李 敏，郭 淼，陳 萍，翟鳳霞，孫建華，李 娜

(1.河南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450000；3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦科，廣州 510405)

原發(fā)性痛經(jīng)(primary dysmenorrhea，PD)指育齡期女性機體沒有器質(zhì)性病變的情況下，經(jīng)行前后或月經(jīng)期出現(xiàn)下腹部疼痛、墜脹，伴有腰酸或其他不適[1]。該病呈周期性反復發(fā)作，病程長，發(fā)病率高，我國痛經(jīng)發(fā)生率為33.1%，其中原發(fā)性痛經(jīng)占90%，影響了育齡期女性的生活和工作[1-2]。臨床應用當歸芍藥散治療PD的療效確切，無不良反應[3]。當歸芍藥散可調(diào)節(jié)血管舒縮物質(zhì)，抑制子宮收縮，改善子宮血供，從而發(fā)揮對PD的治療作用[4]。在網(wǎng)絡(luò)藥理學的支持下，本研究擬探究當歸芍藥散治療PD的活性物質(zhì)及活性物質(zhì)的作用靶點、作用通路，并通過分子對接方法驗證活性物質(zhì)與作用靶點的結(jié)合性，為臨床推廣應用和進一步研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 篩選當歸芍藥散活性成分及其靶點

分別以“當歸”“白芍”“川芎”“白術(shù)”“茯苓”和“澤瀉”為關(guān)鍵詞，借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)[5]查找其活性成分，篩選出符合藥動學參數(shù)口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18[6]的活性成分及相對應的靶基因，在UniProt數(shù)據(jù)庫[7]中優(yōu)化。刪除無對應靶基因的活性成分，去重，分別建立活性成分數(shù)據(jù)集和藥物靶基因數(shù)據(jù)集。

1.2 獲取PD相關(guān)疾病靶基因

在GeneCards[8]、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫[9]中檢索，獲得PD相關(guān)的疾病靶基因。去重后，建立疾病靶基因數(shù)據(jù)集。

1.3 構(gòu)建核心靶基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)

運用R軟件[10]將藥物成分靶基因和疾病靶基因進行交集，得出當歸芍藥散作用于PD的核心靶基因集，并繪制韋恩圖。將篩選得到的核心靶點集置入STRING 11.0平臺[11]，最低相互作用閾值設(shè)為>0.4，其余參數(shù)保持默認設(shè)置，獲得核心靶點相互作用關(guān)系，并運用Cytoscape軟件可視化。

1.4 構(gòu)建活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

創(chuàng)建“藥物-成分”“成分-靶點”及“疾病-靶點”關(guān)系文件，將其導入Cytoscape軟件[12]，構(gòu)建“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

將所有核心靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫[13]，設(shè)定閾值P<0.05，進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。并根據(jù)富集基因數(shù)量選擇靠前的條目，分別通過Excel軟件及R軟件將其結(jié)果可視化。

1.6 當歸芍藥散活性成分與靶點的分子對接

將PPI網(wǎng)絡(luò)中排序靠前的關(guān)鍵靶點分別與對應的活性成分進行分子對接，驗證成分-靶點之間的可能性。在PubChem數(shù)據(jù)庫中找到活性成分的化學結(jié)構(gòu)及二維結(jié)構(gòu)，在ChemOffice軟件中進行三維化及優(yōu)化，并在AutoDockTools軟件中轉(zhuǎn)化成pdbqt格式。通過PDB數(shù)據(jù)庫獲取靶蛋白的結(jié)構(gòu)、化學結(jié)構(gòu)，利用PyMOL軟件刪除水分子，并在AutoDockTools軟件中添加氫離子、轉(zhuǎn)化成pdbqt格式等預處理。最終在AutoDockTools軟件中實現(xiàn)vina對接，得到分子對接得分數(shù)據(jù)，并在PyMOL軟件實現(xiàn)可視化。

2 結(jié)果

2.1 當歸芍藥散活性成分及其靶點的獲取與篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)相應條件篩選、去重后，最終得出54個藥物的有效活性成分及100個藥物靶點基因。

2.2 PD疾病靶點的獲取與PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在2個疾病基因數(shù)據(jù)庫中收集疾病的致病靶點，獲得406個PD相關(guān)的疾病靶點。將其與100個藥物成分靶點通過R軟件繪制韋恩圖(見圖1)，兩者取交集后，獲得共同核心靶點23個。將當歸芍藥散與PD相關(guān)的23個核心靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫獲取的相互作用關(guān)系，再借助Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)圖共包括節(jié)點23個，邊90個；圖中度值越大則顏色越深，位置越靠近圓的中心。結(jié)果提示，藥物成分-疾病共同核心靶點中度值最高的6個關(guān)鍵節(jié)點為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、雌激素受體1(ESR1)、蛋白激酶B1(Akt1)、芳基烴受體(AHR)、孕激素受體(PGR)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)和胱天蛋白酶3(CASP3)。

圖1 當歸芍藥散活性成分-PD靶點韋恩圖Fig 1 Venn diagram of Danggui Shaoyao powder active components-PD targets

圖2 當歸芍藥散治療PD核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 PPI network of core targets of Danggui Shaoyao powder in the treatment of PD

2.3 當歸芍藥散治療PD的活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)拓撲圖構(gòu)建

應用Cytoscape軟件構(gòu)建當歸芍藥散中活性成分-作用靶點共表達的網(wǎng)絡(luò)拓撲圖(見圖3)，該網(wǎng)絡(luò)圖共包括節(jié)點42個，邊57條；23個方形節(jié)點代表作用靶點，19個圓形節(jié)點代表當歸芍藥散作用于PD的有效活性成分。其中，山柰酚(MOL000422，kaempferol)、β-谷甾醇(MOL000358，beta-sitosterol)、楊梅酮(MOL002135，myricanone)和豆甾醇(MOL000449，stigmasterol)等與靶基因連線最多，為主要的活性成分。

圖3 當歸芍藥散作用于PD的活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Active components-targets network of Danggui Shaoyao powder in the treatment of PD

2.4 當歸芍藥散治療PD核心靶點GO功能富集分析

GO功能富集分析中，根據(jù)富集基因數(shù)目，分別在生物過程、細胞組分及分子功能3個方面共篩選出12個GO生物過程條目，見圖4。柱狀圖居上者為系列1，表示該條目Count值；居下者為系列2，表示該條目基因數(shù)目占所有基因總數(shù)的比例。生物過程功能包括序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、棕色脂肪細胞分化、細胞氧化劑解毒和血壓調(diào)節(jié)；細胞組分中的定位包括線粒體、細胞溶質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體；分子功能包括血紅素結(jié)合、鐵離子結(jié)合、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性和核心啟動子序列特異性DNA結(jié)合。

圖4 當歸芍藥散治療PD核心靶點GO功能富集分析柱狀圖Fig 4 Histogram of GO enrichment analysis of core targets of Danggui Shaoyao powder in the treatment of PD

2.5 KEGG通路富集分析當歸芍藥散治療PD的通路

根據(jù)富集基因數(shù)量，選擇前20條通路進行氣泡圖展示，見圖5。由圖可見，當歸芍藥散治療PD的KEGG富集通路主要有絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路、鈣信號通路和核因子κB(NF-κB)信號通路等?？梢?，當歸芍藥散可通過調(diào)節(jié)多條通路發(fā)揮治療PD的作用。

圖5 當歸芍藥散治療PD的KEGG通路富集分析圖(前20條通路)Fig 5 KEGG enrichment analysis of Danggui Shaoyao powder in the treatment of PD (top 20 pathways)

2.6 分子對接驗證結(jié)果

利用AutoDockTools軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)中排序居前6位的關(guān)鍵靶點與相應的活性成分進行分子對接后，得到對接的自由能，見表1。其中山柰酚與PTGS2的結(jié)合的自由能最小，山柰酚與PTGS2結(jié)合后呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，見圖6。

圖6 山柰酚與PTGS2的分子對接圖Fig 6 Molecular docking diagram of kaempferol and PTGS2

表1 當歸芍藥散有效化合物與作用靶蛋白的對接結(jié)果Tab 1 Docking results of effective compounds of Danggui Shaoyao powder and target proteins

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對當歸芍藥散治療PD的作用機制進行了較為系統(tǒng)的分析，結(jié)果顯示，共篩選出19個潛在活性成分，其中當歸芍藥散的主要活性成分包括山柰酚、β-谷甾醇、楊梅酮和豆甾醇等。PD的發(fā)生是由于月經(jīng)來潮時，子宮內(nèi)膜前列腺素(PG)在炎癥刺激下，經(jīng)一系列合成酶促代謝反應產(chǎn)生并釋放PGF2α[14]。生理狀態(tài)下，PGF2α在大部分細胞中處于沉默狀態(tài)，當機體出現(xiàn)炎癥反應時，PGF2α活性顯著表達。環(huán)氧合酶2(COX-2)是PGF2α合成步驟的關(guān)鍵酶[15]。研究結(jié)果表明，在炎癥反應中，山柰酚可以使轉(zhuǎn)錄因子(STAT3)和NF-κB失活，以此減弱白細胞介素(IL)6誘導的THP-1細胞中COX-2的表達[16]；通過降低NF-κB p65、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)α水平發(fā)揮抗炎作用，緩解小鼠神經(jīng)根疼痛[17]。β-谷甾醇、豆甾醇對脂多糖誘導的單核巨噬細胞(RAW264.7)具有抗炎作用。研究結(jié)果表明，植物甾醇類化合物均能減輕脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥反應，抑制細胞吞噬功能、TNF-α釋放、COX-2和p-ERK的表達和活性[18]。其中，β-谷甾醇的抗炎活性高于豆甾醇。楊梅酮對炎癥反應中的細胞因子具有調(diào)節(jié)作用，通過抑制巨噬細胞中的NF-κB和STAT1活化及誘導出血紅素加氧酶1(HO-1)的抗炎活性[19]。另有研究結(jié)果顯示，在脂多糖誘導的炎癥模型中，楊梅素能顯著降低諸多細胞炎癥因子的活性[20]。以上說明，當歸芍藥散的主要有效活性成分通過抑制炎癥反應，下調(diào)COX-2的表達水平，抑制PGF2α活性，達到緩解經(jīng)期疼痛的作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，當歸芍藥散治療PD是通過多靶點實現(xiàn)的。袁立明等[21]發(fā)現(xiàn)，PD大鼠子宮平滑肌中COX-2表達水平上調(diào)，表明PD是一種炎癥反應過程。性激素參與PD的發(fā)病。國內(nèi)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌激素水平與痛經(jīng)的疼痛程度呈正相關(guān)關(guān)系，孕激素水平則呈負相關(guān)關(guān)系[22]。即雌激素升高促進PG的合成與釋放，從而促使平滑肌痙攣，孕激素則與之表現(xiàn)出拮抗的作用。進一步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者相應的受體，即ESR、PGR也參與了PD病理的發(fā)生[23]。通過降低ESR mRNA水平，提高PGR mRNA水平，可緩解子宮平滑肌痙攣，從而發(fā)揮治療作用。分子對接結(jié)果亦顯示，山柰酚與靶基因COX-2結(jié)合較為穩(wěn)定。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，當歸芍藥散治療PD是通過多條信號通路作用的，其中MAPK信號通路、NF-κB信號通路和鈣信號通路等相關(guān)研究較多。NF-κB信號通路中的NF-κB因子是一種炎癥反應及免疫表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)控COX-2的表達與活性[24]。唐文靜等[25]發(fā)現(xiàn)，PD大鼠中NF-κB的磷酸化水平升高，以此活化COX-2調(diào)控PGF2α的合成和分泌。當歸芍藥散可以通過抑制NF-κB信號通路，抑制炎癥反應，發(fā)揮抗炎免疫作用，以此達到緩解疼痛的效果[26]。MAPK信號通路是細胞內(nèi)外信號傳遞的信使通路，MAPK被應激刺激激活后，其磷酸化級聯(lián)反應可觸發(fā)下游多種轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，影響生物信號傳遞，促進子宮平滑肌收縮[27]。細胞內(nèi)鈣離子的釋放或細胞外鈣離子的內(nèi)流參與子宮平滑肌的收縮[28-29]。關(guān)于GO功能富集方面，主要集中在序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、分子功能包括血紅素結(jié)合、鐵離子結(jié)合、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性和核心啟動子序列特異性DNA結(jié)合等方面，上述生物學過程和功能體現(xiàn)在復方藥物活性成分調(diào)節(jié)對應靶點和具體通路過程中。

綜上所述，當歸芍藥散治療PD具有多成分、多靶點、多通路的作用特點，本研究結(jié)果探討了當歸芍藥散的基本藥理學作用和相關(guān)機制，并為進一步的基礎(chǔ)研究奠定了良好基礎(chǔ)。