楊書彬，柳嘉欣，趙金榮，蘇虹嬋，孫健，王毅(通信作者)

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)(黑龍江 哈爾濱 150040)； 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心(北京 100010)

支氣管炎是指氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的非特異性炎癥。臨床以反復(fù)咳、喘及多痰為特點(diǎn)。其發(fā)病率高，難以醫(yī)治，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常以抗感染、抗過敏為主，愈后效果不佳，往往反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重危害人類的健康[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為，支氣管炎屬于“咳嗽”“痰證”“喘證”的一類病癥[2]，與痰熱郁肺癥、風(fēng)寒襲肺癥、風(fēng)熱犯肺癥以及氣陰兩虛證等辨證分型有關(guān)[3]。中醫(yī)以清熱解表、宣肺止咳作為治療原則，臨床中收到滿意治療效果。

痰熱清注射液是經(jīng)典的治療呼吸道炎癥的中藥方劑，包含黃芩、熊膽粉、連翹等中藥，是在“雙黃連”和“清開靈”兩種清熱解毒藥物基礎(chǔ)上優(yōu)化而成?？赏ㄟ^改善患者“風(fēng)溫肺熱”病中的喘、咳、熱等痰熱郁肺癥狀，進(jìn)而起到治療支氣管炎的作用。目前，臨床已證明痰熱清注射液對(duì)急慢性支氣管炎都有很好的療效[4-7]，但由于其有效成分復(fù)雜，其目前作用機(jī)制尚不清楚，很難對(duì)其從整體到分子水平系統(tǒng)全面地認(rèn)識(shí)該藥，因此一定程度上影響其臨床療效的發(fā)揮。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理、計(jì)算機(jī)技術(shù)為基礎(chǔ)，以“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物-多層次、多角度”為核心的分析方法，應(yīng)用于中藥分子機(jī)制研究具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[8]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，闡明痰熱清注射液有效成分治療支氣管炎的作用機(jī)制，以期為痰熱清注射液抗支氣管炎的中醫(yī)理論提供現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)來源與方法

1.1 痰熱清注射液成分的確定

根據(jù)對(duì)文獻(xiàn)[9-11]的數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，痰熱清注射液為經(jīng)典治療肺病的中藥方劑，其主要成分包含連翹酯苷E(ForsythosideE)、綠原酸(ChlorogenicAcid)、新綠原酸(NeochlorogenicAcid)、隱綠原酸(CryptochlorogenicAcid)、咖啡酸(CaffeicAcid)、野黃芩苷(Scutellarin)、木犀草苷(Luteoloside)、馬錢苷(Loganin)、斷氧化馬錢子苷(Secoxyloganin)、異綠原酸A(3,5-Dicaffeoylquinicacid)、異綠原酸B(4,5-Dicaffeoylquinicacid)、異綠原酸C(3,4-Dicaffeoylquinicacid)、黃芩苷(Baicalin)、千層紙素-7-o-β-葡萄糖醛酸苷(OroxylinAGlucoronide)、白楊素-7-o-β-葡萄糖醛酸苷(Chrysin-7-o-D-glucoronide)、漢黃芩苷(Oroxindin)、膽酸(CholicAcid)、熊去氧膽酸(UrsodeoxycholicAcid)、鵝去氧膽酸(ChenodeoxycholicAcid)、漢黃芩素(Wogonin)，總共20個(gè)成分。

1.2 痰熱清注射液成分靶點(diǎn)分析

本文利用STITCH作為一個(gè)重要的基因與化學(xué)相似度數(shù)據(jù)庫(kù)，用于確定痰熱清注射液中的主要化學(xué)成分，STITCH是一個(gè)用于預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)與遺傳的交互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括Durg Bank、GLIDA、Matador等人工標(biāo)注的資料庫(kù)，還有KEGG、PID等通路途徑的資料庫(kù)、CHEMBL、PDSPKi等都是數(shù)據(jù)主要來源。其中每個(gè)化合物與蛋白互作關(guān)系都對(duì)應(yīng)一個(gè)分值，代表其相互作用概率或結(jié)合親和力，此外還提供與目標(biāo)藥物相似的化合物及相似分?jǐn)?shù)。首先，在STITCH(V5.0)數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入1.1項(xiàng)中各成分英文名并選擇好種屬“Homo spaiens”并提交。然后，將結(jié)果中“minimum required interaction score”可靠分?jǐn)?shù)設(shè)置成0.7(高可信度)，其他參數(shù)默認(rèn)，以此獲得符合要求的靶點(diǎn)。

1.3 支氣管炎靶點(diǎn)分析

本研究采用5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)搜集，分別是TTD、DigSee、pharmGKB、OMIM、GAD，探究疾病與靶點(diǎn)的關(guān)系。TTD數(shù)據(jù)庫(kù)是全球第一個(gè)提供免費(fèi)藥物靶標(biāo)信息的在線平臺(tái)，提供目前已知或者處于探索階段的、具有治療價(jià)值的蛋白或核酸靶點(diǎn)的相關(guān)信息，包括靶點(diǎn)相關(guān)疾病。介導(dǎo)生物學(xué)通路信息，作用靶點(diǎn)的藥物信息。將獲得的蛋白名稱經(jīng)uniprot轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因名稱，由數(shù)據(jù)庫(kù)TTD(update by 2015)在“Search drugs and targets by disease or ICD identifier”中輸入該疾病的英文名稱；DigSee是一種涉及到生物活動(dòng)的基因，該數(shù)據(jù)庫(kù)中包含了各種疾病和重大生物事件，如基因表達(dá)、點(diǎn)突變等。在數(shù)據(jù)庫(kù)DigSee(v2.01)中“disease”搜索框搜索疾病并篩選score≥0.7收集靶點(diǎn)；pharmGKB是藥物基因組學(xué)信息的中央知識(shí)庫(kù)，藥物劑量指南、藥物以藥物為中心的途徑以及基因、藥物和疾病之間的關(guān)系等過程都包含在內(nèi)。pharmGKB搜索疾病得到相應(yīng)文章并收集靶點(diǎn)；在提供相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的OMIM(Updated 2018)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索疾病并只收集“*”條目里的靶點(diǎn)，“*”代表的是一個(gè)基因；GAD(暫停更新)搜索疾病獲得相應(yīng)靶點(diǎn)。以上疾病所用的英文關(guān)鍵詞為“bronchitis”。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在細(xì)胞過程中起到關(guān)鍵作用，清楚地描繪了基因與基因之間相互作用關(guān)系，提高了在分子水平上對(duì)蛋白質(zhì)功能的理解。為進(jìn)一步探索藥物成分與疾病靶標(biāo)之間的關(guān)系，本研究采用STRING(V10.5)數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入1.2、1.3項(xiàng)中的成分和與疾病有關(guān)的靶點(diǎn)，并將其作為“Homo spaiens”提交。在得到的“minimumrequiredinteractionscore”的可靠性得分為0.900(最高可信度)，而其它的參數(shù)默認(rèn)，進(jìn)而獲得成分與靶點(diǎn)間的互作網(wǎng)絡(luò)。

1.5 篩選核心靶點(diǎn)

Cytoscape可以用來描述大量的邊和節(jié)點(diǎn)，其中相互作用關(guān)系多的節(jié)點(diǎn)被認(rèn)為是核心靶點(diǎn)。利用軟件Cytoscape(版本3.8.2)的“merge”工具對(duì)1.4項(xiàng)下的痰熱清成分、支氣管炎的PPI網(wǎng)絡(luò)取交集，交集之后得到的靶點(diǎn)即認(rèn)為是痰熱清注射液作用于支氣管炎的核心靶點(diǎn)。

1.6 GO和KEGG富集分析

為猜測(cè)核心靶標(biāo)在生物代謝及信號(hào)通路中的作用，David平臺(tái)可以從生物通路、GO條目、蛋白-蛋白交互作用、疾病相關(guān)性等方面對(duì)輸入的基因進(jìn)行廣泛的分析。本文以David(V6.8)為基礎(chǔ)，對(duì)GO生物作用-KEGG信號(hào)途徑進(jìn)行了富集。將生成的核心靶點(diǎn)以“gene symbol”的形式上傳，并選取對(duì)應(yīng)“Homo spaiens”的背景，按照P-Value值，對(duì)富集的生物學(xué)進(jìn)程和信號(hào)路徑的結(jié)果進(jìn)行排序(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 藥物成分及靶點(diǎn)分析

通過對(duì)痰熱清注射液成分進(jìn)行了靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，獲得了10種滿足指標(biāo)的成分，其中包括膽汁酸、有機(jī)酸、類黃酮、環(huán)烯醚萜。其中膽汁酸類成分3個(gè)：膽酸124個(gè)、鵝去氧膽酸123個(gè)、熊去氧膽酸38個(gè)；有機(jī)酸類成分2個(gè)：咖啡酸20個(gè)、綠原酸10個(gè)靶點(diǎn)；黃酮類成分4個(gè)：黃芩苷23個(gè)、漢黃芩素18個(gè)、野黃芩苷4個(gè)、木犀草苷3個(gè)；環(huán)烯醚萜類成分1個(gè)：馬錢苷1個(gè)。整合得到相應(yīng)靶點(diǎn)共230個(gè)。結(jié)果見圖1。

圖1 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2 支氣管炎及靶點(diǎn)分析

通過對(duì)TTD、DigSee、pharmGKB、OMIM、GAD五個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)獲得靶點(diǎn)進(jìn)行整合，共得到支氣管炎相關(guān)靶點(diǎn)47個(gè)，其中TTD得到6個(gè)靶點(diǎn)、DigSee得到24個(gè)、pharmGKB得到1個(gè)、OMIM得到9個(gè)、GAD得到8個(gè)。具體結(jié)果見表1。

表1 支氣管炎相關(guān)靶點(diǎn)

2.3 痰熱清注射液成分、支氣管炎靶點(diǎn)PPI結(jié)果

痰熱清注射液成分靶點(diǎn)經(jīng)PPI構(gòu)建后共得到730個(gè)靶點(diǎn)，11307條邊，其中間接靶點(diǎn)有500個(gè)，結(jié)果見圖2；支氣管炎靶點(diǎn)經(jīng)PPI構(gòu)建后共得到543個(gè)靶點(diǎn)，7488條邊，其中間接靶點(diǎn)有496個(gè)，結(jié)果見圖3。圖中紅色節(jié)點(diǎn)是輸入的痰熱清的成分，支氣管炎靶點(diǎn)即直接靶點(diǎn)，綠色是預(yù)測(cè)出的相互作用間接靶點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)大小與其degree值成正比。

圖2 成分靶點(diǎn)的ppi網(wǎng)絡(luò) 圖3 支氣管炎靶點(diǎn)ppi網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心靶點(diǎn)結(jié)果

通過PPI網(wǎng)絡(luò)對(duì)成分、疾病靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，最終獲得171個(gè)靶點(diǎn)。其中包含炎癥因子包括白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)IL6、IL8等和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)。以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF2)，表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)，趨化因子受體(C-C chemokine receptor，CCR)CCR1、CCR2等，血清白蛋白(Serum albumin，ALB)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，KDR)等主要與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等參與支氣管炎的發(fā)生發(fā)展。具體網(wǎng)絡(luò)結(jié)果見圖4。該圖中色彩的深度與結(jié)點(diǎn)的Degree值的大小是成比例的。

圖4 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO和KEGG富集分析

GO生物過程Top30結(jié)果如圖5所示。其中包括MAPK級(jí)聯(lián)、炎癥反應(yīng)、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性、一氧化氮的合成等。KEGG信號(hào)通路Top30，如圖6所示。信號(hào)通路主要有：TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等。在該圖中，縱軸線為項(xiàng)目名，橫軸為“Rich factor”：在不同表達(dá)基因中，該項(xiàng)目的基因數(shù)量與被標(biāo)注的基因總數(shù)之比。圓點(diǎn)顏色越紅代表差異性與顯著，大小代表基因數(shù)目。

圖5 生物過程(GO)氣泡圖

圖6 信號(hào)通路(KEGG)氣泡圖

3 討論

支氣管炎的主要病理變化表現(xiàn)為腺體增生，黏膜上皮細(xì)胞變化和支氣管壁之間的改變。分泌功能的亢進(jìn)，有關(guān)指標(biāo)的增加提示炎癥的產(chǎn)生，由于炎癥的反復(fù)發(fā)作致使支氣管細(xì)胞壁伴有充血，水腫甚至是纖維的增生。核心機(jī)制為炎癥反應(yīng)、黏液高分泌、氣道表面脫水或重塑，各環(huán)節(jié)間互相聯(lián)系[12]。

本研究通過對(duì)成分靶點(diǎn)和支氣管炎的171個(gè)核心靶點(diǎn)的GO富集和KEGG通路富集分析顯示，痰熱清注射液-支氣管炎相互作用關(guān)系離不開這些細(xì)胞因子的調(diào)控，如炎癥因子，TNF，EGF，F(xiàn)GF，CCR1，CCR2，ALB，KDR等，以及這些信號(hào)通路，包括炎癥反應(yīng)，趨化因子信號(hào)，T細(xì)胞，MAPK級(jí)聯(lián)，NF-kB通路。其中5個(gè)靶點(diǎn)是痰熱清成分直接作用于支氣管炎的，分別是黃芩苷、木犀草苷和熊去氧膽酸的共同靶點(diǎn)一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase，NOS2)；黃芩苷的EGF和細(xì)胞色素P450 2E1(CytochromeP450 2E1, CYP2E1)；熊去氧膽酸的白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1beta, IL-1β)；鵝去氧膽酸的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(Cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator，CFTR)。由此可見，炎癥反應(yīng)是支氣管發(fā)生必經(jīng)的反應(yīng)，而痰熱清注射液中的有效成分恰好作用于此。NOS2能夠產(chǎn)生NO，NO具有雙重作用，一方面能增強(qiáng)炎癥表達(dá)，加重組織損傷[13]，另一方面NO具有舒張血管,有利于肺組織重建的作用[14]。有研究表明，在急性毛性支氣管炎患兒中NO含量明顯高于緩解期，提示NO在毛性支氣管炎患兒中有作用[15]。EGF可在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，促進(jìn)不同的表皮及上皮組織的生長(zhǎng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖[16]。EGF及其受體在支氣管炎患者的治病意義被得到充分證明[17]。EGF和IL-1β引發(fā)的炎癥反應(yīng)及變態(tài)反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用[18]。CYP2E1可以將藥物等代謝為活性代謝物，研究發(fā)現(xiàn)CYP2E1的多態(tài)性變異與兒童復(fù)發(fā)性肺炎相關(guān)[19]。IL-1β誘導(dǎo)前列腺素合成，中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞活化，B細(xì)胞活化和抗體產(chǎn)生，以及成纖維細(xì)胞增殖和膠原產(chǎn)生，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)[20]。有證據(jù)表明IL-1β和TNF-α?xí)碳ぞ奘杉?xì)胞并刺激支氣管上皮細(xì)胞，EGF的表達(dá)增加發(fā)生在慢性支氣管炎患者身上[21]。CFTR在上皮離子、水轉(zhuǎn)運(yùn)和液體穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起重要作用，吸煙可以抑制CFTR表達(dá)，CFTR功能障礙與慢性支氣管炎和呼吸困難獨(dú)立相關(guān)[22-23]。

T淋巴細(xì)胞是慢性支氣管炎的主要?dú)獾兰?xì)胞，其發(fā)生時(shí)，氣道內(nèi)的嗜酸粒細(xì)胞會(huì)增多，并能聚集嗜酸白細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞進(jìn)入氣道[24]。MAPK信號(hào)通路在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)方面起著重要作用[25]，其中富集的核心靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)在炎癥發(fā)生發(fā)展方面具有重要作用[26]。在吸煙誘導(dǎo)的慢性支氣管炎的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，TGF-β信號(hào)通路的抑制可以預(yù)防慢性支氣管炎引起的氣道炎癥[27]。NF-κB是一種重要的炎癥反應(yīng)活性物質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中起中心作用，通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖[28-29]。TNF主要由巨噬細(xì)胞分泌并參與炎癥反應(yīng)，在某些條件下它可以刺激細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞分化[30]。嚴(yán)重的急性毛細(xì)支氣管炎癥病例中表現(xiàn)出高TNF-α值，在許多文獻(xiàn)中都能證明這一點(diǎn)[31]。

支氣管炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，痰熱清注射液可能在調(diào)節(jié)支氣管炎癥的發(fā)生、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫過程中起著重要作用。未來的研究重點(diǎn)可能在于闡明各參與因素之間的關(guān)系并深入到基因?qū)用?。本研究正是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究痰熱清注射液對(duì)支氣管炎作用的分子機(jī)制，為其繼續(xù)深入研究提供思路和方向。