趙彥萍，陳媛媛，方繼良＊＊，洪 洋＊＊，王 珺，孫 黎，王 智

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 北京 100053；2.北京市平谷區(qū)中醫(yī)院 北京 101200）

合谷穴在頭面五官疾病治療中療效突出，《四總穴歌》中概括為“面口合谷收”，但其腦效應(yīng)機(jī)制尚不完全明確。MEGA-PRESS（MEscher-GArwood point resolved spectroscopy，MEGA-PRESS）序列是唯一無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)活體組織器官代謝物濃度的技術(shù)[1]，為檢測(cè)γ-氨 基 丁 酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、谷 氨 酸(glutamine，Glu)和谷氨酸谷氨酰胺復(fù)合物（Glutamate+Glutamine,Glx）提供了新方法。血氧水平依賴功能磁共振腦成像（blood oxygen level dependent functional MRI,BOLD-fMRI）能在活體狀態(tài)下檢測(cè)腦內(nèi)血流變化，其信號(hào)強(qiáng)度存在正、零、負(fù)激活；正激活反映神經(jīng)元興奮，腦血流量增加；但零、負(fù)激活原理尚不完全明確，有“盜血”、神經(jīng)抑制等假說(shuō)。大腦皮層功能正常發(fā)揮作用依賴于皮層興奮和抑制因素的動(dòng)態(tài)平衡，該平衡與腦內(nèi)主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu活性密切相關(guān)[2]，已受到越來(lái)越多研究者關(guān)注。目前這方面的研究不多，最初研究者發(fā)現(xiàn)健康人在疼痛、視覺、直流電等非針刺刺激時(shí)不同腦區(qū)內(nèi)Glu、Glx、GABA濃度改變[3-5]；隨后研究者發(fā)現(xiàn)健康人在不同刺激時(shí)，相同腦區(qū)出現(xiàn)正、負(fù)不同激活狀態(tài)，并且研究了不同激活狀態(tài)時(shí)Glu、Glx、GABA濃度改變[6]；同時(shí)研究者發(fā)現(xiàn)健康人不同腦區(qū)Glu或Glx與GABA存在動(dòng)態(tài)平衡，并嘗試進(jìn)一步量化動(dòng)態(tài)平衡比例[7-10]；最后研究者發(fā)現(xiàn)一些精神或神經(jīng)疾病患者與健康對(duì)照者相比的特定腦區(qū)內(nèi)Glu、Glx與GABA平衡或濃度參考值失衡，提出可將其作為臨床生物指標(biāo)[11-12]。針灸作為中國(guó)特色的綠色療法，具有雙向調(diào)節(jié)作用，同時(shí)具有個(gè)體差異性。目前有關(guān)針刺腦內(nèi)代謝物濃度改變的文獻(xiàn)研究非常少，有關(guān)研究針刺不同Bold激活狀態(tài)時(shí)腦內(nèi)各種代謝物濃度改變的文獻(xiàn)研究就更少，尤其是關(guān)于抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu濃度改變的相關(guān)文獻(xiàn)研究。我們之前的研究[13-14]表明，手針與纖毛針刺激合谷穴均能誘發(fā)以邊緣葉-旁邊緣葉-新皮層網(wǎng)絡(luò)為主的大腦皮層廣泛的負(fù)激活，同時(shí)誘發(fā)包括大部分雙側(cè)前額葉內(nèi)側(cè)皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）及少部分前扣帶回（anterior cingulate cortex，ACC）皮 層 的 感 興 趣 區(qū)（Region of interest，ROI）內(nèi)Bold的正、零及負(fù)激活，但手針針刺負(fù)激活范圍更廣、強(qiáng)度值更大，并初步探討了腦功能Bold信號(hào)與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu的關(guān)系[15]；本課題通過研究手針針刺前與針刺時(shí)不同Bold激活狀態(tài)下，ROI內(nèi)興奮性與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)濃度變化及相關(guān)性，初步探討健康人針刺效應(yīng)的腦機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究招募76例健康受試者，女53例，男23例，年齡20-30歲，平均（24.5±1.4）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①右利手；②男女不限；③無(wú)fMRI禁忌證，如患幽閉恐懼癥者或妊娠期婦女等；④既往無(wú)神經(jīng)、精神異常，無(wú)內(nèi)科疾病及無(wú)腦部外傷史、手術(shù)史等。本課題通過中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（倫理編號(hào)：ECAF-055），檢查前向所有受試者解釋試驗(yàn)過程、目的、潛在不適和危險(xiǎn)性及需要同時(shí)接受手針針刺及纖毛針兩種刺激，受試者均自愿參加研究，并簽署知情同意書。

1.2 儀器與方法

采用德國(guó)Siemens Magneton Skyra 3.0T超導(dǎo)MR儀，20通道頭頸線圈，針刺組采用0.4 mm×25 mm一次性無(wú)磁不繡鋼針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），對(duì)照組采用規(guī)格為5.88的Von Frey纖毛表皮刺激針（Patterson Company，USA）（簡(jiǎn)稱纖毛針），通過刺激皮膚表面模擬針刺。囑受檢者仰臥閉眼，采集全腦解剖成像、針刺前采集BOLD-fMRI及MRS序列，隨后安排1名具有5年以上工作經(jīng)驗(yàn)的針灸科醫(yī)生進(jìn)入掃描室，消毒右手第二掌骨橈側(cè)區(qū)域皮膚，進(jìn)行手針或纖毛針操作，同時(shí)采集針刺時(shí)的BOLD-fMRI及MRS序列。

掃描參數(shù)：全腦解剖成像采用磁化準(zhǔn)備快速梯度回 波（magnetization-prepared rapid gradient-echo，MPRAGE）序列，TR 15 ms，TE 6.9 ms，F(xiàn)OV 256 mm×256 mm，F(xiàn)A 15°，層數(shù)196，層厚1 mm；BOLD-fMRI采用多層平面回波成像（echo planar imaging，EPI）序列，

TR 750 ms，TE 30 ms，F(xiàn)A 90°，F(xiàn)OV 210 mm×210 mm，矩陣70×70，層數(shù)48，層厚3 mm，層距0，掃描時(shí)長(zhǎng)6 min 46 s，軸位定位線平行前、后聯(lián)合連線（AC-PC線），掃描范圍包括小腦和腦干；MRS采用MEGAPRESS序列，TR 2000 ms，TE 68 ms，采集次數(shù)128，脈沖頻率1.9 ppm，中心頻率4.7 ppm，時(shí)間8 min 40 s，全寬半高＜30，于mPFC及ACC勾畫35 mm×30 mm×25 mm大小ROI，垂直于AC-PC線的平行線，長(zhǎng)方體后壁中點(diǎn)位于胼胝體尖端（圖1），避開額骨、額竇及雙側(cè)側(cè)腦室前角，并在ROI的前、上、下部設(shè)置飽和帶，以減少偽影。所有受式者均接受手針和纖毛針兩種針刺方式，兩種刺激方式通過隨機(jī)信封分配，時(shí)間間隔1周。針灸科醫(yī)師根據(jù)掃描觸發(fā)指令完成3次手針平補(bǔ)平瀉捻轉(zhuǎn)或Von Frey纖毛針表面垂直刺激，頻率60次/min，持續(xù)30 s，刺激間隔2 min（圖2），針刺結(jié)束詢問并記錄志愿者每個(gè)受試者酸麻脹痛等針感及程度。

圖1 MRS矢、冠、軸定位圖（紅色為ROI）

圖2 針刺模式示意圖

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 MRS

將MRS原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為*.rda格式，應(yīng)用LC Model（Linear Combination Model in vitro spectra，LC Model）軟件進(jìn)行后處理，獲得Glx及GABA濃度定量值及曲線（圖3）。采用Matlab 8.0及SPM 12軟件將健康受試者全腦解剖成像進(jìn)行分割、配準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)化，得到腦灰質(zhì)（gray matter，GM）、白質(zhì)（white matter，WM）及腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）體積，計(jì)算GM體積的比例，分析得到的矯正Glu、Glx、GABA含量，以Glu+、Glx+、GABA+表示。

圖3 MRS曲線

1.3.2 BOLD-fMRI

將fMRI原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為*.nii格式，采用SPM 12軟件行預(yù)處理及個(gè)體分析，參考文獻(xiàn)[16]計(jì)算ROI內(nèi)灰質(zhì)內(nèi)正、負(fù)BOLD信號(hào)強(qiáng)度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，滿足正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較組間MRS定量值差異；采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較組內(nèi)靜息與任務(wù)時(shí)MRS定量值差異。采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析靜息狀態(tài)與任務(wù)時(shí)Glu+、Glx+、GABA+的濃度及Glu+、Glx+與GABA+濃度的相關(guān)性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 ROI內(nèi)Glu+、Glx+、GABA+濃度及相關(guān)性分析

3名受試者Glx標(biāo)準(zhǔn)差＞15%，2名受試者GABA標(biāo)準(zhǔn)差＞15%，予以排除，共納入71名受試者進(jìn)行Glu+、Glx+、GABA+濃度及相關(guān)性分析；手針組正激活11名、零激活13名，負(fù)激活47名，平均BOLD信號(hào)強(qiáng)度為-1.506±2.315；纖毛組零激活16名、零激活14名，負(fù)激活41名，平均BOLD信號(hào)強(qiáng)度為-0.942±2.377。

2.1.1 兩組間Glu+、Glx+、GABA+濃度差異

刺激前、刺激時(shí)整組、各亞組手針組與纖毛針組Glu+、Glx+、GABA+濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（表1）。

表1 兩組間ROI內(nèi)Glu+、Glx+及GABA+濃度差異

2.1.2 兩組內(nèi)Glu+、Glx+、GABA+濃度差異及相關(guān)性

手針組、纖毛組內(nèi)整組與各亞組針刺前與針刺時(shí)Glu+、Glx+、GABA+濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。手針整組針刺前與針刺時(shí)Glu+、Glx+、GABA+濃度，零、負(fù)激活亞組針刺前與針刺時(shí)Glu+、Glx+及零激活亞組針刺前與針刺時(shí)GABA+均呈正相關(guān)（P均＜0.05）；纖毛組整組針刺前與針刺時(shí)的Glu+、Glx+濃度及零激活亞組針刺前與針刺時(shí)Glx+均呈正相關(guān)（P均＜0.05）（表2）。

2.1.3 兩組內(nèi)Glu+、Glx+濃度與GABA+濃度相關(guān)性

針刺前手針整組、零、負(fù)激活亞組，纖毛針整組、正、負(fù)激活亞組Glu+、Glx+與GABA+以及零激活Glu+與GABA+均呈正相關(guān)（P均＜0.05）；針刺時(shí)手針整組Glu+、Glx+與GABA+濃度，負(fù)激活亞組Glu+與GABA+濃度以及零激活亞組Glx+與GABA+濃度均呈正相關(guān)（P均＜0.05）（表3）。

表3 ROI針刺前與針刺時(shí)Glu+、Glx+及GABA+濃度相關(guān)性

3 討論

大腦皮層各種功能正常發(fā)揮作用依賴于皮層中興奮性和抑制性因素的動(dòng)態(tài)平衡，這一平衡與興奮性遞質(zhì)Glu和抑制性遞質(zhì)GABA的活性密切相關(guān)[14,17-18]，Glu與GABA相互作用從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元放電頻率，影響B(tài)OLD-fMRI信號(hào)。BOLD-fMRI主要檢測(cè)腦內(nèi)血氧飽和度，其BOLD信號(hào)正、零、負(fù)激活及程度主要取決于供氧量與耗氧量的相對(duì)關(guān)系。刺激不僅能引起血流量增加供氧量增加，同時(shí)也引起神經(jīng)興奮升高或抑制性降低耗氧量增加；目前，BOLD信號(hào)與神經(jīng)遞質(zhì)濃度關(guān)系尚無(wú)定論。本課題通過研究針刺前、針刺時(shí)ROI區(qū)內(nèi)BOLD正、零、負(fù)激活Glu+、Glx+及GABA+濃度的關(guān)系，初步探討健康人BOLD信號(hào)與神經(jīng)遞質(zhì)關(guān)系的針刺腦機(jī)制。

Gutzeit、Cleve等[3-4]發(fā)現(xiàn)疼痛感知時(shí)島葉、前扣帶回和枕葉皮層的Glx升高，同時(shí)前扣帶回和枕葉皮層GABA下降[4]；Kupers[5]發(fā)現(xiàn)熱疼痛刺激時(shí)，前扣帶回喙部（rACC）的GABA升高，Glu和Glx無(wú)變化。Stagg等[19]通過經(jīng)顱直流電刺激時(shí)，陰極刺激后中央前回Glu顯著降低，陽(yáng)極刺激后Glu無(wú)顯著變化，而GABA濃度明顯下降。首先神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和代謝迅速，較長(zhǎng)時(shí)間的刺激可能產(chǎn)生適應(yīng)性，并且Glu受內(nèi)環(huán)境調(diào)控，存在預(yù)防興奮性毒性環(huán)路機(jī)制[18,20]；其次，重復(fù)抑制效應(yīng)，通常能使神經(jīng)元產(chǎn)生適應(yīng)性而減少活動(dòng)[17]，上述因素可能致Glu、Glx及GABA變化微弱；本研究Block刺激模式時(shí)間長(zhǎng)、重復(fù)相同刺激，可能導(dǎo)致Glu+、Glx+、GABA+濃度刺激時(shí)與刺激前相差不明顯，不能體現(xiàn)Glu、Glx、GABA短時(shí)、快速變化。

目前任務(wù)引起Glu、Glx、GABA濃度變化及相關(guān)性研究尚無(wú)定論。Cleve等[21]研究發(fā)現(xiàn)疼痛刺激時(shí)前扣帶回皮質(zhì)、枕葉皮層Glx/tCr升高，同時(shí)GABA+/tCr降低；Ip[22]等研究發(fā)現(xiàn)隨著視覺刺激增加，Glx濃度明顯增加，而GABA濃度維持不變；Boillat等[23]研究發(fā)現(xiàn)不同視覺刺激正激活區(qū)Glu增加，而負(fù)激活區(qū)GABA、Glu濃度降低；Stagg等[19]研究發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)直流電刺激后，健康受試者感覺運(yùn)動(dòng)皮層的Glx及GABA濃度均減少，并呈顯著正相關(guān)；Mart?′nez-Maestro等[6]研究不同視覺刺激，發(fā)現(xiàn)正激活時(shí)Glu濃度增加，負(fù)激活Glu濃度減低；本研究發(fā)現(xiàn)針刺Bold正激活時(shí)Glu+、Glx+、GABA+濃度均增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05），Glu+、Glx+增加較多，而GABA增加較少；針刺Bold負(fù)激活時(shí)GABA+濃度減低，Glu+、Glx+略增加、但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。綜上所述，目前Glu、Glx、GABA濃度方面研究方法眾多、結(jié)果也不盡相同；以BOLD激活狀態(tài)為基礎(chǔ)研究腦內(nèi)代謝物的方式被越來(lái)越多研究者認(rèn)可，如Boillat等[23]研究發(fā)現(xiàn)正激活區(qū)Glu濃度升高，負(fù)激活區(qū)Glu濃度降低；IP等[22]研究發(fā)現(xiàn)Glu濃度與Bold信號(hào)強(qiáng)度呈線性關(guān)系，我們研究也發(fā)現(xiàn)不同激活狀態(tài)時(shí)Glu、Glx、GABA濃度變化不同，故推測(cè)不同激活狀態(tài)神經(jīng)遞質(zhì)變化存在差異，這仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

研究發(fā)現(xiàn)靜息時(shí)健康人Glu、Glx與GABA濃度多呈正相關(guān)，與神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性和抑制性遞質(zhì)（excitaory and inhibitory,E/I）維持平衡狀態(tài)的假說(shuō)一致。Steel等[7]研究發(fā)現(xiàn)靜息時(shí)多個(gè)腦區(qū)Glx和GABA濃度呈明顯相關(guān)性；Wiebking等[24]發(fā)現(xiàn)靜息時(shí)健康志愿者島葉和前額葉內(nèi)側(cè)皮層的Glu和GABA濃度呈正相關(guān)。Stagg等[25]研究發(fā)現(xiàn)靜息時(shí)運(yùn)動(dòng)皮層Glx與GABA濃度呈正相關(guān)；而Barron，Gu及Bezalel等量化GABA與Glu[8-9]和GABA與Glx[10]比值，將其作為測(cè)量特定腦區(qū)E/I平衡參考值，為疾病診斷或治療提供幫助，如Chiu等[12]研究發(fā)現(xiàn)精神分裂患者前扣帶回GABA與Glx平衡參考值變化，具有診斷精神分裂癥的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)手針與纖毛針針刺ROI的Glu+、Glx+與GABA+濃度多呈正相關(guān)（P均＜0.05），驗(yàn)證了健康人前額葉內(nèi)側(cè)皮層興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)維持平衡狀態(tài)的假說(shuō)，為進(jìn)一步研究探討與前額葉內(nèi)側(cè)皮層相關(guān)的精神或神經(jīng)疾病奠定一定基礎(chǔ)，同時(shí)需擴(kuò)大樣本量測(cè)出健康人相應(yīng)腦區(qū)平衡比值的參考范圍，與某些疾病進(jìn)行比較，可能為該疾病的早期診斷提供幫助。

任務(wù)引起的Glu、Glx與GABA濃度相關(guān)性研究文獻(xiàn)非常少，研究結(jié)果尚無(wú)定論，其機(jī)制分析少且存在分歧，有些研究者認(rèn)為可能與刺激時(shí)的生理狀態(tài)[26]或任務(wù)負(fù)荷程度[27]等相關(guān)，目前研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)活動(dòng)時(shí)腦皮質(zhì)回路特定神經(jīng)元接收大約相等數(shù)量的興奮和抑制信息，這些信息動(dòng)態(tài)、精準(zhǔn)相互抵消，誘發(fā)感覺電位和維持神經(jīng)活動(dòng)[8,28]，是大腦精確定時(shí)以及防止過度興奮的關(guān)鍵；本研究發(fā)現(xiàn)手針組針刺時(shí)各亞組Glu+和或Glx+與GABA+，并多呈正相關(guān)（P均＜0.05），而BOLD正、零激活時(shí)GABA+濃度增加，負(fù)激活時(shí)GABA+降低，驗(yàn)證了腦皮質(zhì)回路理論，并推測(cè)針刺健康人Glu+、Glx+與GABA+濃度變化與BOLD激活狀態(tài)有關(guān)，這可能取決于個(gè)體對(duì)刺激敏感度與刺激量；如某個(gè)固定刺激量，對(duì)一些個(gè)體表現(xiàn)為正激活，同時(shí)興奮和抑制遞質(zhì)濃度均增加；對(duì)另一些個(gè)體表現(xiàn)為負(fù)激活，同時(shí)興奮性遞質(zhì)濃度增加，抑制性遞質(zhì)濃度減少，但抑制性遞質(zhì)減少是因?yàn)榕d奮性與抑制性遞質(zhì)相互抵消還是因?yàn)楣劝彼崦擊让福℅AD-67）活性降低所致，仍需進(jìn)一步研究。

本研究的局限性：首先本研究以皮邊緣葉-旁邊緣葉-新皮層網(wǎng)絡(luò)中負(fù)范圍更廣、強(qiáng)度值更大前額葉內(nèi)側(cè)皮層為感興趣區(qū)，故正、零激活亞組數(shù)量較少，研究結(jié)果可能存在偏倚；其次缺乏對(duì)手針刺激量的定量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)沒有考慮到針刺的個(gè)體差異性以及穴位的雙向調(diào)節(jié)作用；最后未涉與疾病狀態(tài)下對(duì)比研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)手針針刺健康人合谷穴前、后前額葉Glu和GABA存在相關(guān)性，可作為針刺腦機(jī)制研究的重要參考指標(biāo)，有可能為相關(guān)疾病的早期診斷提供幫助。