馮文偉，葉健烽，呂洪雪，周智慧，陳麗萍，葉小漢

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 東莞 523808）

目前，動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病（arteriosclerotic cardiovascular disease）的發(fā)病率和死亡率仍不斷增長(zhǎng)，已經(jīng)成為全球死亡的首位原因[1-2]。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis）已被證實(shí)是一種慢性炎癥性的動(dòng)脈血管壁的脂肪病變，是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)病的重要病理生理基礎(chǔ)[3]。他汀類(lèi)藥物是治療動(dòng)脈粥樣硬化的主要藥物，但仍難以有效終止動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。

動(dòng)脈粥樣硬化屬于中醫(yī)學(xué)“脈痹”范疇。本課題組前期研究提出痰濁、瘀血是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵病理因素，廣東省名中醫(yī)葉小漢主任醫(yī)師結(jié)合嶺南地區(qū)特點(diǎn)對(duì)鱉甲煎丸進(jìn)行加減，衍生了心脈康方[4]。心脈康方有化痰消積、軟堅(jiān)散結(jié)的功效，前期臨床研究表明，其能改善冠心病患者的癥狀、炎癥指標(biāo)及血脂水平[5-6]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，心脈康方能抑制新西蘭兔粥樣硬化斑塊形成，下調(diào)白細(xì)胞介素6（IL-6）和白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等炎癥因子和Toll樣受體4（TLR4）的表達(dá)[7-8]，但其具體分子機(jī)制仍不明確。有研究[9]表明，TLR4/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡在調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中起重要的作用。本研究旨在進(jìn)一步探討心脈康方通過(guò)抑制TLR4/NLRP3介導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的改善作用，以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞J774A.1小鼠單核巨噬細(xì)胞（來(lái)源于BABL/cN小鼠），由廣州吉妮歐生物科技有限公司提供。

1.2 藥物、試劑與儀器心脈康方由醋鱉甲15 g、枳實(shí)12 g、三棱10 g、膽南星6 g、醋莪術(shù)10 g、生牡蠣30 g、黨參15 g、地龍10 g組成，中藥材由廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院中藥房提供；阿托伐他汀鈣片（樂(lè)普制藥科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：202004105C）。胎牛血清、青霉素和鏈霉素（美國(guó)Hyclone公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（廣州吉妮歐生物科技有限公司）；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）試劑（北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司）；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游離膽固醇（FC）及膽固醇酯（CE）等檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；油紅O染色液和碘化丙啶（PI）染色液（北京索萊寶科技有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒（沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司）；兔抗IL-1β抗體和兔抗GAPDH抗體（美國(guó)Abcam公司）；兔抗TLR4、NLRP3、含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白（ASC）、白細(xì)胞介素18（IL-18）、消皮素D-N端（GSDMD-N）、半胱氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）等抗體和辣根過(guò)氧 化 物 酶（HRP）標(biāo) 記 的 山 羊 抗 兔IgG（H+L）（Affinity，中國(guó)）；TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑盒（TaKaRa，中國(guó)）。Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；BX53M倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；CFX96 qPCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 含藥血清制備將18只SD大鼠（體質(zhì)量約200 g）隨機(jī)分為空白組、心脈康方組和阿托伐他汀組，每組6只。根據(jù)70 kg成人每日口服用藥的臨床推薦劑量，按照成人與大鼠的等效劑量換算系數(shù)折算成大鼠灌胃給藥劑量，心脈康方組給予心脈康方9.72 g·kg-1·d-1灌胃，阿托伐他汀組給予1.80 mg·kg-1·d-1[10]灌胃，空白組給予等體積生理鹽水灌胃，每12 h 1次，連續(xù)灌胃7 d。末次給藥后1 h，無(wú)菌取血制備含藥血清。經(jīng)56℃滅活30 min后，凍存管分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時(shí)以DMEM培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)J774A.1巨噬細(xì)胞。加藥前1 d，以2×105/孔細(xì)胞接種到6孔板中，分組：對(duì)照組（10%胎牛血清），ox-LDL組（100 μg·mL-1ox-LDL[11]），阿托伐他汀組（100 μg·mL-1ox-LDL+10%阿托伐他汀含藥血清），心脈康方低濃度組（100 μg·mL-1ox-LDL+5%心脈康方含藥血清），心脈康方中濃度組（100 μg·mL-1ox-LDL+10%心脈康方含藥血清），心脈康方高濃度組（100 μg·mL-1ox-LDL+20%心脈康方含藥血清）。阿托伐他汀和不同濃度的心脈康方含藥血清分別與100 μg·mL-1ox-LDL共同處理J774A.1巨噬細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞沉淀和培養(yǎng)上清液。

繼而進(jìn)行恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（10%胎牛血清）、ox-LDL組（100 μg·mL-1ox-LDL）、心脈康方組（100 μg·mL-1ox-LDL+20%心脈康方含藥血清）、阿托伐他汀組（100 μg·mL-1ox-LDL+10%阿托伐他汀含藥血清）、心脈康方+TLR4組（100 μg·mL-1ox-LDL+20%心脈康方含藥血清+2 μg·mL-1TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒[12]）、阿托伐他汀+TLR4組（100 μg·mL-1ox-LDL+10%阿托伐他汀含藥血清+2 μg·mL-1TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒）。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 脂質(zhì)檢測(cè)藥物處理方法同“1.4”項(xiàng)。收集細(xì)胞沉淀，用超聲波破碎儀裂解細(xì)胞，以400g離心5 min后，收集上清液。用TC、TG、FC檢測(cè)試劑盒檢測(cè)TC、TG、FC以及CE（CE=TC-FC）的水平，評(píng)估細(xì)胞中脂質(zhì)累積情況。

1.5.2 qPCR法檢測(cè)細(xì)胞焦亡通路相關(guān)信號(hào)分子的基因表達(dá)藥物處理方法同“1.4”項(xiàng)。收集細(xì)胞沉淀，采用TRIzol提取總RNA，并將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。qPCR反應(yīng)程序：熱變性95℃2 min，進(jìn)入循環(huán)，95℃15 s，60℃30 s，反應(yīng)45個(gè)循環(huán)后退出，進(jìn)入溶解曲線(xiàn)60~95℃。采用2-ΔΔCt方法分析目的基因表達(dá)量。TLR4、NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β及β-actin（為內(nèi)參）引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.3 Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞焦亡通路相關(guān)信號(hào)分子的蛋白表達(dá)藥物處理方法同“1.4”項(xiàng)。收集細(xì)胞沉淀，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液抽提總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉1 h后，分別加入以下一抗稀釋液[TLR4（1∶800）、NLRP3（1∶800）、Caspase-1（1∶500），ASC（1∶500）、GSDMD-N（1∶500），IL-18（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）]，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次5 min，然后與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）二抗稀釋液（1∶5 000）進(jìn)行室溫孵育2 h，再用TBST洗膜3次，每次5 min，最后用電化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）進(jìn)行顯影，沖洗膠片。

1.5.4油紅O染色法觀察巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚和泡沫化情況藥物處理方法同“1.4”項(xiàng)。藥物處理細(xì)胞48 h后，取0.5%油紅O/異丙醇儲(chǔ)存液與蒸餾水按照3∶2比例混勻，靜置10 min后過(guò)濾獲得油紅O染液。將不同組別干預(yù)處理48 h的細(xì)胞加入60%異丙醇浸泡5 min，倒去異丙醇后，換0.5%油紅O溶液浸染15 min，倒去油紅O溶液后，換85%異丙醇溶液清洗3 min至背景無(wú)色后換蒸餾水清洗。最后倒置顯微鏡下觀察和拍照。

1.5.5 碘化丙啶（PI）染色法觀察細(xì)胞死亡情況藥物處理方法同“1.4”項(xiàng)。藥物處理細(xì)胞48 h后，加入1 μg·mL-1Heochst 33342染色液，37℃孵育10 min，再棄去染液后，加入1.0 mL PI染液，4℃避光染色15 min，倒置熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.5.6 微量酶標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞上清LDH含量藥物處理方法同“1.4”項(xiàng)。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用LDH試劑盒（微量酶標(biāo)法）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析以及事后檢驗(yàn)Tukey HSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心脈康方含藥血清抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚和泡沫化TC、TG、FC以及CE/TC水平升高是脂質(zhì)累積的重要指標(biāo)。與對(duì)照組比較，ox-LDL組中TC、TG、FC和CE/TC水平明顯升高；而各濃度心脈康方含藥血清和阿托伐他汀抑制了ox-LDL誘導(dǎo)的TC、TG、FC和CE/TC水平升高，且抑制作用呈濃度依賴(lài)性。提示心脈康方能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚。見(jiàn)圖1。

圖1 心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚的影響Figure 1 Effect of Xinmai Kang Formula-containing serum on lipid accumulation in ox-LDL-induced macrophages

巨噬細(xì)胞泡沫化是早期動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的主要標(biāo)志。油紅O染色結(jié)果顯示：對(duì)照組大部分細(xì)胞沒(méi)有脂滴，少數(shù)細(xì)胞含有少量的脂滴；ox-LDL組細(xì)胞體積增大變圓，細(xì)胞質(zhì)中含有大量紅色脂滴；與ox-LDL組相比較，阿托伐他汀組和不同濃度的心脈康方含藥血清組脂滴含量逐漸下降，呈濃度依賴(lài)性。提示心脈康方能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化。見(jiàn)圖2。

圖2 心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響（油紅O染色法）Figure 2 Effect of Xinmai Kang Formula-containing serum on foaming in ox-LDL-induced macrophages（by oil red O staining method）

2.2 心脈康方含藥血清抑制ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡與對(duì)照組比較，ox-LDL組中IL-1β、IL-18 mRNA和蛋白水平以及GSDMD-N蛋白表達(dá)水平顯著上升；與ox-LDL組比較，阿托伐他汀組和不同濃度的心脈康方含藥血清組上述各指標(biāo)水平均呈下降趨勢(shì)，且呈濃度依賴(lài)性。具體結(jié)果見(jiàn)圖3-A~F。

圖3-G結(jié)果顯示，ox-LDL能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH含量明顯地增高，經(jīng)阿托伐他汀或者不同濃度的心脈康方含藥血清干預(yù)后，這種上升趨勢(shì)得到逆轉(zhuǎn)，且逆轉(zhuǎn)的程度與心脈康方含藥血清濃度呈正相關(guān)性。

圖3 心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡的影響Figure 3 Effect of Xinmai Kang Formula-containing serum on pyroptosis of ox-LDL-induced macrophages

PI染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，ox-LDL組中PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量急劇上升，但在阿托伐他汀或者不同濃度的心脈康方含藥血清的干預(yù)下，PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量呈下降趨勢(shì)，且呈濃度依賴(lài)性。具體結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡的影響（PI染色法）Figure 4 Effect of Xinmai Kang Formula-containing serum on pyroptosis of ox-LDL-induced macrophages（by PI staining method）

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，心脈康方能夠阻遏ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡。

2.3 心脈康方含藥血清抑制ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TLR4/NLRP3信號(hào)通路的激活采用qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)焦亡相關(guān)信號(hào)通路基因表達(dá)。結(jié)果顯示，ox-LDL可明顯地上調(diào)巨噬細(xì)胞中TLR4、NLRP3和Caspase-1 mRNA表達(dá)水平，經(jīng)阿托伐他汀或者不同濃度的心脈康方含藥血清干預(yù)后，可明顯逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中TLR4、NLRP3和Caspase-1 mRNA表達(dá)水平的升高，且心脈康方含藥血清濃度越高，抑制效果越明顯。具體結(jié)果見(jiàn)圖5-A~C。

繼而采用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)焦亡相關(guān)信號(hào)通路的激活情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，ox-LDL組中TLR4、NLRP3、ASC以及Caspase-1的蛋白表達(dá)水平顯著上升，在阿托伐他汀或者不同濃度的心脈康方含藥血清的作用下，這種上升趨勢(shì)得以逆轉(zhuǎn)，且逆轉(zhuǎn)效果與心脈康方含藥血清的濃度呈正相關(guān)。具體結(jié)果見(jiàn)圖5-D~H。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，心脈康方能夠阻止ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中TLR4/NLRP3信號(hào)通路的激活。

2.4 TLR4過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TLR4/NLRP3信號(hào)通路的抑制作用為了探討心脈康方含藥血清是否通過(guò)TLR4/NLRP3信號(hào)通路來(lái)調(diào)控巨噬細(xì)胞焦亡，本研究首先將TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、ox-LDL和心脈康方含藥血清共同處理巨噬細(xì)胞48 h，并通過(guò)qPCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中TLR4、NLRP3、Caspase-1的表達(dá)水平。qPCR結(jié)果顯示，TLR4過(guò)表達(dá)能夠顯著地逆轉(zhuǎn)阿托伐他汀或者心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中TLR4、NLRP3、Caspase-1 mRNA水平的降低作用，具體結(jié)果見(jiàn)圖6-A~C。

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，TLR4過(guò)表達(dá)能夠明顯地逆轉(zhuǎn)阿托伐他汀或者心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中TLR4、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平的下調(diào)作用，具體結(jié)果見(jiàn)圖6-D~H。

圖6 TLR4過(guò)表達(dá)與心脈康方含藥血清共同作用對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中TLR4/NLRP3信號(hào)通路的影響Figure 6 Effect of TLR4 overexpression in combination with Xinmai Kang Formula-containing serum on pyroptosis of ox-LDL-induced macrophages

2.5 TLR4過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚和泡沫化的抑制作用本研究通過(guò)檢測(cè)TC、TG、FC水平，及采用油紅O染色觀察各組中脂質(zhì)積累和泡沫化情況，結(jié)果顯示，TLR4過(guò)表達(dá)能夠顯著地逆轉(zhuǎn)阿托伐他汀或者心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚的減少作用，具體結(jié)果見(jiàn)圖7。同時(shí)，TLR4過(guò)表達(dá)也能夠明顯地逆轉(zhuǎn)阿托伐他汀或者心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制作用，具體結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖7 TLR4過(guò)表達(dá)與心脈康方含藥血清共同作用對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚的影響Figure 7 Effect of TLR4 overexpression in combination with Xinmai Kang Formula-containing serum on lipid accumulation in ox-LDL-induced macrophages

圖8 TLR4過(guò)表達(dá)與心脈康方含藥血清共同作用對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響（油紅O染色法）Figure 8 Effect of TLR4 overexpression in combination with Xinmai Kang Formula-containing serum on foaming of ox-LDL-induced macrophages（by Oil Red O staining method）

2.6 TLR4過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡的抑制作用采用qPCR和Western Blot法檢測(cè)各組中細(xì)胞焦亡相關(guān)下游基因和蛋白的表達(dá)以及采用LDH試劑盒和IP染色檢測(cè)各組中細(xì)胞焦亡情況，結(jié)果顯示，TLR4過(guò)表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)阿托伐他汀或者心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡相關(guān)下游基因IL-1β和IL-18 mRNA表達(dá)水平以及IL-1β、IL-18和GSDMD-N蛋白表達(dá)水平的下降作用，具體結(jié)果見(jiàn)圖9-A~F。TLR4過(guò)表達(dá)也能夠逆轉(zhuǎn)阿托伐他汀或者心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放LDH水平的減少作用，具體結(jié)果見(jiàn)圖9-G。此外，TLR4過(guò)表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)阿托伐他汀或者心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的降低作用，具體結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖9 TLR4過(guò)表達(dá)與心脈康方含藥血清共同作用對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡的影響Figure 9 Effect of TLR4 overexpression in combination with Xinmai Kang Formula-containing serum on pyroptosis of ox-LDL-induced macrophages

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的病變特點(diǎn)為由于機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝受損引起的動(dòng)脈壁內(nèi)膜易損斑塊沉積，斑塊中含有大量炎癥細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、激活的T細(xì)胞等），少量平滑肌細(xì)胞及較多新生血管。炎癥作為免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，貫穿動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的整個(gè)過(guò)程，影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成和進(jìn)展[3]。因此，干預(yù)炎癥因子逐漸成為防治動(dòng)脈粥樣硬化的有效手段[13-14]。

心脈康方中：鱉甲滋陰清熱、軟堅(jiān)散結(jié)，為君藥；三棱、莪術(shù)行氣破血，牡蠣、地龍軟堅(jiān)消積，共為臣藥；枳實(shí)破氣化痰消積，膽南星化痰，為佐藥；再佐以黨參益氣健脾，使破氣不傷正和傷胃。諸藥合用，共奏化痰消積、軟堅(jiān)散結(jié)之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：莪術(shù)、三棱能夠抑制炎癥，阻止血栓形成[15]；黨參多糖、地龍可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制細(xì)胞炎癥因子表達(dá)[16-17]。

動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)是血管內(nèi)皮損傷，脂質(zhì)積聚，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)后變成巨噬泡沫細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積和泡沫化，與文獻(xiàn)報(bào)道[18-19]一致。血脂異常為動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素，巨噬細(xì)胞泡沫化是早期動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的主要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，心脈康方含藥血清中、高濃度均能改善TC、TG、FC和CE/TC水平，呈濃度依賴(lài)性。油紅O染色結(jié)果顯示，心脈康方含藥血清可減少ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中紅色脂滴的積聚，隨著藥物濃度的增加，效果更為明顯。表明心脈康方含藥血清能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化，從而發(fā)揮其改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

巨噬細(xì)胞功能障礙被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的關(guān)鍵步驟。在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展中，病變巨噬細(xì)胞的死亡和死細(xì)胞的吞噬清除功能缺陷促進(jìn)了斑塊壞死的形成[20]。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞焦亡（pyroptosis）與人類(lèi)巨噬細(xì)胞死亡有關(guān)，提示細(xì)胞焦亡在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要的作用[4]。細(xì)胞焦亡又稱(chēng)細(xì)胞炎性壞死，是一種促炎癥性程序性細(xì)胞死亡方式，其特點(diǎn)是氣泡狀突起形成，GSDMD在細(xì)胞膜形成孔，胞內(nèi)LDH等物質(zhì)流出，最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，膜破裂，造成IL-18和IL-1β等炎癥因子的大量釋放。因此，活化的GSDMD蛋白是引起細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵步驟，而檢測(cè)LDH可評(píng)估細(xì)胞滲漏程度。有研究證實(shí)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中IL-18和IL-1β的表達(dá)均升高，而在不穩(wěn)定斑塊中，其表達(dá)更為明顯[21]。本研究結(jié)果顯示，模型組中LDH含量，PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，GSDMD-N、IL-1β和IL-18水平均顯著升高，而心脈康含藥血清可使PI陽(yáng)性細(xì)胞呈下降趨勢(shì)，降低GSDMD-N的表達(dá)和上清液中LDH含量，以及下調(diào)IL-18和IL-1β等炎癥因子的表達(dá)，且趨勢(shì)呈濃度依賴(lài)性，這表明心脈康方含藥血清有效地抑制了巨噬細(xì)胞焦亡。

ox-LDL可被巨噬細(xì)胞中的TLR-4所識(shí)別，進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中NLRP3、pro-Caspase-1、GSDMD、pro-IL-1β和pro-IL-18的上調(diào)，NLRP3受到刺激活化后，與ASC相結(jié)合，募集pro-Caspase-1并誘導(dǎo)自我剪切成Caspase-1。Caspase-1的激活介導(dǎo)后續(xù)消皮素D（GSDMD）蛋白的活化，導(dǎo)致焦亡的發(fā)生[11]。由此可見(jiàn)，TLR4/NLRP3信號(hào)通路在細(xì)胞焦亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。有學(xué)者報(bào)道，抑制該通路可減少細(xì)胞焦亡及改善動(dòng)脈粥樣硬化[22-23]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的心脈康方含藥血清均可降低ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中TLR4、NLRP3、ASC和Caspase-1的表達(dá)，并且隨著心脈康方含藥血清濃度的升高其表達(dá)量逐漸下降。這提示心脈康方可能通過(guò)阻止TLR4/NLRP3信號(hào)通路的激活，抑制了ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，從而發(fā)揮改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用。為了進(jìn)一步探討心脈康方含藥血清是否通過(guò)TLR4/NLRP3信號(hào)通路來(lái)調(diào)控巨噬細(xì)胞焦亡抗動(dòng)脈粥樣硬化，本研究進(jìn)行了一系列的細(xì)胞恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，TLR4過(guò)表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)心脈康方含藥血清對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚、泡沫化、焦亡和炎癥反應(yīng)的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)了心脈康方對(duì)巨噬細(xì)胞焦亡的抑制作用與TLR4/NLRP3通路有關(guān)。

綜上所述，心脈康方可通過(guò)調(diào)控TLR4/NLRP3信號(hào)通路的活化抑制ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積、泡沫化和焦亡，從而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。