高純度N2，流速150 mL/min，漂移管溫度45 ℃。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)百分含量測(cè)定：運(yùn)用GC-IMS內(nèi)置的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行二維定性，根據(jù)定性物質(zhì)峰面積計(jì)算相對(duì)百分含量，應(yīng)用于相對(duì)活度值(relatie odor actiity alue，ROA) 計(jì)算。

1.2.4 ROA分析

參考劉登勇等[13]的方法，計(jì)算ROA，考察樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分：ROAstan=100，對(duì)其他組分活度值按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：CA，各風(fēng)味組分的相對(duì)百分含量，%；TA,各風(fēng)味組分的感覺(jué)閾值；Cstan,樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大成分的相對(duì)百分含量，%；Tstan，風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的感覺(jué)閾值。其中風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)百分含量均由GC-IMS測(cè)定得出。ROA≥1的組分為所分析樣品的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，0.1≤ROA<1的組分對(duì)樣品的總體風(fēng)味具有重要的修飾作用。

1.2.5 感官評(píng)定

參考秦獻(xiàn)泉等[14]對(duì)荔枝果酒的模糊綜合評(píng)判法進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括色澤、香氣、口味和風(fēng)格4項(xiàng)，總分值為100，各項(xiàng)權(quán)重分別為0.1、0.4、0.3和0.2，各項(xiàng)評(píng)價(jià)分5個(gè)等級(jí)：很好、較好、一般、較差和差。評(píng)定人員由8名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的具有食品專(zhuān)業(yè)背景的人員組成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行鄧肯單因素方差分析(P<0.05)；采用GC-IMS自帶儀器分析軟件，包括LA、Reporter和Gallery plot對(duì)樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行采集和分析，通過(guò)保留指數(shù)(retention index，RI)和漂移時(shí)間與GC-IMS文庫(kù)以及峰面積歸一化處理進(jìn)行化合物定性定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻對(duì)荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的特征分析

電子鼻技術(shù)是基于氣體傳感陣列響應(yīng)圖譜識(shí)別氣體的電子系統(tǒng)，是一種用途廣泛、實(shí)時(shí)無(wú)損的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析檢測(cè)方法[15]。荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在電子鼻傳感器響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度如圖1所示，樣品響應(yīng)強(qiáng)度較突出的傳感器有W1C、W5S、W5C、W1W和W2S，它們分別對(duì)芳香成分、氮氧化合物、烷烴、萜烯類(lèi)、硫化物、醇類(lèi)和醛酮類(lèi)物質(zhì)靈敏。其中W5S傳感器響應(yīng)值最高，并且荔枝酒在發(fā)酵期間該傳感器上的響應(yīng)值有較大差異，表明傳感器W5S對(duì)荔枝酒的發(fā)酵程度可較好地區(qū)分。其次W1W(硫化物)響應(yīng)值呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，由于硫化物具有臭雞蛋味，對(duì)樣品氣味起負(fù)面作用，因此樣品的硫化物響應(yīng)值越低越好。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)貝氏酵母發(fā)酵的荔枝酒主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為氮氧化合物、烷烴、醇類(lèi)及醛酮類(lèi)，可根據(jù)對(duì)應(yīng)傳感器的響應(yīng)值大小判定荔枝酒的發(fā)酵程度。

圖1 荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中電子鼻響應(yīng)雷達(dá)圖Fig.1 Radar diagram of electronic nose response during litchi wine fermentation

2.2 GC-IMS對(duì)荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的特征分析

電子鼻測(cè)定結(jié)果僅能得到樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的整體輪廓，顯示發(fā)酵過(guò)程中荔枝酒響應(yīng)信號(hào)的差異。為了更全面且細(xì)致的分析荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化，采用氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示，縱坐標(biāo)表示GC保留時(shí)間，橫坐標(biāo)代表反應(yīng)離子峰遷移時(shí)間。在1.0～1.8 ms的遷移時(shí)間內(nèi)，200～1 200 s的保留時(shí)間內(nèi)，有效的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較多。運(yùn)用GC-IMS內(nèi)置的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行二維定性，共檢出60種化合物，其中定性出41種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。圖中藍(lán)色背景上每個(gè)亮點(diǎn)代表一種揮發(fā)性物質(zhì)，由白到紅，濃度升高。由圖2可知，發(fā)酵過(guò)程揮發(fā)性風(fēng)味化合物的含量和種類(lèi)在2 d后明顯增加，而發(fā)酵后期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量和種類(lèi)差異較小，與電子鼻分析的測(cè)定結(jié)果相符。

圖2 荔枝酒發(fā)酵過(guò)程揮發(fā)性風(fēng)味化合物 GC-IMS二維俯視圖Fig.2 Two-dimensional GC-IMS top iew of olatile flaor compounds during litchi wine fermentation

圖3是運(yùn)用LA軟件與插件“Gallery plot”選取每種樣本譜圖中揮發(fā)性物質(zhì)信號(hào)峰進(jìn)行排序形成指紋圖，橫軸為一個(gè)樣品檢測(cè)出的所有揮發(fā)性成分，縱軸為不同發(fā)酵時(shí)間的樣品。顏色深淺程度代表?yè)]發(fā)性化合物的含量，含量越高的顏色越亮。

圖3 荔枝酒發(fā)酵過(guò)程揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-IMS指紋圖譜Fig.3 GC-IMS fingerprint of olatile flaor compounds in the fermentation process of litchi wine

由于單體離子和中性分子可能在漂移區(qū)形成附屬物，因此可能產(chǎn)生單倍體(M)、二聚體(D)和三聚體(T)[16]，未經(jīng)鑒定的揮發(fā)性風(fēng)味化合物用數(shù)字進(jìn)行標(biāo)識(shí)。其中A區(qū)為荔枝汁(0 d)與發(fā)酵后荔枝酒共有的揮發(fā)性成分，分別為2-甲基丙醛(M)、正丙醇和丁酸乙酯(M)。B區(qū)為僅在發(fā)酵第2 天時(shí)大量存在的揮發(fā)性物質(zhì)，且隨著發(fā)酵時(shí)間的增加迅速降低，分別為2-甲基丁醛、丙醛(M/D)、3-羥基-2-丁酮(M/D)、2-甲基丙醛(D)、甲酸乙硫醚和正丁醇。C區(qū)為發(fā)酵過(guò)程新產(chǎn)生且含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)，以乙酸酯類(lèi)為主，包括乙酸丁酯(D)、乙酸丙酯(M)、乙酸異戊酯(M)等，該結(jié)果與JANUSZEK等[1]使用貝氏酵母發(fā)酵蘋(píng)果白蘭地的香氣成分相似。這是由于釀酒酵母有2種AAT酶(ATF1和ATF2)，而在貝氏酵母中存在另一種AAT酶(Lg-ATF1)，并且ATF1是合成乙酸酯類(lèi)重要的酯合酶，醇乙?；D(zhuǎn)移酶(AATase)主要由基因ATF1、ATF2和Lg-ATF1編碼，催化酵母中乙酰輔酶A(acetyl-CoA)和乙醇結(jié)合，生成乙酸酯類(lèi)[17]。

對(duì)GC-IMS測(cè)定的荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行PCA載荷分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間樣品中揮發(fā)性風(fēng)味化合物PCA載荷圖Fig.4 PCA loading plots of olatile flaor compounds in samples at different fermentation times

第一主成分的貢獻(xiàn)率為66.98%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為22.25%，總貢獻(xiàn)率為89.23%，具有較好的代表性。與電子鼻結(jié)果一致，PCA結(jié)果可較好地將原汁和發(fā)酵后期的荔枝酒區(qū)分開(kāi)來(lái)，且在發(fā)酵后的第6、8、10天較為接近。其中在發(fā)酵第2天，起到主要作用的揮發(fā)性物質(zhì)分別是丙醛M/D、2-甲基正丁醛、2-甲基丙醛M/D、3-羥基-2-丁酮、甲酸乙硫醚。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，在第6、8和10天起主要作用的揮發(fā)性物質(zhì)以酯類(lèi)物質(zhì)為主，主要包括乙酸丁酯M、乙酸乙酯、乙酸丙酯D、乙酸異戊酯T、丁酸乙酯T等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中丁酸乙酯和乙酸丁酯賦予荔枝酒甜香、果香，乙酸異戊酯具有強(qiáng)烈的水果香氣，似香蕉味，且癸酸乙酯具有新鮮的水果香味和酒香味[18]。

2.3 荔枝酒發(fā)酵過(guò)程揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的ROA

采用ROA法確定GC-IMS測(cè)定的荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味化合物，以此進(jìn)一步評(píng)價(jià)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)?；谇叭说难芯抗ぷ?，已表明揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量與特征香氣并非呈直接的比例關(guān)系，由于不同物質(zhì)的閾值差異大，起到的嗅覺(jué)反應(yīng)也不同，揮發(fā)性風(fēng)味化合物對(duì)食品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)由其濃度和感覺(jué)閾值共同決定[19]。按照公式(1)計(jì)算獲得的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的ROA如表2所示。荔枝原汁中有4種關(guān)鍵風(fēng)味化合物，分別為丁酸乙酯(甜香、蘋(píng)果香)、異丁醛(草香、麥芽香)、己醛(青草、脂肪氣味)和丙醛。而經(jīng)貝氏酵母發(fā)酵后荔枝酒的關(guān)鍵風(fēng)味化合物主要有丁酸乙酯、二氫草莓酸乙酯、異丁醛(草香、麥芽香)、乙酸異戊酯(果香、香蕉味)、己酸乙酯(香蕉味、菠蘿味)、辛酸乙酯(果香、脂香)。有研究者也證實(shí)采用酵母(D10，Lallemand Co，F(xiàn)rance)發(fā)酵的荔枝酒中揮發(fā)性組分對(duì)總體氣味有直接影響的物質(zhì)包括丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等[20]。除了關(guān)鍵風(fēng)味化合物還有其他的起修飾作用的揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括乙酸丁酯(水果香)、丙酸乙酯(菠蘿香)和丙醛，這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同賦予了荔枝酒果香、甜香。

表2 荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)風(fēng)味活度值Table 2 ROA of olatile flaor compounds in the fermentation process of litchi wine

2.4 感官評(píng)價(jià)

采用模糊評(píng)判法對(duì)發(fā)酵終了的荔枝果酒樣品進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果如圖5所示。色澤、香氣、口味和風(fēng)格的評(píng)分分別為81.25、77.5、71.25、77.5，由權(quán)重算出感官綜合評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)為76。各指標(biāo)均位于較好水平，樣品色澤略帶微黃，澄清，無(wú)懸浮物，具有果香和酒香。

圖5 荔枝果酒樣品感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.5 Sensory ealuation radar diagram of litchi wine samples

3 結(jié)論

貝氏酵母常被用于改善發(fā)酵果酒的風(fēng)味，采用電子鼻和GC-IMS技術(shù)結(jié)合分析了經(jīng)貝氏酵母發(fā)酵的荔枝酒揮發(fā)性風(fēng)味成分的變化，結(jié)果表明，電子鼻可以根據(jù)對(duì)應(yīng)傳感器的響應(yīng)值大小對(duì)荔枝酒發(fā)酵程度進(jìn)行判定，較好地區(qū)分不同發(fā)酵階段的荔枝酒，其差異主要集中在W5S(氮氧化合物)和W2S(醇類(lèi)、醛酮類(lèi))2個(gè)傳感器的響應(yīng)值。GC-IMS同樣測(cè)定出發(fā)酵過(guò)程醇類(lèi)和醛酮類(lèi)物質(zhì)發(fā)生了顯著變化，此外，GC-IMS分析結(jié)果表明酯類(lèi)物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中變化明顯，以乙酸酯類(lèi)為主，并且貝氏酵母是一種很好的乙酸酯類(lèi)生產(chǎn)者。ROA顯示發(fā)酵過(guò)程的差異主要來(lái)源于關(guān)鍵性風(fēng)味化合物貢獻(xiàn)度的不同，發(fā)酵后期的關(guān)鍵風(fēng)味化合物主要有丁酸乙酯、二氫草莓酸乙酯、異丁醛、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯，其在總體風(fēng)味上起關(guān)鍵性作用。對(duì)貝氏酵母發(fā)酵終點(diǎn)的荔枝果酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，綜合感官評(píng)分為76，樣品具有果香和酒香。本研究分析了貝氏酵母發(fā)酵荔枝果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，為貝氏酵母應(yīng)用于荔枝果酒的發(fā)酵提供一定的理論與實(shí)踐依據(jù)。此外，在揮發(fā)性成分的測(cè)定方法上還可利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜嗅覺(jué)測(cè)量技術(shù)測(cè)定分析，進(jìn)一步分析貝氏酵母對(duì)荔枝酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，便于更全面的探究貝氏酵母的發(fā)酵特征。