謝朋飛，陳元璐，崔宏娣，龍 輝，張永東#，侯思雨，周 燕，周長欣，王本偉

(1.郴州市第一人民醫(yī)院Ⅰ期臨床研究室，湖南 郴州 423000；2.山西蘭花藥業(yè)股份有限公司研發(fā)部，山西 高平 048402；3.安徽萬邦醫(yī)藥科技股份有限公司臨床部，合肥 230601；4.山東安捷生物檢測技術(shù)有限公司生物分析部，濟(jì)南 250101)

瑞舒伐他汀鈣片是臨床使用較為廣泛的他汀類藥物，其調(diào)節(jié)血脂療效確切、耐受性良好，且具有改善心功能、抑制炎癥反應(yīng)及穩(wěn)定或逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊結(jié)構(gòu)等作用，能夠降低心血管不良事件的風(fēng)險(xiǎn)性[1-3]。本研究旨在建立人血漿中瑞舒伐他汀濃度的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)測定方法，研究瑞舒伐他汀鈣片2種制劑在我國健康受試者中的藥動(dòng)學(xué)特征及安全性，并評(píng)價(jià)其生物等效性，為藥物注冊(cè)和合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

島津Nexera X2液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；AB Triple Quad 5500質(zhì)譜儀(美國AB公司)；XSE 105DU十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)處理軟件。

1.2 藥品與試劑

受試藥物(T藥)：瑞舒伐他汀鈣片(山西蘭花藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為20180803，規(guī)格為10 mg/片)；參比藥物(R藥)：瑞舒伐他汀鈣片(美國IPR Pharmaceuticals,Inc.公司，分包裝批準(zhǔn)文號(hào)為國藥準(zhǔn)字J20170008，批號(hào)為134595，規(guī)格為10 mg/片)。瑞舒伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，純度為98.4%，批號(hào)為101028-201803)；內(nèi)標(biāo)(加拿大TLC Pharmaceutical Standards Ltd.公司，Rosuvastatin-d6，化學(xué)純度為98.9%，批號(hào)為1324-016A1)。

1.3 受試者資料來源

本研究總體設(shè)計(jì)為單中心、隨機(jī)、開放、兩周期、雙交叉、單次給藥試驗(yàn)，清洗期為7 d。經(jīng)郴州市第一人民醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批件號(hào)：第2019009號(hào))。受試者均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18周歲的健康男女受試者，無內(nèi)分泌、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病史或現(xiàn)有上述系統(tǒng)疾病，無食物、藥物等過敏史，無藥物濫用及毒品使用史，無煙酒等不良嗜好，試驗(yàn)前28 d內(nèi)未使用過任何影響肝臟對(duì)藥物代謝的藥物或食物，試驗(yàn)前3個(gè)月內(nèi)無獻(xiàn)血或大量失血及未參加過其他臨床研究；生命體征、體格檢查及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查、心電圖檢查、妊娠檢查(僅女性)、藥物濫用篩查和酒精呼氣檢查等結(jié)果均正?；虍惓o臨床意義。

將60例健康受試者隨機(jī)分為空腹組和餐后組，各30例?？崭菇M受試者中，男性22例，女性8例；平均年齡(27.60±7.17)歲；平均身高(165.02±7.16) cm；平均體重(58.97±6.01) kg；平均體重指數(shù)(BMI)(21.68±1.96) kg/m2。餐后組受試者中，男性24例，女性6例；平均年齡(29.20±8.44)歲；平均身高(164.47±6.69) cm；平均體重(60.16±8.18) kg；平均BMI(22.16±1.83) kg/m2。

2 方法與結(jié)果

2.1 研究設(shè)計(jì)與樣本采集

空腹組、餐后組受試者均按篩選號(hào)順序以1 ∶ 1的比例隨機(jī)分配至2個(gè)給藥序列組(R-T組/T-R組)之一。給藥方法：空腹或進(jìn)食高脂餐后30 min以240 mL溫水送服瑞舒伐他汀鈣片受試藥物或參比藥物1片(10 mg)，給藥前禁食至少 10 h，給藥前及給藥后1 h內(nèi)禁水，給藥后4 h進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)午餐、10 h后進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)晚餐，每周期用餐一致。

空腹組受試者分別于給藥前0 h(給藥前60 min內(nèi))及給藥后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、24.0、48.0和72.0 h采集藥代血樣；餐后組受試者分別于給藥前0 h(進(jìn)食高脂餐前30 min內(nèi))及給藥后0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、10.0、12.0、24.0、48.0和72.0 h采集藥代血樣。每次取靜脈血約4 mL至K2EDTA采血管中(血樣采集全程避光操作，采集后置于冰水浴中暫存)，于1 h內(nèi)完成離心(離心條件：離心溫度2～8 ℃，離心力2 000 g，離心轉(zhuǎn)速2 792 r/min，離心時(shí)間10 min)，離心結(jié)束后分離出上層血漿，并于 2 h內(nèi)置于超低溫冰箱(-60 ℃及以下)中儲(chǔ)存待測。

2.2 血漿樣本處理與測定條件

2.2.1 色譜條件：分析柱為Waters X BridgeTMC18柱(5 μm，2.1 mm×50 mm)；以0.1%甲酸為流動(dòng)相A、含0.1%甲酸的甲醇溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫(洗脫程序?yàn)?～0.3 min,45%A；1.5～2.0 min，5%A；2.1～3.0 min，45%A)；流速為0.6 mL/min；柱溫為40.0 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為8 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件：電噴霧離子化源(ESI源)，選擇正離子條件檢測，多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式；瑞舒伐他汀用于定量分析離子對(duì)為m/z482.4→258.3，瑞舒伐他汀-d6(內(nèi)標(biāo))用于定量分析離子對(duì)為m/z488.4→264.2。離子源參數(shù)設(shè)置如下，噴霧電壓為5.5 kV，氣簾氣為35 psi，霧化氣為60 psi，輔助加熱氣為60 psi，離子源溫度550 ℃，入口電壓為10 V。

2.2.3 血漿樣品處理：精密吸取待測血漿樣品200 μL，加入穩(wěn)定劑[1%乙酸溶液(V/V)]200 μL，渦旋混勻，吸取200 μL酸化后的樣本，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液(20 ng/mL 瑞舒伐他汀-d6)20 μL和乙酸乙酯1 mL，渦旋混勻，16 500 g離心5 min后取800 μL上清液加入96孔板，氮?dú)獯蹈桑眉状?水(V∶V=50 ∶ 50)溶液200 μL復(fù)溶，1 000 r/min搖勻15 min，3 210 g離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

瑞舒伐他汀血藥濃度數(shù)據(jù)采用PhoenixTMWinNonLin?(8.1版本)處理，使用非房室模型擬合法進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的估算分析。主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)達(dá)峰濃度(Cmax)、零時(shí)間到最終采血點(diǎn)的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0-t)和零時(shí)間到無限大時(shí)間的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0-∞)經(jīng)過自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析、雙單側(cè)t檢驗(yàn)和90%置信區(qū)間(CI)分析，以判定瑞舒伐他汀受試藥物與參比藥物在空腹和餐后狀態(tài)下的生物等效性；藥動(dòng)學(xué)參數(shù)達(dá)峰時(shí)間(tmax)經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)(Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn))，以評(píng)價(jià)受試藥物與參比藥物的差異。

2.4 方法學(xué)考察與評(píng)價(jià)

2.4.1 專屬性考察：取不同來源空白血漿6份，分別進(jìn)行空白樣品測定和在最低定量下限濃度水平的添加內(nèi)標(biāo)實(shí)驗(yàn)?？瞻谆|(zhì)樣品中，內(nèi)源性物質(zhì)峰面積不超過瑞舒伐他汀最低定量下限峰面積的20%，不超過內(nèi)標(biāo)峰面積的5%，結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物及內(nèi)標(biāo)的測定，本方法專屬性良好，見圖1。

A.空白血漿樣品；B.最低定量下限血漿樣品(瑞舒伐他汀0.1 ng/mL)和內(nèi)標(biāo)；C.標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液樣品(瑞舒伐他汀2.0 ng/mL)和內(nèi)標(biāo)；Ⅰ.瑞舒伐他汀(m/z=482.4/258.3)；Ⅱ.瑞舒伐他汀-d6(m/z=488.4/264.2)A.blank plasma;B.lower limit of quantification plasma (rosuvastatin:0.1 ng/mL) and internal standard;C.standard curve working solution (rosuvastatin:2.0 ng/mL) and internal standard;Ⅰ.rosuvastatin(m/z=482.4/258.3);Ⅱ.rosuvastatin-d6(m/z=488.4/264.2)圖1 人血漿中瑞舒伐他汀和內(nèi)標(biāo)瑞舒伐他汀-d6的色譜圖Fig 1 Chromatogram of determination of rosuvastatin and rosuvastatin-d6 in human plasma

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限：取空白基質(zhì)配制9個(gè)濃度水平標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(瑞舒伐他汀血漿濃度水平為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和25.0 ng/mL)，按“2.2.3”項(xiàng)下處理標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品后進(jìn)樣分析，建立瑞舒伐他汀的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測物瑞舒伐他汀色譜響應(yīng)值(As)與內(nèi)標(biāo)色譜響應(yīng)值(Ai)的比值Y(即Y=As/Ai)為縱坐標(biāo)，以系列濃度水平標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品中瑞舒伐他汀濃度X為橫坐標(biāo)，用加權(quán)(1/χ2)最小二乘法進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，其回歸方程為Y=2.34X×10-1+1.26×10-3(R2=0.998 7)，瑞舒伐他汀線性范圍為0.1～25.0 ng/mL，最低定量下限為0.1 ng/mL。

2.4.3 精密度與回收率：取空白基質(zhì)配制4個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品(瑞舒伐他汀濃度分別為 0.1、0.3、3.0和18.0 ng/mL)考察批內(nèi)及批間精密度與準(zhǔn)確度。各質(zhì)控樣品按“2.2.3”項(xiàng)下處理后進(jìn)樣分析，每個(gè)質(zhì)量濃度處理6份，連續(xù)測定3 d，根據(jù)分析批內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)控樣品的測得濃度，根據(jù)質(zhì)控樣品結(jié)果計(jì)算本法日內(nèi)及日間精密度的RSD。以質(zhì)量濃度為 0.3、3.0和18.0 ng/mL的質(zhì)控樣品，通過比較正常處理(未提取基質(zhì))質(zhì)控樣品中待測物或內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值與提取后加入待測物、內(nèi)標(biāo)的雙空白樣品的響應(yīng)值來評(píng)價(jià)本法回收率。瑞舒伐他汀在人血漿中的精密度和回收率見表1。

表1 瑞舒伐他汀在人血漿中的精密度和回收率(n=6)Tab 1 Precision and recovery of rosuvastatin in human plasma (n=6)

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)：使用6個(gè)不同來源的空白基質(zhì)、模擬的溶血血漿及高脂血漿基質(zhì)制備低(LQC，0.3 ng/mL)、高(HQC，18.0 ng/mL)2個(gè)質(zhì)量濃度的瑞舒伐他汀質(zhì)控樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下處理后進(jìn)樣分析；另同時(shí)配制含有一定量待測物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤?最終濃度分別與低、高濃度質(zhì)控樣品的進(jìn)樣濃度一致)進(jìn)樣分析；每個(gè)濃度水平平行處理6份樣品，測定各樣品待測物及內(nèi)標(biāo)色譜響應(yīng)值，分別計(jì)算空白基質(zhì)、模擬的溶血血漿及高脂血漿基質(zhì)樣品中待測物和內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子。結(jié)果顯示，空白基質(zhì)中2個(gè)質(zhì)量濃度經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子均值為100.62%～102.14%，變異系數(shù)≤1.65%；溶血基質(zhì)中，LQC基質(zhì)效應(yīng)的CV值為2.3%，HQC基質(zhì)效應(yīng)的CV值為1.6%；高脂基質(zhì)中，LQC基質(zhì)效應(yīng)的CV值為4.8%，HQC基質(zhì)效應(yīng)的CV值為1.9%；均≤15.0%。上述結(jié)果表明，溶血基質(zhì)、高脂血基質(zhì)均不影響血漿中瑞舒伐他汀的測定，基質(zhì)效應(yīng)符合生物樣品分析要求。

2.4.5 穩(wěn)定性：配制含瑞舒伐他汀的低、高2個(gè)質(zhì)量濃度全血和血漿質(zhì)控樣本，每個(gè)濃度水平平行處理6份樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下處理后進(jìn)樣分析，考察各樣品在不同儲(chǔ)存環(huán)境下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，2個(gè)質(zhì)量濃度全血質(zhì)控樣品于冰水浴條件下放置1 h穩(wěn)定；血漿質(zhì)控樣本于室溫(25 ℃)下放置 47 h、-25 ℃/-80 ℃條件下冰凍保存76 d及-80 ℃至室溫凍融循環(huán)4次穩(wěn)定性均良好；制備后樣本于室溫條件下放置46.5 h、2～8 ℃條件下放置43.5 h、自動(dòng)進(jìn)樣器(8 ℃)放置45 h穩(wěn)定性均良好。

2.5 平均血藥濃度-時(shí)間曲線

A.空腹組(n=30)；B.餐后組(n=30)A.fasting group (n=30);B.postprandial group (n=30)圖2 血漿中瑞舒伐他汀的平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of rosuvastatin in plasma

采用Phoenix WinNonLin 8.1軟件對(duì)瑞舒伐他汀鈣片血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并繪制血藥濃度-時(shí)間曲線。空腹及餐后給藥條件下分別有30例受試者口服參比藥物(商品名：CRESTOR?)和受試藥物瑞舒伐他汀鈣片，其血漿中瑞舒伐他汀的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2，2種制劑體內(nèi)藥-時(shí)曲線變化趨勢基本一致，兩者體內(nèi)過程相似。

2.6 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

空腹給藥條件下，單劑量口服受試藥物瑞舒伐他汀鈣片10 mg后有30例受試者的血藥濃度數(shù)據(jù)納入藥動(dòng)學(xué)參數(shù)集(PKPS)，口服參比藥物后有29例受試者(其中1例受試者第2周期入住期主動(dòng)退出試驗(yàn)，未服用R藥)納入PKPS；餐后給藥條件下分別有30例受試者單劑量口服受試藥物或參比藥物，無脫落情況，其血藥濃度數(shù)據(jù)均納入PKPS?？崭购筒秃蠼o藥條件下，瑞舒伐他汀鈣片受試藥物吸收速度、程度與參比藥物基本一致，見表2。

表2 瑞舒伐他汀鈣片受試藥物和參比藥物的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab 2 Main pharmacokmetic parameters of rosuvastatin in healthy Chinese subjects

2.7 生物等效性評(píng)價(jià)

空腹給藥條件下單劑量口服受試藥物后有30例受試者納入生物等效性分析集(BES)，口服參比藥物后共有29例受試者納入BES；餐后給藥條件下分別有30例受試者單劑量口服受試藥物和參比藥物，均納入BES。受試者口服受試藥物和參比藥物后瑞舒伐他汀主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0～72 h和AUC0-∞經(jīng)自然對(duì)數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后其幾何均數(shù)比值(T/R)的90%CI統(tǒng)計(jì)結(jié)果均在可接受的80.00%～125.00%等效范圍內(nèi)，且在給藥序列、給藥周期及制劑間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；受試藥物和參比藥物瑞舒伐他汀的tmax經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)(Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn))后均無顯著性差異(P>0.05) ，見表3。

表3 空腹和餐后條件下瑞舒伐他汀鈣片受試藥物和參比藥物的生物等效性結(jié)果Tab 3 Bioequivalence results of Rosuvastatin calcium tablets and reference drugs under fasting and postprandial conditions

2.8 安全性評(píng)價(jià)

本試驗(yàn)空腹組和餐后組分別有30例受試者納入安全性分析集?？崭菇M共觀察到5例受試者(占16.67%)發(fā)生8例次不良事件，其中受試藥物組有4例受試者發(fā)生5例次、參比藥物組有2例受試者發(fā)生3例次不良事件；餐后組共有9例受試者(占30.00%)發(fā)生10例次不良事件，其中受試藥物組有6例受試者發(fā)生7例次、參比藥物組有3例受試者發(fā)生3例次不良事件報(bào)告。不良事件主要為三酰甘油、尿酸、尿白細(xì)胞、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平升高，口腔黏膜炎和上呼吸道感染等，嚴(yán)重程度均為Ⅰ級(jí)(NCI CTCAE 5.0)。本研究中未發(fā)生嚴(yán)重不良事件，無受試者因不良事件脫落；所有不良事件除因失訪轉(zhuǎn)歸情況未知外，其余均恢復(fù)正?；虍惓o臨床意義。本研究受試藥物與參比藥物不良事件發(fā)生情況總體相似，受試者在本試驗(yàn)給藥劑量下安全性和耐受性良好。

3 討論

國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的血漿中瑞舒伐他汀測定方法較多，如蛋白沉淀法、固相萃取技術(shù)和液-液萃取法等[4-10]。本研究基于文獻(xiàn)報(bào)道，考察了操作簡單、成本低廉的蛋白沉淀法，結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀在血漿中游離濃度較低，常規(guī)蛋白沉淀方法基質(zhì)效應(yīng)較大，而固相萃取法操作繁瑣、成本相對(duì)較高。本研究以1%乙酸為穩(wěn)定劑，采用乙酸乙酯萃取法處理血漿樣本，基質(zhì)效應(yīng)、精密度及回收率等均符合驗(yàn)證接受標(biāo)準(zhǔn)；以穩(wěn)定同位素標(biāo)記瑞舒伐他汀-d6為內(nèi)標(biāo)，其理化性質(zhì)、色譜保留行為和離子化行為與待測物一致，可避免基質(zhì)效應(yīng)、回收率等對(duì)檢測結(jié)果的影響。本方法穩(wěn)定可靠，專屬性、準(zhǔn)確度、精密度及回收率等均符合《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》和《化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》等相關(guān)指導(dǎo)原則中生物樣品分析方法的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。

瑞舒伐他汀具有較高的肝攝取率和遺傳多態(tài)性，其藥動(dòng)學(xué)行為在不同人群及種族中差異較大，不同研究的結(jié)果也有所差別[4，11]。本研究中，我國健康受試者口服瑞舒伐他汀鈣片10 mg后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0～72 h和AUC0-∞與曹瑩等[10]的研究結(jié)果一致，而較部分文獻(xiàn)報(bào)道明顯偏低，可能與瑞舒伐他汀藥動(dòng)學(xué)行為個(gè)體內(nèi)變異較大、采血點(diǎn)/采血時(shí)間設(shè)計(jì)不同以及納入的受試者例數(shù)和人口學(xué)資料差異等因素相關(guān)，提示臨床應(yīng)用應(yīng)注意個(gè)體化給藥[5,8-9]。本研究中，空腹組受試者主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0～72 h和AUC0-∞均明顯高于餐后組(餐后組Cmax相較于空腹組降低>45%)，可能原因系餐后食物及胃排空延緩影響藥物吸收，提示臨床實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意飲食對(duì)藥物有效性和安全性的影響[10,12]。本研究結(jié)果顯示，空腹及餐后單次給藥條件下，受試藥物的吸收速度、吸收程度與參比藥物(瑞舒伐他汀鈣片，商品名：CESTOR?)基本一致，兩制劑具有生物等效性。