李威 王婷 張紅蕾

胃癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。目前，胃癌主要采用手術(shù)聯(lián)合放療、化療和靶向治療等現(xiàn)代治療策略，但仍存在療效低、毒性大、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高等缺點(diǎn)。因此，研究胃癌進(jìn)展的機(jī)制，確定有效的藥物或治療靶點(diǎn)具有重要意義。鳳尾草總黃酮是從鳳尾蕨科、鳳尾蕨屬植物Pteris multifida Poir中提取的有效活性成分，近年研究表明鳳尾草總黃酮對(duì)多種癌癥具有顯著的抗腫瘤活性[2]。如鳳尾草總黃酮可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和腫瘤形成，抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲[2,3]。然而，鳳尾草總黃酮在胃癌中的抗癌功能未見(jiàn)報(bào)道。微小RNA(miRNA)是單鏈、內(nèi)源性RNA轉(zhuǎn)錄本，其通過(guò)與靶向mRNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解和翻譯抑制，參與多項(xiàng)細(xì)胞活動(dòng)[4]。目前，多種miRNA已被證實(shí)在胃癌中表達(dá)失調(diào)，參與胃癌發(fā)生和進(jìn)展[5]。miR-1274a在胃癌中表達(dá)上調(diào)，并直接靶向叉頭轉(zhuǎn)錄因子4(FOXO4)加速胃癌細(xì)胞增殖和遷移[6]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示鳳尾草總黃酮能夠下調(diào)胃癌細(xì)胞中miR-1274a表達(dá)水平。因此，本研究假設(shè)鳳尾草總黃酮通過(guò)下調(diào)miR-1274a在胃癌中發(fā)揮抗癌作用，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，為開(kāi)發(fā)鳳尾草總黃酮為新型抗胃癌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人胃癌細(xì)胞AGS、Ham’s F-12培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購(gòu)于武漢普諾賽生命科學(xué)公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miRNA模擬物(mimics)、miRNA抑制物(anti-miRNA)購(gòu)自廣州銳博生物公司；鳳尾草由我院中藥房提供；Transwell板(24孔)購(gòu)自美國(guó)Corning公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(A0208)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)兔源多克隆抗體(AF0234)、MMP-9兔源多克隆抗體(AF5234)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔源單克隆抗體(AF1186)、TRIzol試劑購(gòu)自上海碧云天生物研究所；Mir-X miRNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II購(gòu)自大連Takara生物公司。

1.2 方法

1.2.1 鳳尾草總黃酮制備[3]:將200 g鳳尾草粉碎，按照料液比1∶120加入70%乙醇溶液，60℃條件下提取2次，2 h/次。合并提取液，經(jīng)凍干得固體4.0 g，溶解于400 ml磷酸鹽緩沖液中，15 000 r/min速度離心15 min，離心3次，收集上清液，0.22 mm濾膜過(guò)濾除菌后保存于4℃冰箱。以蘆丁為對(duì)照測(cè)定總黃酮含量，溶液配制成總黃酮含量為10 mg/ml保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):AGS細(xì)胞接種含有Ham’s F-12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗)的培養(yǎng)皿中置于含95%空氣、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞鋪板率約80%時(shí)胰酶消化1∶3傳代，換液頻率為2～3次/周。選擇第5代對(duì)數(shù)期AGS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組:將AGS細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種24孔板，當(dāng)細(xì)胞鋪板率約50%時(shí)分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-1274a、miR-1274a mimics、miR-NC至AGS細(xì)胞中，具體步驟參照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染48 h收獲AGS細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)miR-1274a的相對(duì)水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。用含0、5、10、20 g/L鳳尾草總黃酮[3]的培養(yǎng)液孵育AGS細(xì)胞，記為對(duì)照組、鳳尾草總黃酮-低組、鳳尾草總黃酮-中組、鳳尾草總黃酮-高組。轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的AGS細(xì)胞記為anti-miR-NC組；轉(zhuǎn)染anti-miR-1274a的AGS細(xì)胞記為anti-miR-1274a組；用含20 g/L鳳尾草總黃酮的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染miR-1274a mimics、轉(zhuǎn)染miR-NC的AGS細(xì)胞，分別記為鳳尾草總黃酮+miR-NC組、鳳尾草總黃酮+miR-1274a組。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖:將未轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-1274a、miR-1274a mimics、miR-NC的AGS均以5×103個(gè)/孔密度接種96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。按照實(shí)驗(yàn)分組用含對(duì)應(yīng)濃度鳳尾草總黃酮的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48 h。更換為新鮮培養(yǎng)液，加入MTT溶液(20 μl)孵育4 h，加入二甲基亞砜(150 μl)反應(yīng)15 min，低速振蕩溶解結(jié)晶。酶標(biāo)儀在490 nm測(cè)量吸光度(A)。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成:胰酶消化各組AGS細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。每組取300個(gè)AGS細(xì)胞接種6孔板，轉(zhuǎn)動(dòng)平板使細(xì)胞均勻分散。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將6孔板放入含95%空氣、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育12～14 d，當(dāng)6孔板中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定細(xì)胞克隆，0.1%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移:每組取1×104個(gè)AGS細(xì)胞接種6孔板，放入含95%空氣、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞鋪板6孔板底。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用200 μl移液吸頭尖端垂直6孔板直接劃傷單層細(xì)胞。洗去細(xì)胞碎片，加入無(wú)血清培養(yǎng)基置，放入含95%空氣、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在初始培養(yǎng)時(shí)和培養(yǎng)24 h時(shí)用顯微鏡拍照，ImageJ測(cè)量初始劃痕距離和24 h劃痕距離。劃痕愈合率(%)=(初始劃痕距離-24 h劃痕距離)/初始劃痕距離×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲：將各組AGS細(xì)胞重懸在無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml。向包被基質(zhì)膠的Transwell裝置上室加入200 μl 細(xì)胞懸液，向下室加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)平行。放入含95%空氣、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell裝置，擦去上室基質(zhì)膠和殘留的細(xì)胞。4%多聚甲醛固定侵襲細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色。將Transwell小室倒置在在顯微鏡下拍照，隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)，用平均值表示AGS細(xì)胞侵襲數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá):RIPA裂解液提取AGS細(xì)胞總蛋白。定量后，設(shè)置電壓100 V，時(shí)間90 min進(jìn)行SDS-PAGE。每組設(shè)置3個(gè)平行。設(shè)置電流300 mA、電流30 min進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜。取出硝酸纖維素(NC)膜，放入含5%脫脂奶粉的孵育盒中封閉2 h。取出NC膜，放入一抗稀釋液中室溫孵育2 h。取出NC膜，放入二抗稀釋液(1∶3 000)室溫反應(yīng)1 h?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒顯色。Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，將GAPDH作為參照，對(duì)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。MMP-2抗體按照體積比1∶1 000稀釋?zhuān)琈MP9抗體和二抗按照體積比1∶1 500稀釋?zhuān)珿APDH抗體按照體積比1∶2 000稀釋。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 RT-qPCR檢測(cè)miR-1274a表達(dá):使用TRIzol試劑從各組AGS細(xì)胞中提取RNA，NanoDrop 1000分光光度計(jì)法評(píng)估提取RNA的濃度和質(zhì)量(A260/A280值1.8～2.0為合格)。Mir-X miRNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，然后采用SYBR Premix Ex Taq II進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)miR-1274a表達(dá)。每組設(shè)置3個(gè)平行。將U6作為參照，2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-1274a的相對(duì)水平。miR-1274a上游引物5’-GCCGAGTTCAGGTCCCT

GTT-3’，miR-1274a下游引物5’-CTCAACTGGTGTCG

TG GA-3’；U6上游引物5’-GCGCGTCGTGAAGCGTT

C-3’，U6下游引物5’-GTGCAGGGTC CG AGGT-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 鳳尾草總黃酮對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，鳳尾草總黃酮(低、中、高)組AGS細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 鳳尾草總黃酮對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響

2.2 鳳尾草總黃酮對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與對(duì)照組比較，鳳尾草總黃酮(低、中、高)組AGS細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲數(shù)以及MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 鳳尾草總黃酮對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 鳳尾草總黃酮對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移侵襲的影響

2.3 鳳尾草總黃酮對(duì)胃癌AGS細(xì)胞miR-1274a表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，鳳尾草總黃酮(低、中、高)組AGS細(xì)胞miR-1274a相對(duì)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 鳳尾草總黃酮對(duì)胃癌AGS細(xì)胞miR-1274a表達(dá)的影響

2.4 干擾miR-1274a表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 anti-miR-1274a組AGS細(xì)胞中miR-1274a相對(duì)水平低于anti-miR-NC組(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染anti-miR-1274a可抑制miR-1274a表達(dá)。與anti-miR-NC組比較，anti-miR-1274a組AGS細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)以及MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表4，圖2。

表4 干擾miR-1274a表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖2 干擾miR-1274a表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 過(guò)表達(dá)miR-1274a逆轉(zhuǎn)了鳳尾草總黃酮(20 g/L)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 與鳳尾草總黃酮+miR-NC組比較，鳳尾草總黃酮+miR-1274a組AGS細(xì)胞miR-1274a相對(duì)水平、克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)以及MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，增殖抑制率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表5。

圖3 過(guò)表達(dá)miR-1274a逆轉(zhuǎn)了鳳尾草總黃酮對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

表5 過(guò)表達(dá)miR-1274a逆轉(zhuǎn)了鳳尾草總黃酮對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

3 討論

中藥天然產(chǎn)物具有生物活性廣泛、低毒、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，已成為新型抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的巨大寶庫(kù)[7]。已有的研究表明鳳尾草總黃酮在多種癌癥中具有抗癌活性，如鳳尾草總黃酮可以改善荷瘤小鼠免疫功能，增強(qiáng)其抗氧化能力，抑制小鼠移植瘤H22的生長(zhǎng)[8]。鳳尾草總黃酮可以降低肺癌和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力[9,10]。本研究評(píng)估了鳳尾草總黃酮對(duì)胃癌細(xì)胞的體外抗腫瘤作用。

本研究中，MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鳳尾草總黃酮明顯抑制胃癌細(xì)胞AGS增殖能力；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明，鳳尾草總黃酮還可降低AGS遷移和侵襲能力；此外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，鳳尾草總黃酮對(duì)AGS細(xì)胞的抗增殖、抗遷移和抗侵襲功能具有顯著的劑量依賴(lài)關(guān)系。國(guó)外的一項(xiàng)研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)連續(xù)、多步驟的過(guò)程，其中MMPs可降解細(xì)胞外機(jī)制中膠原、明膠、纖連蛋白等多種成分，在癌癥轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[11]。既往研究表明胃癌組織中MMP-2和MMP-9的高表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴浸潤(rùn)密切相關(guān)，下調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力[12]。本研究結(jié)果表明，鳳尾草總黃酮以劑量依賴(lài)方式降低MMP-2和MMP-9表達(dá)，這進(jìn)一步證實(shí)鳳尾草總黃酮對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲抑制作用。因此，鳳尾草總黃酮有可能成為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的化療抑制劑。

miRNA失調(diào)在胃癌等許多類(lèi)型癌癥中起著至關(guān)重要的作用，其差異表達(dá)能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為。研究顯示，前列腺癌、結(jié)腸癌中miR-1274a表達(dá)上調(diào)，miR-1274a高表達(dá)與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)和TNM分期相關(guān)相關(guān)，并預(yù)示結(jié)腸癌患者總體生存期較差，抑制miR-1274a表達(dá)可降低結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性潛能[13,14]。在透明腎細(xì)胞癌中抑制miR-1274a表達(dá)顯著抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。然而，miR-1274a在骨肉瘤miR-1274a表達(dá)降低，并促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，這種差異可能與miR-1274a的組織特異表達(dá)模式相關(guān)[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，鳳尾草總黃酮顯著降低AGS細(xì)胞中miR-1274a表達(dá)水平，提示鳳尾草總黃酮可能通過(guò)調(diào)控miR-1274a發(fā)揮抗胃癌作用。體外功能驗(yàn)證表明，抑制miR-1274a表達(dá)顯著下調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)，降低AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，與鳳尾草總黃酮的抗胃癌作用類(lèi)似?；貜?fù)實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)miR-1274a能夠減弱鳳尾草總黃酮對(duì)AGS細(xì)胞惡性行為的抑制作用，這進(jìn)一步證實(shí)鳳尾草總黃酮至少通過(guò)下調(diào)miR-1274a在胃癌中發(fā)揮抗癌作用。然而，miR-1274a的下游靶點(diǎn)需要在未來(lái)的研究中進(jìn)一步闡明和證實(shí)。

綜上所述，鳳尾草總黃酮對(duì)胃癌細(xì)胞具有抗增殖、抗遷移和抗侵襲作用，其機(jī)制與下調(diào)miR-1274a表達(dá)有關(guān)，表明鳳尾草總黃酮在胃癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。