江 山 戴 曦 楊小瓊 藍(lán) 楠

1 都江堰市人民醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科(成都 611830)

2 西南醫(yī)科大學(xué)呼吸與危重醫(yī)學(xué)科(瀘州 646000)

肺癌是全球最致命的惡性腫瘤之一，可分為兩種主要類型：小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)。NSCLC占肺癌病例約85%，取決于發(fā)病和組織學(xué)形態(tài)，主要分為肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma of lung，LUSC)[1- 3]。當(dāng)前許多治療方法用于治療肺癌，例如手術(shù)切除、化學(xué)療法、放射療法靶向療法和免疫療法。早期肺癌患者往往經(jīng)歷手術(shù)切除，對于晚期病人，其腫瘤不能被手術(shù)切除，靶向療法或免疫療法聯(lián)合化療已被選定作為最好的治療方式之一[4- 5]。近年來，靶向療法已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，并且已經(jīng)確定了一些有效的分子靶標(biāo)，例如表皮生長因子受體和間變性淋巴瘤激酶。已經(jīng)證實(shí)這些靶點(diǎn)在肺腺癌中是成功的，但不是在肺鱗狀細(xì)胞癌，因?yàn)檫@兩個主要的亞型有不同的突變譜[6- 8]。

因此，為了更好地診斷和治療LUSC患者，需要對新型生物標(biāo)志物進(jìn)行研究。LUSC占NSCLC病例的30%，在中老年男性中更為常見，并且轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率很高[9]。NSCLC患者在晚期大多診斷，其5年生存率比早期患者低[4，10- 11]。因此，需要進(jìn)一步研究預(yù)后標(biāo)志物達(dá)到精確治療的目的。雖然一些研究已經(jīng)報道了LUSC相關(guān)基因和預(yù)后標(biāo)記，在發(fā)病機(jī)理和LUSC的進(jìn)展的特定分子機(jī)制還沒有被系統(tǒng)地評價，這限制了早期診斷和治療[12- 13]。對參與肺癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制的深入了解可能為早期發(fā)現(xiàn)和后續(xù)臨床治療提供更有效的策略。因此，迫切需要新穎的有前途的生物標(biāo)志物或潛在的藥物治療方法。

鐵死亡是一種鐵依賴性調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡的形式，由脂質(zhì)過氧化的致死性積累所產(chǎn)生[14- 15]。近年來，鐵死亡誘導(dǎo)已成為引發(fā)癌細(xì)胞死亡的一種有前途的治療方法，特別是對于那些對傳統(tǒng)療法[16- 17]有抵抗力的惡性腫瘤。除了引起鐵死亡的誘因外，許多基因也被鑒定為鐵死亡的調(diào)節(jié)因子或標(biāo)記物。

長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNAs)被發(fā)現(xiàn)在許多重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮著廣泛的功能，包括細(xì)胞增殖和分化、基因表達(dá)的遺傳調(diào)控、RNA衰減、RNA剪接、蛋白質(zhì)折疊和microRNA(miRNA)調(diào)節(jié)[18]。lncRNAs通過調(diào)節(jié)鐵死亡參與肺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移、預(yù)后和化療耐藥[19- 22]，但這些研究集中在單個lncRNAs治療肺癌。TCGA數(shù)據(jù)庫中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)譜并沒有用于探索預(yù)測肺鱗癌預(yù)后的新的生物標(biāo)志物。因此，我們旨在利用TCGA數(shù)據(jù)庫建立鐵死亡相關(guān)lncRNA信號，并尋找新的生物標(biāo)志物來預(yù)測肺鱗癌患者的預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集和樣品提取

從癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取了有關(guān)的RNA測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)診斷為LUSC；(2)患者具有完整的lncRNA數(shù)據(jù)和臨床信息。根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，納入502例LUSC。此外，患者的完整臨床信息可從TCGA下載。在篩查臨床信息時，排除了隨訪時間少于30天的樣品。本研究涉及的數(shù)據(jù)全部來自TCGA數(shù)據(jù)庫，并嚴(yán)格遵循TCGA發(fā)布指南(http://cancergenome.nih.gov/abouttcga/policies/publicationguidelines)。

1.2 lncRNA和鐵死亡相關(guān)基因的篩選

從所有RNA-seq數(shù)據(jù)集里獲取lncRNA的概況，總RNA表達(dá)數(shù)據(jù)則通過log2轉(zhuǎn)化標(biāo)準(zhǔn)化。從以前的文獻(xiàn)檢索[23- 25]得到60 鐵死亡相關(guān)基因，然后使用皮爾遜積矩相關(guān)系數(shù)計算lncRNA與鐵死亡相關(guān)基因之間的相關(guān)，|R2|>0.3和P<0.001被認(rèn)為是鐵死亡相關(guān)的lncRNA。最后，使用Cytoscape軟件3.7.2可視化其共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 鑒定鐵死亡相關(guān)的lncRNAs

首先，通過單變量Cox回歸評估鐵死亡相關(guān)lncRNA的預(yù)后價值。在單變量分析中將P<0.05的鐵死亡相關(guān)lncRNA納入選擇因子建立Lasso回歸。然后將Lasso的結(jié)果包括在多元Cox模型中，以建立風(fēng)險評分。我們構(gòu)建了風(fēng)險分?jǐn)?shù)基于鐵死亡相關(guān)lncRNA表達(dá)水平乘以回歸系數(shù)的線性組合β：risk score=∑i=1nβi×(expression of lncRNAi)。根據(jù)中位風(fēng)險評分，將患者分為2組：高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。使用對數(shù)秩檢驗(yàn)比較2組之間的生存差異。

1.4 預(yù)后模型的建立

利用Cox回歸建立獨(dú)立的預(yù)后模型，用列線圖預(yù)測患者的生存率。應(yīng)用index-C(C指數(shù))，校準(zhǔn)曲線和ROC曲線來驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。臨床數(shù)據(jù)包括在多變量Cox回歸中，以確認(rèn)風(fēng)險評分是否是預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。

1.5 功能分析

基因集富集分析(http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)用于探究基因表達(dá)數(shù)據(jù)的功能富集。我們探索了具有預(yù)后價值的鐵死亡相關(guān)lncRNAs的功能富集，并可視化了與鐵死亡相關(guān)的前5個基因本體論(Gene Ontology，GO)和基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路。

1.6 統(tǒng)計分析

使用Kaplan-Meier方法生成生存曲線，并使用對數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。使用Cox回歸和Lasso回歸來估計鐵死亡相關(guān)的lncRNA標(biāo)志物和臨床病理數(shù)據(jù)對預(yù)后的影響。使用R語言(版本3.6)進(jìn)行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)為雙側(cè)檢驗(yàn)，P≤0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

TCGA-LUSC共鑒定出14 142個lncRNAs和19 631 個mRNA，其中59個基因在肺鱗癌中表達(dá)。構(gòu)建鐵死亡基因相關(guān)lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，最后有1 407個鐵死亡相關(guān)的lncRNAs(|R2|>0.3，P<0.001)。

2.2 鐵死亡相關(guān)lncRNA模型的構(gòu)建

根據(jù)單變量Cox結(jié)果，15個鐵死亡相關(guān)lncRNAs對肺鱗癌患者有預(yù)后價值(P<0.05)。隨后，在Lasso回歸分析后發(fā)現(xiàn)了14個鐵死亡相關(guān)的lncRNAs(圖1)。多元Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)4個lncRNAs是獨(dú)立的預(yù)后因素(圖2)。其中2個lncRNAs(LUCAT1、AC022150.2)為不良預(yù)后因素，2個lncRNA(AC253536.6和FLJ46906)為有利預(yù)后因素(表1和圖3)。這4個lncRNA被用來建立鐵死亡相關(guān)的lncRNA模型。風(fēng)險評分的公式如下：風(fēng)險評分=(-0.33598×AC253536.6)+(-0.05547×FLJ46906)+(0.17330×LUCAT1)+(0.22964×AC022150.2。

表1 基于TCGA-LUSC數(shù)據(jù)的lncRNAs多變量Cox結(jié)果

2.3 建立模型對預(yù)后的影響

風(fēng)險評分與LUSC患者的總生存率(overall survival rate，OS)顯著相關(guān)。與低風(fēng)險組相比，高風(fēng)險組的生存時間較短(P<0.001，圖4)。Cox回歸顯示LUSC患者的風(fēng)險評分對預(yù)后有顯著影響(圖5)。

2.4 鐵死亡相關(guān)lncRNA信號的臨床價值

單變量Cox回歸分析顯示，風(fēng)險評分和分期是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，風(fēng)險評分的HR為2.191(95%CI: 1.565～3.066，P<0.001，圖6A)。在多因素臨床特征中，風(fēng)險評分仍然是多變量分析中的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)(HR=2.116，95%CI=2.116，P<0.001，表2，圖6B)。ROC曲線下對應(yīng)1年、3年、5年和7年生存率的面積分別為0.600、0.646、0636和0.726(圖6C)。風(fēng)險評分、年齡、TNM分期納入列線圖。如列線圖所示，風(fēng)險評分對LUSC患者7年的預(yù)后影響最大(圖7A)。預(yù)后模型的C指數(shù)為0.763。5年生存率的AUC顯示風(fēng)險評分(0.726)具有一定的預(yù)測能力(圖7B)。風(fēng)險評分隨分期增加，表明鐵死亡相關(guān)的lncRNA信號可能與LUSC的進(jìn)展有關(guān)。

表2 應(yīng)用多元Cox回歸分析LUSC的臨床特征和危險度評分

2.5 功能分析

共獲得126個GO相關(guān)通路和3 554個KEGG相關(guān)通路。在GO分析中，鐵死亡相關(guān)的lncRNAs主要集中在生物過程中，如抗原結(jié)合、T細(xì)胞受體復(fù)合體、吞噬作用及基于免疫球蛋白家族結(jié)構(gòu)域的適應(yīng)性免疫應(yīng)答(圖8A)。此外，在KEGG途徑顯示lncRNAs主要集中在腫瘤經(jīng)典途徑和代謝途徑，例如，ECM受體相互作用、白細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)噬有關(guān)(圖8B)。

3 討 論

鐵死亡是一種由有毒脂質(zhì)過氧化集聚引起的非凋亡形式的細(xì)胞死亡方式，由 Dixon 等[26]在RAS(rat sarcoma)選擇性小分子藥物研究中提出，是一種具有鐵離子依賴性、氧化型的細(xì)胞死亡方式。鐵死亡主要聚焦于腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的發(fā)生方面。Yagoda 等[27]在 K-ras 突變的 A549 肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)鐵死亡。近年來文獻(xiàn)報道，野生型和突變型的 p53 均可以在 ROS 累積的條件下，通過抑制細(xì)胞表面氨基酸運(yùn)載蛋白的表達(dá)，阻止細(xì)胞攝取胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡[28]。

作為ncRNA的大型異質(zhì)子類，lncRNA在腫瘤發(fā)生的不同方面起著不可或缺的作用，被認(rèn)為是癌癥診斷和預(yù)后的新型生物標(biāo)志物[29]。沒有關(guān)于鐵死亡相關(guān)lncRNA信號來預(yù)測肺鱗癌患者生存的系統(tǒng)研究。因此，有必要建立鐵死亡相關(guān)的lncRNA信號，以基于大規(guī)模數(shù)據(jù)庫來預(yù)測LUSC患者的預(yù)后。

在這項(xiàng)研究中，通過構(gòu)建lncRNA和鐵死亡相關(guān)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)來篩選鐵死亡相關(guān)的lncRNA。此外，利用套索回歸和Cox回歸獲得以下4種預(yù)后鐵死亡相關(guān)的lncRNA：AC253536.6，F(xiàn)LJ46906，LUCAT1和AC022150.2。4個鐵死亡相關(guān)的lncRNAs可能是LUSC患者預(yù)后的分子標(biāo)志物和潛在的治療靶標(biāo)。目前這4個鐵死亡相關(guān)的lncRNAs未見相關(guān)研究。

基于4個鐵死亡相關(guān)的lncRNA的簽名顯著預(yù)測了LUSC患者的預(yù)后，低風(fēng)險組具有比所述高風(fēng)險組的生存時間更長。ROC曲線下對應(yīng)于7年的值為0.726。該結(jié)果表明，風(fēng)險評分在預(yù)測生存率方面具有一定潛力。單變量和多變量Cox分析均顯示該特征可以用作獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。根據(jù)C-指數(shù)，ROC曲線和校正曲線，該模型具有更好的判別力和準(zhǔn)確性，表明該模型可作為LUSC患者的潛在預(yù)測工具。

鐵死亡在抗腫瘤治療中有很大潛力，為一些藥物的臨床效用研究提供了新途徑，起到老藥新用、新藥再用的效果。但是仍有很多問題尚待研究，如鐵死亡激發(fā)機(jī)體免疫原性引發(fā)機(jī)體適應(yīng)性的具體發(fā)生分子機(jī)制目前仍不清楚;在鐵死亡發(fā)生機(jī)制中，具體哪些脂類物質(zhì)被氧化，以及在分子水平是通過何種方式與其他細(xì)胞死亡形式相互作用等問題亟待解決。對鐵死亡的深入研究有助于更充分認(rèn)識相關(guān)疾病的發(fā)生進(jìn)展機(jī)制。鐵死亡抑制劑在一定程度上能夠延緩疾病進(jìn)程，減輕患者病情，這可能作為今后基礎(chǔ)機(jī)制研究和臨床應(yīng)用的切入點(diǎn)，在腫瘤的治療和預(yù)防中發(fā)揮作用。隨著肺癌檢出率的提高，在原有的手術(shù)、化療、放療、分子靶向、免疫治療等治療基礎(chǔ)上，更多新的有效治療不斷被挖掘。

當(dāng)前的研究存在一些局限性。首先，本研究的數(shù)據(jù)來源單一，所包含的數(shù)據(jù)量不大，因此分析結(jié)果可能存在一定偏差。其次，我們的研究是一項(xiàng)回顧性研究，需要更多的前瞻性研究來證明鐵死亡相關(guān)信號的預(yù)后功能。第三，為了確保預(yù)后模型的魯棒性，我們需要在其他獨(dú)立隊(duì)列中進(jìn)一步確認(rèn)我們建立的模型的預(yù)后模型，以確保其準(zhǔn)確性。第四，應(yīng)該進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步表明預(yù)測鐵死亡相關(guān)lncRNAs效應(yīng)的潛在分子機(jī)制。

鐵死亡相關(guān)的lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)為揭示LUSC中鐵死亡相關(guān)的lncRNA功能提供了寶貴的資源。4個鐵死亡相關(guān)的lncRNA被認(rèn)為與LUSC患者的生存顯著相關(guān)。由4個鐵死亡相關(guān)lncRNA組成的鐵死亡相關(guān)lncRNA標(biāo)記用于區(qū)分處于不同風(fēng)險的患者，它是LUSC患者的顯著獨(dú)立因素。因此，4種鐵死亡相關(guān)的lncRNAs及其標(biāo)記可能是LUSC患者的分子生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。