周月媛，馮東林，葉俊秋，吳孟晗，彭陳瑾，王昭維，李 萌，張英起，何 磊

(空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

近年來，以免疫檢查點抑制為主的腫瘤免疫治療在基礎(chǔ)研究和臨床試驗中不斷取得突破性成果[1-2]。腫瘤免疫治療已成為繼手術(shù)、放療、化療之后的第四種腫瘤治療手段，但存在藥物應(yīng)答率低、自身免疫反應(yīng)毒性大、易產(chǎn)生耐藥性等問題[3-4]。目前，尋找新的免疫治療靶點是提高患者反應(yīng)率的重要途徑。生長分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF15)是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員之一，在正常生理調(diào)節(jié)下表達水平低，但在炎癥性疾病、惡性腫瘤和妊娠等特殊狀態(tài)時顯著上調(diào)[5-7]。其主要功能是參與能量穩(wěn)態(tài)、體質(zhì)量調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程[8-11]，而在抗腫瘤免疫反應(yīng)中的研究較少[12-14]。

本課題組近年聚焦于GDF15的抗腫瘤免疫作用和分子機制研究，發(fā)現(xiàn)其對多種免疫細(xì)胞的抑制性表型具有促進作用。若抑制GDF15的活性，可能會緩解腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究通過生產(chǎn)制備GDF15單克隆抗體并分析其抑制腫瘤生長的功效，為以GDF15為靶點的人源化單克隆抗體研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 骨髓瘤細(xì)胞系SP20、人T淋巴母細(xì)胞系Jurkat均購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)，并由本科室長期保存使用。人原代CD4+T細(xì)胞分離自健康人外周血單個核細(xì)胞，健康人血液來源于空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院輸血科，鼠CD4+T細(xì)胞由小鼠脾臟分離獲得。

1.1.2 實驗動物 BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于科室專業(yè)動物房。本研究已通過空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(許可證號：IACUC-20200152)。

1.2 方法

1.2.1 雜交瘤細(xì)胞的制備 采用的抗原GDF15為商品化可溶性蛋白(9279-GD)，將其與弗氏佐劑按1∶1混合，多點注射免疫BALB/c小鼠3次，每次間隔3周，最后1次注射3 d后，采用吸入CO2方式處死小鼠，取出脾臟，分離得到B淋巴細(xì)胞。提前培養(yǎng)SP20細(xì)胞，與B淋巴細(xì)胞混合，離心后加入500 mL/L PEG (Mr4 000)，攪拌30 s，加入培養(yǎng)基離心后用RPMI 1640重懸培養(yǎng)于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。采用ELISA檢測雜交瘤培養(yǎng)體系上清液，用PBS作為對照，篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞。通過在96孔板中的有限稀釋法，篩選得到單克隆雜交瘤細(xì)胞。

1.2.2 單克隆抗體的制備和純化 給BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL降植烷使小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生IL-6等細(xì)胞因子，1周后腹腔注射5×105個雜交瘤細(xì)胞，7～10 d處死小鼠，抽取腹水。采用硫酸銨鹽析法(700 g/L硫酸銨)對抗體進行粗提純，之后用親和層析法對抗體進行細(xì)純化，將樣品上樣至Protein A+G填裝柱內(nèi)，過柱后用10倍填裝柱量的TBS過柱，以去除非特異性結(jié)合的蛋白。洗滌完畢后，用10 mL甘氨酸(50 mmol/L，pH 2.7)洗脫結(jié)合在柱子上的抗體，收集抗體。

1.2.3 ELISA篩選抗體 ELISA被用于可溶性抗原的單克隆抗體檢測。實驗步驟如下：①GDF15稀釋至1～10 mg/L，ELISA板子每孔加入100 μL稀釋好的GDF15，4 ℃過夜；②將雜交瘤上清加入包被有抗原的孔中，每孔100 μL，置37 ℃孵育1 h；③加入稀釋好的酶標(biāo)抗體100 μL，37 ℃孵育1 h；④每1 mL底物緩沖液加入0.4 mg鄰苯二胺，置于室溫或37 ℃ 15～20 min，用酶標(biāo)儀檢測各樣品的A490 nm值。

1.2.4 實時定量PCR GDF15聯(lián)合T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor，TCR，plate-bound anti-CD3/CD28+IL-2)作為實驗組，同時上述體系中分別加入濃度為1 mg/L的5株抗體(G15A01～G15A05)，刺激人白血病T淋巴細(xì)胞JURKAT 5 d；對照組采用單純TCR刺激細(xì)胞5 d。用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用PCR儀對所提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。根據(jù)PrimerBank數(shù)據(jù)庫，設(shè)計好目的條帶上下游引物，交由北京擎科公司西安分部合成，引物序列為：β-actin-F(5′-GTCTGC CTTGGTAGTGGATAATG-3′)，β-actin-R(5′-TCGAGGAC GCCCTATCATGG-3′)；CTLA-4-F(5′-TTTTGTAGCCCTG CTCACTCT-3′)，CTLA-4-R(5′-CTGAAGGTTGGGTCAC CTGTA-3′)。目的基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCt法，即ΔCt=Ct目的基因-Ct同一樣本的管家基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，通過管家基因即β-actin的Ct平均值作為校正基數(shù)來檢測和計算實驗結(jié)果。

1.2.5 構(gòu)建小鼠原發(fā)誘導(dǎo)肝癌模型AKT和N-Ras基因的過表達及其相互作用能夠誘導(dǎo)小鼠原發(fā)肝癌的發(fā)生發(fā)展，可通過給小鼠尾靜脈高壓注射myr-AKT1、N-RasV12質(zhì)粒和sleeping beauty轉(zhuǎn)座子構(gòu)建小鼠原發(fā)誘導(dǎo)肝癌模型[15]。從Addgene(美國)購得含有目的基因的質(zhì)粒，分別進行轉(zhuǎn)化并搖菌提取得到足夠量的質(zhì)粒。準(zhǔn)備6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，將上一步得到的質(zhì)粒溶液按myr-AKT1、N-RasV12質(zhì)粒和sleeping beauty轉(zhuǎn)座子，以每只小鼠分別注射10、10、0.4 μg的量，配置成2 mL質(zhì)?；旌衔锏纳睇}水溶液；使用胰島素針頭從小鼠尾部的下1/3處進行尾靜脈注射，將2 mL質(zhì)?；旌弦涸?～7 s內(nèi)注入小鼠體內(nèi)，棉球止血20 s，將小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)4周。

1.2.6 小鼠原發(fā)肝癌的治療及模型評價 實驗分為4組，包括同型對照組(isotype control, Iso；125 μg IgG)、PD-1單克隆抗體治療組(125 μg IgG+125 μg PD-1-mAb)、G15A治療組(125 μg IgG+125 μg G15A)以及聯(lián)合用藥組(125 μg PD-1-mAb+125 μg G15A)。每5 d腹腔注射給藥，治療4周后處死小鼠，肝臟灌流后取小鼠肝臟；將小鼠肝臟按照腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量從多到少排列進行拍照，觀察肝臟成瘤情況，統(tǒng)計各組誘發(fā)結(jié)節(jié)的數(shù)量，并測量最大結(jié)節(jié)直徑。用電子天平稱量腫瘤體質(zhì)量，并通過流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)進行腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)中免疫細(xì)胞分析。

2 結(jié)果

2.1 五株雜交瘤細(xì)胞的制備和腹水效價

通過有限稀釋法，最終得到能夠產(chǎn)生GDF15單克隆抗體的5株雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤建系標(biāo)準(zhǔn)如下：連續(xù)4次克隆化陽性率為100%；體外連續(xù)傳代3個月仍具有穩(wěn)定的抗體分泌能力。ELISA檢測顯示，PBS作為對照，5株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中均含有GDF15的特異性單克隆抗體(圖1)。將抗體分別命名為G15A01、G15A02、G15A03、G15A04和G15A05。

圖1 五株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的ELISA檢測

將5株陽性雜交瘤細(xì)胞注射BALB/c小鼠體內(nèi)產(chǎn)生腹水后，吸取腹水并用70目篩網(wǎng)簡單過濾去除雜質(zhì)，吸取100 μL進行梯度稀釋，用提前過夜包被GDF15的96孔板對5種腹水進行ELISA效價測定，實驗結(jié)果顯示本部分實驗產(chǎn)生的5種腹水與抗原特性結(jié)合程度較好，腹水效價最高可達10-7。本部分實驗生產(chǎn)的高效價腹水為接下來的純化及篩選中和性抗體奠定了基礎(chǔ)。

2.2 GDF15單克隆抗體的親和層析純化

對5種小鼠腹水進行硫酸銨鹽析法粗純化后，使用AKTA(FPLC)層析純化系統(tǒng)對粗純化后的腹水進行抗體細(xì)純化。上機前用0.45 μm濾膜進行過濾以防止樣品堵塞層析柱和管道，層析柱使用Protein A+G瓊脂糖珠，上樣流速為0.3 mL/min，洗脫流速 0.5 mL/min。通過親和層析的純化獲得單一的洗脫峰(圖2A)，將原液和洗脫峰收集的蛋白進行SDS-PAGE，結(jié)果顯示通過親和層析的方法我們獲得了純度較高的單克隆抗體(圖2B)。其他4株抗體與G15A01純化結(jié)果相似，都得到了純度較高的單克隆抗體，在此不做重復(fù)展示。

A：G15A01抗體親和層析純化圖，第一道峰為上樣未結(jié)合的樣品(穿過峰)，第二道峰為用pH 2.7的glycine洗脫液洗脫下結(jié)合在層析柱上的樣品(目的峰)；B：聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。 圖2 GDF15單克隆抗體的純化

2.3 GDF15五株單克隆抗體的效價

親和層析純化后，5株抗體經(jīng)HPLC檢測純度均在95%以上，ELISA檢測顯示效價均大于10-4?？贵w分型檢測結(jié)果顯示5株抗體中有2株IgM、3株IgG(表1)。

表1 GDF15五株單克隆抗體的純度、效價和分型

2.4 GDF15中和性單克隆抗體篩選

前期，我們通過實驗證明GDF15聯(lián)合TCR的刺激可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T(regulatory T，Treg)細(xì)胞生成，Treg細(xì)胞生成的顯著標(biāo)志之一是CTLA-4的表達上調(diào)。因此，可以利用該體系從制備的5株單克隆抗體中篩選具有中和活性的GDF15單克隆抗體。qRT-PCR結(jié)果顯示GDF15聯(lián)合TCR(plate-bound anti-CD3/CD28+IL-2)刺激5 d，可顯著上調(diào)na?ve CD4+T細(xì)胞中CTLA-4的表達水平(P<0.01，圖3A)。篩選得到的5株抗體(G15A01～G15A05)以1 mg/L濃度加入上述體系后，G15A01和G15A03單克隆抗體能夠顯著抑制人GDF15引起的CTLA-4表達上調(diào)(P<0.01)，其他3株抗體中和作用不明顯(圖3B)。

A：GDF15聯(lián)合T細(xì)胞抗原受體能夠顯著上調(diào)Jurkat細(xì)胞CTLA-4的表達水平；B：G1和G3能夠顯著抑制人GDF15上調(diào)CTLA-4表達的生物學(xué)活性。Ctrl：單純T細(xì)胞抗原受體刺激組；G1～G5：G15A01～G15A05。bP<0.01。圖3 G15A01、G15A03顯著抑制人GDF15引起的CTLA-4上調(diào)

2.5 G15A01、G15A03對小鼠GDF15同樣具有中和作用

腫瘤免疫反應(yīng)的動物實驗需使用小鼠來源腫瘤細(xì)胞在同種系小鼠體內(nèi)完成，為方便后續(xù)的動物實驗，我們需要證明得到的抗體是否也能夠中和小鼠GDF15的生物學(xué)功能。人GDF15和小鼠GDF15的同源性約為84.1%，幸運的是，G15A01和G15A03對于小鼠GDF15同樣具有中和活性，具體實驗結(jié)果如下：小鼠GDF15聯(lián)合小鼠TCR刺激小鼠脾臟na?ve CD4+T細(xì)胞也可以引發(fā)CTLA-4顯著上調(diào)(P<0.01，圖4A)；G15A01～G15A05五株抗體以1 mg/L濃度加入上述體系后，G15A01和G15A03單克隆抗體能夠顯著抑制小鼠GDF15引起的CTLA-4表達上調(diào)(P<0.01)，其他3株抗體中和作用不明顯(圖4B)。后續(xù)實驗統(tǒng)一用G15A01完成，為簡練起見，后文將G15A01統(tǒng)一稱為G15A。

A：小鼠GDF15聯(lián)合T細(xì)胞抗原受體能夠顯著上調(diào)小鼠na?ve CD4+ T細(xì)胞CTLA- 4的表達水平；B：G1和G3能夠顯著抑制小鼠GDF15引起的CTLA- 4上調(diào)。Ctrl：單純T細(xì)胞抗原受體刺激組；G1～G5： G15A01～G15A05。 bP<0.01。圖4 G15A01、G15A03顯著抑制小鼠GDF15引起的CTLA-4上調(diào)

2.6 G15A對小鼠體內(nèi)原發(fā)誘導(dǎo)肝癌的治療作用

構(gòu)建小鼠原發(fā)誘導(dǎo)肝癌模型4 d后，每隔5 d給予G15A單克隆抗體治療，一共給藥4次。28 d時取肝臟拍照，并記錄和統(tǒng)計肝臟結(jié)節(jié)數(shù)量以及最大結(jié)節(jié)直徑。結(jié)果顯示，G15A治療明顯抑制了原發(fā)肝癌的進展(圖5A)。根據(jù)肝臟結(jié)節(jié)數(shù)量及肝臟最大結(jié)節(jié)直徑的統(tǒng)計結(jié)果，G15A治療組的肝臟結(jié)節(jié)數(shù)量和最大結(jié)節(jié)直徑均顯著低于等量IgG處理組(P<0.01，圖5B～C)。我們對相同實驗下不同批次小鼠模型進行了生存期統(tǒng)計，結(jié)果顯示，與Iso對照組相比，G15A治療顯著延長了小鼠的生存期(P<0.01，圖5D)。上述結(jié)果證實GDF15抗體顯著抑制了肝癌的發(fā)展，具有明顯抑制腫瘤生長的作用。

A：治療原發(fā)肝癌28 d后小鼠肝臟照片(n=6)；B：小鼠肝臟結(jié)節(jié)數(shù)量統(tǒng)計(n=6)；C：小鼠肝臟最大結(jié)節(jié)直徑統(tǒng)計(n=6)；D：小鼠治療后的生存期統(tǒng)計(n=8)。Iso：同型對照組，用125 μg IgG處理；G15A：單克隆抗體G15A治療組，用125 μg G15A01處理。 bP<0.01。圖5 G15A對小鼠原發(fā)誘導(dǎo)肝癌的治療作用

FCM觀察G15A治療后小鼠肝癌TME。檢測TME和脾臟中的Treg細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)G15A治療后，TME及脾臟中Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例均顯著少于未治療的Iso組(P<0.01，圖6A)。G15A治療后，在CD3+腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)中，IFN-γ+T細(xì)胞顯著增多(P<0.01，圖6B)，IL-10+T細(xì)胞顯著減少(P<0.01，圖6C)。對TME中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖能力檢測，結(jié)果顯示G15A治療后，腫瘤浸潤的CD4+和CD8+T細(xì)胞Ki67的表達水平升高(P<0.01，圖6D～E)，提示G15A治療增強了腫瘤中T淋巴細(xì)胞的增殖活性。上述結(jié)果提示，GDF15單克隆抗體能夠通過激活抗腫瘤免疫反應(yīng)，對小鼠原發(fā)誘導(dǎo)肝癌具有顯著的治療作用。

A：TME和脾臟中Treg細(xì)胞占CD4+ T細(xì)胞的比例；B：TME中IFN-γ+ T細(xì)胞占CD3+ TIL的比例；C：TME中IL-10+ T細(xì)胞占CD3+ TIL的比例；D：TME中CD4+ T細(xì)胞的Ki67表達水平；E：TME中CD8+ T細(xì)胞的Ki67表達水平。Iso：同型對照組，用125 μg IgG處理。n=6， aP<0.05， bP<0.01。圖6 G15A治療小鼠原發(fā)誘導(dǎo)肝癌TME中免疫狀態(tài)的變化

2.7 G15A和PD-1單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用對小鼠原發(fā)誘導(dǎo)肝癌的治療作用

構(gòu)建小鼠原發(fā)誘導(dǎo)肝癌模型4 d后，開始給予G15A和PD-1單克隆抗體聯(lián)合治療，5 d給藥1次，共給藥4次。第28日取肝臟拍照，并記錄和統(tǒng)計肝臟結(jié)節(jié)數(shù)量以及最大結(jié)節(jié)直徑。結(jié)果顯示，相比于Iso組、G15A和PD-1單克隆抗體單獨治療組，G15A和PD-1單克隆抗體聯(lián)合治療顯示了一定的治療效果(圖7A)。PD-1單克隆抗體單獨治療效果最差，G15A治療效果次之，二者聯(lián)合應(yīng)用的治療效果最好。根據(jù)對肝臟結(jié)節(jié)數(shù)量以及最大結(jié)節(jié)直徑的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，雖然PD-1單克隆抗體單獨治療能夠顯著減少肝臟上誘發(fā)的結(jié)節(jié)數(shù)量(P<0.05)，但不能減小誘發(fā)結(jié)節(jié)的大小。與G15A聯(lián)用后，不僅使得誘發(fā)結(jié)節(jié)數(shù)量顯著下降，誘發(fā)結(jié)節(jié)大小也顯著減小，顯示出更優(yōu)于G15A單獨治療的療效(P<0.05或P<0.01，圖7B～C)。我們對相同實驗下不同批次的4組小鼠進行了生存期統(tǒng)計，結(jié)果顯示，G15A和PD-1單克隆抗體聯(lián)合治療顯著延長了小鼠的生存期(P<0.05，圖7D)。上述結(jié)果證實G15A和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合治療顯著抑制了小鼠原發(fā)肝癌的進展，并且治療效果比G15A或PD-1單克隆抗體單獨治療效果更好。

A：第28日各處理組小鼠肝臟照片(n=5)；B：各處理組小鼠肝臟結(jié)節(jié)數(shù)量統(tǒng)計(n=5)；C：各處理組小鼠肝臟最大結(jié)節(jié)直徑統(tǒng)計(n=5)；D：各處理組小鼠生存期統(tǒng)計(n=8)。Iso：同型對照組，用125 μg IgG處理。 aP<0.05， bP<0.01。圖7 G15A與PD-1單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用對小鼠原發(fā)誘導(dǎo)肝癌的治療作用

通過FCM觀察G15A和PD-1單克隆抗體聯(lián)合治療后小鼠肝癌TME的改變情況。檢測TME中的Treg細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，G15A和PD-1單克隆抗體聯(lián)合治療后，TME中的Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例顯著低于Iso組和單獨抗體治療組(P<0.01，圖8A)。與Iso組相比，PD-1單克隆抗體治療組腫瘤Treg細(xì)胞比例無明顯差異，聯(lián)合用藥組腫瘤Treg細(xì)胞比例比G15A單獨治療組更低(P<0.01，圖8A)。對腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，與PD-1單克隆抗體治療組相比，PD-1與G15A聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著提高CD3+TIL中效應(yīng)性IFN-γ+T細(xì)胞的數(shù)量(P<0.01，圖8B)，減少抑制性IL-10+T細(xì)胞的數(shù)量(P<0.01，圖8C)。對TME中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖能力檢測，結(jié)果顯示，經(jīng)過G15A和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合治療，腫瘤浸潤的CD4+和CD8+T細(xì)胞Ki67的表達水平升高(P<0.01)，表明細(xì)胞的增殖活性更強(圖8D～E)。上述結(jié)果提示，G15A和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合應(yīng)用對小鼠原發(fā)誘導(dǎo)肝癌呈現(xiàn)出更顯著的治療作用。

A：TME中Treg細(xì)胞占CD4+ T細(xì)胞的比例；B：TME中IFN-γ+ T細(xì)胞占CD3+ TIL的比例；C：TME中IL-10+ T細(xì)胞占CD3+ TIL的比例；D：TME中CD4+ T細(xì)胞的Ki67表達水平；E：TME中CD8+ T細(xì)胞的Ki67表達水平。Iso：同型對照組，用125 μg IgG處理。 aP<0.05， bP<0.01。圖8 G15A與PD-1單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用改變小鼠原發(fā)誘導(dǎo)肝癌免疫微環(huán)境

3 討論

治療性單克隆抗體藥物是針對單一抗原表位，具有藥理學(xué)作用的抗體藥物，其研發(fā)流程相對容易，藥物毒性小、安全性高、特異性強，是目前腫瘤免疫治療和生物制藥的熱點[16-17]。目前上市的單克隆抗體類藥物如Nivolumab、Pembrolizumab等在臨床上取得了良好的療效[18-19]。并且有文獻報道，一些新的免疫檢查點如TIM-3、LAG-3單克隆抗體與PD-1單克隆抗體聯(lián)合使用比PD-1單克隆抗體單獨使用在效果上也會有明顯的提升[20-21]。

本實驗室前期許多工作證實腫瘤源性因子GDF15能夠誘導(dǎo)多種抑制性免疫細(xì)胞產(chǎn)生或上調(diào)免疫細(xì)胞的抑制性表型，促進腫瘤抑制性免疫微環(huán)境的形成，從而促進腫瘤進展，是不良預(yù)后的重要因素。這些現(xiàn)象揭示了GDF15是一個腫瘤免疫治療的新靶點，靶向GDF15的治療能夠促進抗腫瘤免疫反應(yīng)。因為GDF15是一個分泌表達的可溶性細(xì)胞因子，因此開發(fā)其中和性單克隆抗體是最簡單方便的GDF15干預(yù)方式。

靶向GDF15的免疫治療除了可以同時抑制多種抑制性免疫細(xì)胞形成之外，還具有另外兩個優(yōu)點。第一，GDF15是腫瘤細(xì)胞分泌的抑制性因子，生理條件下GDF15表達水平很低，我們在Gdf15-/-小鼠中未觀察到出生缺陷或成年后的生理缺陷，因此，靶向GDF15的治療不會引發(fā)嚴(yán)重的副作用；第二，GDF15目前已知的生理功能是抑制食欲，控制體質(zhì)量，在腫瘤患者中GDF15水平與腫瘤惡液質(zhì)密切相關(guān)，所以靶向GDF15的治療在提高抗腫瘤免疫的同時還能夠抑制GDF15導(dǎo)致的惡液質(zhì)。

本研究以腫瘤源性因子GDF15為抗原，用傳統(tǒng)單克隆抗體生產(chǎn)路線生產(chǎn)GDF15單克隆抗體。通過課題組對GDF15十余年的研究，我們發(fā)現(xiàn)該分子對多種免疫細(xì)胞具有免疫抑制性，并且發(fā)現(xiàn)GDF15能夠刺激腫瘤高表達CTLA-4，能夠誘導(dǎo)na?ve CD4+T細(xì)胞的FOXP3表達量上調(diào)，據(jù)此建立了穩(wěn)定的單克隆抗體篩選體系。通過篩選體系篩選出2株能夠中和抑制GDF15生物學(xué)活性的單克隆抗體，經(jīng)親和層析、SPR、抗體測序等技術(shù)對其理化性質(zhì)進行分析，最終得到了純度高、親和力強并且對人源和鼠源GDF15均具有中和活性的單克隆抗體G15A。

我們通過G15A治療小鼠的原發(fā)誘導(dǎo)肝癌，對其抑瘤效果進行了多角度驗證，發(fā)現(xiàn)G15A治療明顯抑制了小鼠原發(fā)肝癌的進展，并顯著延長了小鼠的生存期。對治療后小鼠肝癌TME的免疫狀態(tài)進行檢測，我們發(fā)現(xiàn)與未治療組相比，G15A治療顯著減少了腫瘤Treg細(xì)胞及IL-10抑制性T細(xì)胞的浸潤，而增加了IFN-γ效應(yīng)性T細(xì)胞的浸潤，提高了腫瘤浸潤的CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖能力，使腫瘤的免疫抑制狀態(tài)被顯著逆轉(zhuǎn)。我們進一步研究了G15A與PD-1單克隆抗體聯(lián)合治療腫瘤的療效。根據(jù)實驗結(jié)果，G15A療效比PD-1單克隆抗體療效好，二者聯(lián)用效果最好，聯(lián)合用藥還能使TME的免疫抑制狀態(tài)得到進一步的解除。

綜上所述，我們證實了GDF15作為腫瘤免疫治療靶點的可能性，證實了G15A單克隆抗體作為腫瘤免疫治療制劑的可能性。目前，本課題組正在進行以該抗體可變區(qū)為基礎(chǔ)的抗體人源化工作和GDF15全人抗體的開發(fā)研究。GDF15單克隆抗體的成功開發(fā)將極大提升中國的腫瘤免疫治療制劑的研究水平，為中國和全世界生物技術(shù)藥物的發(fā)展做出貢獻。