張振忠，蘇 娟，排日罕·艾爾肯，陳淑萍

(1.新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院麻醉科，烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院麻醉科，烏魯木齊 830000；3.上海市第六人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，上海 200233)

每年有數(shù)百萬的幼兒在全身麻醉下接受影像學檢查、外科手術。氯胺酮以其卓越的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜優(yōu)勢，在兒科全身麻醉手術中廣泛應用[1]。然而，由于幼兒的各項發(fā)育不成熟，對麻醉藥的敏感性較高。隨著全身麻醉案例數(shù)量增加，幼兒出現(xiàn)近期或遠期認知功能障礙并發(fā)癥的案例也日漸增多[2]。如何減輕幼兒經歷氯胺酮全身麻醉后出現(xiàn)認知功能障礙癥狀是當前研究的重點。銀杏二萜內酯(diterpene ginkgolides，DG)為銀杏葉提取物中眾多銀杏內酯單體混合物。DG具有較好的抗血小板聚集、抗炎和心腦血管活性保護作用[3-4]。目前，DG已被廣泛應用于腦血管疾病，尤其是急性缺血性腦卒中的臨床治療。已有研究結果顯示，腦卒中患者常出現(xiàn)的血管性癡呆在DG的治療下顯著改善[5]。然而，DG在術后認知功能障礙中的應用尚處于前期探索階段。因此，進一步探究DG在術后認知功能障礙中的作用和機制具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只SD大鼠幼仔，2～3周齡，SPF級，體重30～50 g，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供。所有大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房中，飼養(yǎng)室溫度維持在22～24 ℃，12 h/12 h晝夜節(jié)律，保證所有幼鼠食物水源充足且自由攝取。本研究中所有涉及動物的實驗方案均遵循實驗動物護理和使用指南規(guī)定，且本研究實驗方案已獲得新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會的批準，批準號：XJMU-SAH202004300301。

1.2 儀器

SA201型Morris水迷宮(江蘇賽昂斯生物技術公司)；VHX-7000型共聚焦顯微鏡(日本Keyence公司)；MultiClamp 700B型、MultiClamp 1550B型膜片鉗放大器系統(tǒng)(瑞士Axon公司)；Mini-PROTEAN Tetra型電泳儀(美國Bio-rad公司)；1600/1600R型凝膠成像顯影儀(上海天能科技有限公司)。

1.3 藥品與試劑

銀杏二萜內酯葡胺注射液[江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批準文號為國藥準字Z20120024，批號為000409，規(guī)格為每支裝5 mL(含銀杏二萜內酯25 mg) ]；鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，批準文號為國藥準字H32022820，批號為190826，規(guī)格為2 mL∶ 0.1 g)；Hito Golgi-Cox Optimstain Kit高爾基染色試劑盒(美國Hitobiotec公司)；切片緩沖液[愛必信(上海)生物科技有限公司]；人工腦脊液(ACSF，北京酷來搏生物技術公司)；RIPA裂解液、BCA試劑盒以及β-actin抗體、HRP標記山羊抗鼠/兔二抗(上海碧云天生物技術有限公司)；Anti-腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)抗體、Anti-酪氨酸激酶受體B(TrkB)抗體和Anti-突觸后密度蛋白95(PSD-95)抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；Anti-活化的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)抗體、Anti-半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抗體、Anti-Bcl-2相關X蛋白(Bax)和Anti-B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)抗體(美國Proteintech公司)；超高敏發(fā)光液(上海天能科技有限公司)。

1.4 方法

將所有幼鼠隨機分為對照組(Con)、氯胺酮組(Ket)、銀杏二萜內酯葡胺低劑量組(DG-L，2.5 mg/kg)、銀杏二萜內酯葡胺中劑量組(DG-M，5 mg/kg)和銀杏二萜內酯葡胺高劑量組(DG-H，10 mg/kg)，每組10只。所有幼鼠分組后，分別腹腔注射DG溶液或0.9%氯化鈉溶液，1日1次，連續(xù)注射7 d。開始水迷宮訓練與測試，共5 d。水迷宮測試結束后，所有幼鼠禁食12 h，對照組幼鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，其他各組幼鼠腹腔注射氯胺酮注射液，總劑量100 mg/kg。具體方案：每隔90 min注射1次，1次注射20 mg/kg，共5次。麻醉過程中持續(xù)供氧1.5 L/min，以恒溫毯維持幼鼠體溫在37～38 ℃。隔3 d后，再次開展水迷宮訓練與測試，水迷宮期間持續(xù)給予銀杏二萜內酯進行治療或0.9%氯化鈉溶液作為對照。DG給藥時間共21 d。水迷宮結束后，以CO2處死幼鼠，部分幼鼠心臟灌流后，取腦組織切片后用于長時程電位測試，高爾基染色。部分幼鼠直接取海馬組織，提取蛋白后用于蛋白質印跡法檢測。

1.4.1 Morris水迷宮測試：Morris水迷宮裝置是一個直徑1.2 m，深0.5 m的圓形水池。Morris水迷宮軟件將水面分為4個象限，第I象限設置1個低于水面1 cm，直徑12 cm的圓形平臺，水池壁四周貼有不同圖形以幫助幼鼠定位平臺位置。圓形水池正上方固定1個攝像機用于收集幼鼠游泳路徑，攝像機連接電腦，信號輸入后以軟件分析幼鼠在水池各個象限中運行線路與時間。訓練期間，將幼鼠依次投入各個象限中，當幼鼠尋找并登上平臺，記錄該時間為逃避潛伏期，若幼鼠90 s內未找到平臺，則引導至平臺并記錄逃避潛伏期為90 s。訓練4 d后，撤去平臺，將幼鼠投入第Ⅲ象限中，記錄90 s內幼鼠運行軌跡，使用軟件分析獲得幼鼠平均游泳速率、首次到達平臺時間、穿越平臺次數(shù)和第Ⅰ象限停留時間。

1.4.2 高爾基染色：根據(jù)試劑盒說明書中操作流程開展高爾基染色。將幼鼠以CO2處死，以預冷的PBS心臟灌流，再使用4%多聚甲醛固定。取完整腦組織浸泡于試劑盒中的溶液1和溶液2混合液中，4 ℃避光儲存14 d。取出腦組織浸入溶液3中，4 ℃避光儲存48 h后，期間更換1次溶液3。將腦組織放入預冷的異戊烷中冷凍，擦去組織表面異戊烷。冷凍組織塊后，使用冰凍切片機切成約10 μm的切片，轉移至載玻片上貼片，滴加溶液3浸潤切片。將切片放入溶液4和溶液5混合液中反應30 min，以蒸餾水沖洗玻片。將切片放入50%、75%、95%乙醇中脫水，再分別經二甲苯Ⅰ與二甲苯Ⅱ透化，使用中性樹膠封片。顯微鏡下捕獲突觸圖像，采用NeuroExplorer軟件進行樹突棘密度和長度統(tǒng)計。

1.4.3 長時程電位測試：將幼鼠以CO2處死，立即用預冷的氧飽和高糖切片緩沖液心臟灌流，取出腦組織，以冷凍包埋液包埋組織后固定于切片機上，沿冠狀面對腦組織切片，厚度約10 μm。將切片轉移至32 ℃的氧飽和ACSF中備用。取出切片，自穿質通路(MPP)插入刺激電極，在海馬 DG區(qū)插入記錄電極，充灌ACSF作為記錄電極內液。電極連接MultiClamp 700B型放大器，記錄MPP-DG通路興奮性突觸后電位(EPSP)；沿穿質通路不斷調整刺激強度和記錄電極的位置、深度，以0.033 Hz的刺激頻率誘發(fā)場電位(fEPSP)直到記錄典型的場電位波形，然后固定電極與刺激強度。在基線穩(wěn)定記錄20 min后，應用高頻刺激誘發(fā)長時程增強(LTP)，連續(xù)20串高頻脈沖，每串包含200個脈沖，頻率為200 Hz，波寬200 μs，串間隔30 s，高頻刺激連續(xù)記錄60 min。

1.4.4 蛋白質印跡法：幼鼠以CO2處死，取海馬組織稱重，以體積∶ 質量=4∶ 1加入含PMSF的RIPA裂解液，研磨成細胞懸液，靜置30 min使蛋白完全裂解。離心(12 000 r/min，20 min)后取上清液，以BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液。取十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，每個樣品孔中加入約10 μg各組蛋白樣品與5 μL的預染蛋白Marker，開始SDS-PAGE凝膠電泳，條件為恒壓60 V/30 min，120 V/60 min，0 ℃冰水浴。當上樣緩沖液到達凝膠底部時，終止電泳，根據(jù)預染蛋白Marker截取目標蛋白條帶。以濕法轉膜法將凝膠上蛋白轉移至PVDF膜上，條件為恒流2 mA/60 min，0 ℃冰水浴。當轉膜結束，以4%脫脂牛奶封閉PVDF膜，避免抗體非特異性結合。PBST清洗條帶后，再以目標蛋白抗體(1∶ 1 000)稀釋液孵育PVDF膜，4 ℃過夜。次日，取出PVDF膜，PBST清洗條帶后，使用HRP-IgG二抗稀釋液室溫(25 ℃)孵育2 h。PBST清洗條帶后，將超高敏發(fā)光液滴加的PVDF膜上，在凝膠成像顯影儀下顯影獲得目的蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 銀杏二萜內酯葡胺對氯胺酮麻醉后幼鼠認知功能的影響

Morris水迷宮測試顯示，麻醉前，如圖1所示，訓練期間，各組小鼠逃避潛伏期隨著訓練次數(shù)的增加而逐漸縮短，測試期間，各組小鼠游泳速率、首次達到平臺時間、第Ⅰ象限停留時間占比和穿越平臺次數(shù)沒有差異。麻醉后，如圖2所示，訓練期間，與Con組相比，Ket組幼鼠逃避潛伏期顯著延長；與Ket組相比，DG-M與DG-H組小鼠在第3、4日逃避潛伏期顯著縮短，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。測試期間，各組幼鼠的游泳速率無差異；然而，與Con組相比，Ket組幼鼠首次達到平臺時間顯著延長，第Ⅰ象限停留時間占比顯著減少，穿越平臺次數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Ket組相比，DG-M與DG-H組幼鼠首次達到平臺時間顯著縮短，第Ⅰ象限停留時間占比顯著增加，穿越平臺次數(shù)顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

與Con組相比，#P<0.05；與Ket組相比，*P<0.05vs. the Con group,#P<0.05;vs. the Ket group,*P<0.05圖1 五組幼鼠麻醉前后水迷宮訓練期逃避潛伏期比較(n=10)Fig 1 Comparison of escape latency of 5 groups of immature rats in the water maze training period before and after anesthesia (n=10)

與Con組相比，#P<0.05；與Ket組相比，*P<0.05vs. the Con group,#P<0.05;vs. the Ket group,*P<0.05圖2 五組幼鼠麻醉前后水迷宮測試期游泳速率、首次到達平臺時間、第Ⅰ象限時間占比和穿越平臺時間比較(n=10)Fig 2 Comparison of swimming speed,duration to reach the platform,time spend in the first quadrant,and time of platform crossing in each group of 5 groups of immature rats before and after anesthesia in the water maze test period (n=10)

2.2 銀杏二萜內酯葡胺對氯胺酮麻醉后幼鼠海馬神經元樹突棘的影響

幼鼠腦組織海馬區(qū)樹突棘結構的高爾基染色結果與量化統(tǒng)計見圖3。結果顯示，Con組幼鼠海馬區(qū)神經元樹突棘密集；與Con組相比，Ket組幼鼠海馬區(qū)神經元樹突棘密度和樹突棘長度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Ket組相比，DG-L組幼鼠海馬區(qū)神經元樹突棘密度和長度沒有改變，而DG-L組幼鼠海馬區(qū)神經元樹突棘密度和長度顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

與Con組相比，#P<0.05；與Ket組相比，*P<0.05vs. the Con group,#P<0.05;vs. the Ket group,*P<0.05圖3 五組幼鼠樹突棘密度和長度比較(n=3)Fig 3 Comparison of density and length of mediated dendritic spines of 5 groups of immature rats (n=3)

2.3 銀杏二萜內酯葡胺對氯胺酮麻醉后幼鼠海馬區(qū)神經元fEPSP的影響

長時程電位檢測結果見圖4。結果顯示，與Con組相比，Ket組幼鼠大腦MPP-DG通路的fEPSP斜率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Ket組相比，DG-L組幼鼠fEPSP斜率沒有改變，而DG-M與DG-H組幼鼠fEPSP斜率顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

與Con組相比，#P<0.05；與Ket組相比，*P<0.05vs. the Con group,#P<0.05;vs. the Ket group,*P<0.05圖4 五組幼鼠海馬區(qū)神經元fEPSP水平比較(n=3)Fig 4 Comparison of fEPSP levels in hippocampal neurons of of 5 groups of immature rats (n=3)

2.4 銀杏二萜內酯葡胺對氯胺酮麻醉后幼鼠海馬中BDNF、TrkB和PSD-95的影響

蛋白質印跡法結果見圖5。結果顯示，與Con組相比，Ket組幼鼠海馬組織中BDNF、TrkB和PSD-95表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Ket組相比，DG-L組幼鼠海馬組織中BDNF、TrkB和PSD-95表達沒有改變，而DG-M、DG-H組幼鼠海馬組織中BDNF、TrkB和PSD-95表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

與Con組相比，#P<0.05；與Ket組相比，*P<0.05vs. the Con group,#P<0.05;vs. the Ket group,*P<0.05圖5 五組幼鼠海馬中BDNF、TrkB和PSD-95表達比較(n=3)Fig 5 Comparison of expression of BDNF,TrkB and PSD-95 in the hippocampus of 5 groups of immature rats (n=3)

2.5 銀杏二萜內酯葡胺對氯胺酮麻醉后幼鼠海馬中caspase-3、Bax和Bcl-2的影響

蛋白質印跡法結果見圖6。結果顯示，與Con組相比，Ket組幼鼠海馬組織中cleaved-caspase-3和Bax表達顯著升高，而Bcl-2表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Ket組相比，DG-L組幼鼠海馬組織中cleaved-caspase-3和Bax表達降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且Bcl-2沒有改變；與Ket組相比，DG-M與DG-H組幼鼠海馬組織中cleaved-caspase-3和Bax表達顯著降低，而Bcl-2表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

與Con組相比，#P<0.05；與Ket組相比，*P<0.05vs. the Con group,#P<0.05;vs. the Ket group,*P<0.05圖6 五組幼鼠海馬中caspase-3、Bax和Bcl-2表達比較(n=3)Fig 6 Comparison of expression of caspase-3,Bax and Bcl-2 in the hippocampus of 5 groups of immature rats (n=3)

3 討論

Morris水迷宮是利用嚙齒類動物會游泳且厭水的特征作為驅動力，強迫其找到隱藏在水下的逃生平臺，從而逃離水環(huán)境并形成穩(wěn)定的記憶[6]。由于幼鼠入水時位置與平臺位置并無關聯(lián)，必須通過多次訓練尋找水面下的隱藏平臺，從而強化記憶。后期的空間探索測試中，撤去逃生平臺，記錄幼鼠利用外周環(huán)境尋找逃生平臺的行為，評價幼鼠空間記憶的牢固程度。本研究結果顯示，對照組幼鼠逃避潛伏期的不斷縮短，穿越平臺次數(shù)的增加，代表幼鼠逐漸牢固的空間記憶，反映了較優(yōu)的認知功能[7]。然而，氯胺酮麻醉造成幼鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，提示氯胺酮誘導中樞神經系統(tǒng)毒性，導致幼鼠出現(xiàn)不同程度的認知功能障礙。中、高劑量DG治療則有效地改善了幼鼠的認知功能。

突觸可塑性指突觸基于樹突棘結構產生的不斷變化的傳遞效能，與個體的學習和記憶能力相關，樹突棘數(shù)量、密度和長度的變化可直觀反映突觸可塑性變化[8]。哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中多數(shù)興奮性突觸位于樹突棘上，樹突棘負責接收來自興奮性突觸的輸入，對于記憶的形成和儲存至關重要[9]。在多數(shù)老齡阿爾茲海默病模型大鼠腦中，都可見明顯的樹突棘萎縮[10]。而新生幼鼠中則可見不斷豐滿與增殖的樹突棘結構[11]。本研究結果顯示，氯胺酮造成幼鼠海馬區(qū)神經元樹突棘的密度、長度較Con組顯著減少。此外，本研究結果顯示，與Ket組相比，中劑量和高劑量DG干預的幼鼠神經元樹突棘密度增加，且神經元長度顯著增長。fEPSP反映了突觸后神經信號傳遞的強度變化，被視為形成學習和記憶的神經元基礎的潛在功能機制[12]。本研究，fEPSP結果與幼鼠樹突棘密度和長度變化呈正相關，且反映了幼鼠Morris水迷宮結果。

海馬是涉及空間學習與記憶的關鍵結構[13]。BDNF與其高親和力受體TrkB在海馬內有著較高的表達，與神經發(fā)育、突觸發(fā)生和學習記憶緊密相關[14]。BDNF在發(fā)育中的嚙齒動物腦中與麻醉劑引起的神經毒性或神經元凋亡有關[15]。在發(fā)育階段或成年期大鼠腦中以基因技術編碼降低BDNF表達可能導致突觸功能障礙，降低神經可塑性，并損害記憶形成[16]。而BDNF表達升高則有助于增加興奮性突觸的數(shù)量，調節(jié)軸突形態(tài)，直接促進突觸形成，參與LTP，與學習和記憶有關[17]。在反復應激誘導的抑郁樣行為大鼠腦中，可見明顯BDNF、TrkB的mRNA和蛋白表達水平降低，造成大鼠記憶功能損傷[18]。另外，PSD-95是一種興奮性突觸后信號傳導和整合的關鍵分子，是位于中樞神經系統(tǒng)突觸后膜的特殊結構[19]。本研究中，PSD-95的表達降低與突觸數(shù)量減少或突觸丟失相關，反映了突觸信號傳遞的阻滯，影響到fEPSP水平[20]。當氯胺酮全身麻醉時，幼鼠海馬組織中BDNF、TrkB和PSD-95蛋白表達水平顯著降低，且cleaved-caspase-3和Bax表達升高，而Bcl-2表達降低。因此，氯胺酮會引起神經毒性，損害神經元發(fā)育并影響幼鼠海馬體的突觸形成，最終導致幼鼠認知功能受損。而中、高劑量DG的給藥能夠顯著上調幼鼠腦組織中BDNF、TrkB和PSD-95蛋白表達水平，抑制cleaved-caspase-3和Bax表達，促進突觸的形成。

綜上所述，在與認知功能密切相關的突觸結構中，給予DG能夠逆轉氯胺酮造成的損傷。其可能機制為通過上調BDNF、TrkB和PSD-95表達，抑制cleaved-caspase-3和Bax表達，維持樹突棘的狀態(tài)，促進突觸的形成，最終改善幼鼠的認知功能。