李佳珣， 張秋香， 唐 鑫， 毛丙永， 崔樹茂， 趙建新，張 灝， 陳 衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院， 江蘇 無錫 214122)

齲齒是較常見的口腔疾病之一，細(xì)菌和真菌共同參與牙菌斑生物被膜的形成是齲齒的始動因子。變異鏈球菌是齲齒的主要致病菌，具有很強的代謝蔗糖產(chǎn)酸并形成致齲性生物被膜的能力，是生物被膜形成過程早期的主要定植菌。它通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system，PTS)代謝膳食中可發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸，并合成胞外多糖和胞外蛋白質(zhì)從而啟動生物被膜結(jié)構(gòu)的形成[1],其中，PtxA蛋白可能對該菌生長代謝具有關(guān)鍵性作用[2]。近年來臨床研究又發(fā)現(xiàn)白色念珠菌參與了齲齒的進(jìn)程，2種菌相互作用會形成致齲性更強的生物被膜[3-4]。白色念珠菌可以耐受高酸性環(huán)境并產(chǎn)生高水平的有機酸，顯著降低局部環(huán)境的pH值，促進(jìn)牙釉質(zhì)脫礦[5]。其中，果糖二磷酸醛縮酶(Fba)是白色念珠菌中含量最豐富的可溶性蛋白之一，是糖酵解中的關(guān)鍵酶，在白色念珠菌能量代謝中起重要作用[6]。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)[7-8],食用植物乳桿菌CCFM8724可以預(yù)防兒童齲齒，該益生菌可產(chǎn)生多種代謝物來抑制生物被膜的形成，其中，環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽、3-苯乳酸、苯丙酸三者具有較好的抑制雙菌生物被膜形成的效果。Bello等[9]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌產(chǎn)生的環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽和環(huán)苯丙氨酸脯氨酸二肽可以抑制枯萎鐮刀菌的生長，Zhao等[10]研究表明植物乳桿菌ZZUA493產(chǎn)生的3-苯乳酸、乳酸、醋酸抑制霉菌生長，延長饅頭保質(zhì)期。目前有關(guān)口腔益生菌產(chǎn)品的研究多數(shù)集中在益生菌的效果評價上，而對益生菌產(chǎn)生的物質(zhì)作用效果和機制方面的研究鮮有報道。本研究以環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽、3-苯乳酸、苯丙酸作為組合物，探究組合物對雙菌生物被膜形成、胞外多糖和胞外蛋白產(chǎn)量、群體感應(yīng)系統(tǒng)及生物被膜結(jié)構(gòu)的影響，最后通過分子對接的方式探究小分子代謝物結(jié)合于致病菌靶點的方式和構(gòu)象，希望為植物乳桿菌CCFM8724及其組合物開發(fā)口腔益生菌和后生元產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌CCFM8724、哈維氏弧菌BB170，保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心；變異鏈球菌ATCC25175、白色念珠菌ATCC18804，中國普通微生物菌種保藏管理中心，現(xiàn)保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心。

結(jié)晶紫、甲醇、冰醋酸、苯酚、二甲基亞砜、硫酸，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BCA試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；康寧96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，南通市海之星實驗器材有限公司；2216E培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽，南京萊昂生物科技有限公司；3-苯乳酸，上海沃凱生物技術(shù)有限公司；苯丙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

TSB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨17.0、酵母粉6.0、氯化鈉5.0、大豆蛋白胨3.0、葡萄糖2.5、磷酸氫二鉀2.5，pH值7.0～7.4。YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20、葡萄糖20、酵母粉10。MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0、牛肉膏10.0、胰蛋白胨10.0、酵母粉5.0、無水乙酸鈉5.0、檸檬酸氫二銨2.0、磷酸氫二鉀2.0、硫酸鎂0.58、硫酸錳0.25、吐溫80 1.0 mL，pH值調(diào)整至6.2～6.4。這3種培養(yǎng)基115 ℃高壓滅菌20 min。AB培養(yǎng)基(mol/L)：NaCl 0.3、Mg2SO40.05，酸水解酪蛋白0.2 g，115 ℃高壓滅菌20 min后加入10 mL 1 mol/L的無菌磷酸鉀緩沖液、10 mL 0.1 mol/L的無菌精氨酸溶液和20 mL體積分?jǐn)?shù)為50%無菌甘油。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiscan Go型全波長酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；Centrifuge 5424R型臺式冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司；Quanta200型掃描電鏡(SEM)，荷蘭Fei公司。

1.3 實驗方法

1.3.1菌株的培養(yǎng)

取出-80 ℃保藏的植物乳桿菌CCFM8724及變異鏈球菌ATCC25175，以2%的接種量分別接種于5 mL的MRS液體培養(yǎng)基和TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。白色念珠菌ATCC18804接種于YPD液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h。哈維氏弧菌BB170接種于2216E培養(yǎng)基，30 ℃搖床培養(yǎng)18 h?；罨?代后用于后續(xù)實驗。

為培養(yǎng)雙菌生物被膜，活化后的變異鏈球菌和白色念珠菌分別接種于質(zhì)量濃度為0.1 g/L蔗糖的TSB液體培養(yǎng)基和YPD液體培養(yǎng)基中，使變異鏈球菌和白色念珠菌菌懸液濃度約為107、106CFU/mL。

1.3.2植物乳桿菌發(fā)酵上清液和組合物的制備

植物乳桿菌CCFM8724的過夜培養(yǎng)液于4 ℃以6 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm的濾膜過濾除菌后置于4 ℃冰箱備用。3-苯乳酸、苯丙酸和環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽分別為200.0、200.0、50.0 μg/mL進(jìn)行復(fù)配，隨后用0.22 μm的濾膜過濾除菌后得到組合物。

1.3.3生物被膜量測定

采用結(jié)晶紫染色法測定生物被膜量。在96孔板中分別加入變異鏈球菌、白色念珠菌菌懸液各75 μL，隨后將復(fù)配組合物以棋盤稀釋法加入孔板中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。陰性對照組以同等體積的體積分?jǐn)?shù)為5%的二甲基亞砜水溶液代替，陽性對照組以植物乳桿菌CCFM8724上清液代替。培養(yǎng)結(jié)束后去除培養(yǎng)液，用1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)小心清洗生物被膜2遍，室溫靜置晾干。向每孔中加入100 μL甲醇以固定生物被膜，10 min后除去甲醇，自然晾干，加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的結(jié)晶紫溶液，將生物被膜染色30 min。染色結(jié)束后用PBS清洗2遍，每孔以100 μL體積分?jǐn)?shù)為33%的冰醋酸溶解，用酶標(biāo)儀讀取600 nm處的吸光度。每組平行測定6次。

1.3.4胞外多糖產(chǎn)量測定

采用苯酚硫酸法測定胞外多糖產(chǎn)量。生物被膜培養(yǎng)方法同1.3.3，培養(yǎng)結(jié)束后用PBS仔細(xì)沖洗，再用100 μL的PBS將生物被膜洗脫，收集到1.5 mL離心管內(nèi)，12 000 r/min離心10 min后棄上清，重復(fù)洗3遍，確保除去水溶性多糖。用500 μL 1.0 mol/L氫氧化鈉在37 ℃下攪拌2 h提取水不溶性多糖[11]。12 000 r/min離心10 min取上清液，把水不溶性多糖的堿提液轉(zhuǎn)移到裝有1 mL體積分?jǐn)?shù)為6%苯酚的試管中,再加濃硫酸5 mL，室溫靜置30 min，在490 nm處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算胞外多糖含量[12]。

1.3.5胞外蛋白產(chǎn)量測定

使用BCA試劑盒測定胞外蛋白產(chǎn)量。生物被膜培養(yǎng)方法同1.3.3節(jié)，培養(yǎng)結(jié)束后用PBS仔細(xì)沖洗，再用100 μL的PBS將生物被膜洗脫，收集到1.5 mL離心管內(nèi)，加入適量的小磁珠，預(yù)冷條件下以高通量組織破碎儀破碎。高通量組織破碎儀參數(shù)設(shè)置為破碎45 s，停15 s，循環(huán)10次。破碎后12 000 r/min離心10 min取上清液。按BCA試劑盒的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測，于96孔板中每孔加入200 μL工作液，再加入20 μL上清液，置于37 ℃反應(yīng)30 min，在562 nm處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算胞外蛋白含量。

1.3.6群體感應(yīng)信號分子AI- 2產(chǎn)量測定

采用哈維氏弧菌BB170生物發(fā)光法檢測組合物對變異鏈球菌和白色念珠菌種間的自誘導(dǎo)分子(AI- 2)活性的影響[13]。在24孔板中加入變異鏈球菌和白色念珠菌菌懸液各375 μL，再加入250 μL組合物，陰性對照組以同等體積的體積分?jǐn)?shù)為5%的二甲基亞砜水溶液代替，陽性對照組以植物乳桿菌CCFM8724上清液代替。培養(yǎng)24 h后，收集、過濾獲得無菌上清液，備用?；罨蟮墓S氏弧菌BB170接種于AB培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，調(diào)節(jié)菌液OD600為0.8左右，再用無菌新鮮AB培養(yǎng)基按體積比1∶2 000稀釋該菌液，混勻備用。按體積比1∶50將植物乳桿菌發(fā)酵上清液與哈維氏弧菌BB170稀釋菌懸液混合。30℃、100 r/min搖瓶培養(yǎng)5 h，避光條件下吸取200 μL于黑色不透明酶標(biāo)板中，以多功能酶標(biāo)儀于500 nm處檢測哈維氏弧菌BB170化學(xué)發(fā)光情況。

1.3.7生物被膜結(jié)構(gòu)觀察

在6孔板放置無菌蓋玻片，加入致病菌各1.5 mL，然后加入3-苯乳酸、苯丙酸和環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽使它們的終質(zhì)量濃度分別為200.0、200.0、50.0 μg/mL，雙菌生物被膜培養(yǎng)24 h后，取出蓋玻片，后用1 mL的體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定1 h，PBS沖洗后用乙醇(體積分?jǐn)?shù)10%、25%、50%、75%、90%)梯度脫水，各個體積分?jǐn)?shù)分別脫水20 min。隨后，將蓋玻片浸入體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇中1 h，在室溫下干燥1 d。將蓋玻片轉(zhuǎn)移到銅樁上噴金(160 s、40 mA)后進(jìn)行掃描電鏡觀察[14]。

1.3.8化合物作用方式探究

分別將變異鏈球菌的PtxA 蛋白和白色念珠菌的Fba蛋白設(shè)置為分子對接受體，代謝物環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽、3-苯乳酸、苯丙酸設(shè)置為分子對接配體。使用軟件Pymol對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理，刪除溶劑分子，使用AutoDock 4軟件計算格點能地圖并進(jìn)行分子對接，使用Open Babel軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)和配體分子格式的轉(zhuǎn)換，使用Seesar軟件對分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化處理[15-16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析使用Graphpad Prism 8.4.3、R studio 4.0.1、SPSS軟件，使用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，P<0.05表示具有顯著性差異。使用Graphpad Prism 8.4.3、配置了R包 ggplot2和ggsci的R studio 4.0.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 組合物對雙菌生物被膜形成的影響

牙菌斑生物被膜的形成是齲齒發(fā)生的先決條件，本研究采用結(jié)晶紫染色法探究具有顯著抑制生物被膜形成效果的組合物對變異鏈球菌和白色念珠菌雙菌生物被膜形成的影響，結(jié)果見圖1。在終質(zhì)量濃度分別為0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL時，采用棋盤稀釋法對3-苯乳酸、苯丙酸、環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽進(jìn)行復(fù)配。當(dāng)3-苯乳酸和環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽質(zhì)量濃度分別為200.0、50.0 μg/mL，苯丙酸和環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽質(zhì)量濃度分別為200.0、50.0 μg/mL，或3-苯乳酸和苯丙酸質(zhì)量濃度分別為200.0、200.0 μg/mL時，觀察到較強生物被膜抑制效果。因此，選擇3-苯乳酸、苯丙酸和環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽質(zhì)量濃度分別為200.0、200.0、50.0 μg/mL進(jìn)行復(fù)配，檢測3種物質(zhì)的組合物對雙菌生物被膜的抑制效果。由圖1(d)可知，3-苯乳酸、苯丙酸和環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽組合物顯著抑制雙菌生物被膜的形成，生物被膜與陰性對照組相比減少了79.4%，效果與陽性對照組植物乳桿菌發(fā)酵液(73.9%)類似。Strom等[17]研究表明：植物乳桿菌MiLAB393產(chǎn)生的環(huán)肽(L-Phe-L-Pro)和3-苯乳酸可協(xié)同抑制鐮刀菌、煙曲霉等真菌生長，最低抑菌濃度(MIC)分別為7.5、20.0 mg/mL。

黑色圓點由小到大表示生物膜形成量逐漸增大，*表示與陰性對照組差異顯著(P<0.05)。圖1 不同質(zhì)量濃度組合物對雙菌生物被膜形成的影響Fig.1 Effect of compositions of different mass concentrates on dual-species biofilm formation

2.2 組合物對雙菌生物被膜胞外基質(zhì)的影響

除結(jié)晶紫染色法確定生物被膜量外，生物被膜中的大分子物質(zhì)的檢測也是生物被膜研究中的重要指標(biāo)。水不溶性胞外多糖和胞外蛋白是生物被膜基質(zhì)的重要組成成分，是構(gòu)成生物被膜三維立體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子[18-19]。通過苯酚硫酸法和BCA蛋白測定法測定了組合物對生物被膜中的胞外多糖和胞外蛋白產(chǎn)量的影響，見圖2。結(jié)果表明，組合物達(dá)到了與陽性對照組同等的效果，與陰性對照組相比胞外多糖的產(chǎn)量減少了63.8%，胞外蛋白的產(chǎn)量減少了60.2%，因此組合物阻斷了胞外聚合物的產(chǎn)生，減少了生物被膜的形成，這也與結(jié)晶紫染色法觀察到生物膜量顯著降低的結(jié)果一致。Chen等[20]用苯酚硫酸法和福林- 酚試劑法測定了食源性致病菌副溶血性弧菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌單菌生物膜和雙菌生物膜形成時的胞外多糖和胞外蛋白，結(jié)果表明雙菌生物膜的胞外基質(zhì)含量高于單菌生物膜。

*表示與陰性對照組差異顯著(P<0.05)。圖2 組合物對雙菌生物被膜胞外基質(zhì)的抑制Fig.2 Inhibition of extracellular matrix of dual-species biofilm by compositions

2.3 組合物對雙菌群體感應(yīng)的影響

通過群體感應(yīng)調(diào)控分析也可以從另一個角度反映生物被膜的形成?？谇画h(huán)境復(fù)雜，通常為多菌共生，且不同菌種間通過信號分子傳遞信息，相互調(diào)節(jié)[21]。致齲菌形成的牙菌斑生物被膜與群體感應(yīng)信號分子的調(diào)控密切相關(guān)，其中廣泛存在于各微生物種間交流的AI- 2信號分子在微生物相互交流中起著重要作用[22]。本研究通過哈維氏弧菌BB170生物發(fā)光法檢測組合物對變異鏈球菌和白色念珠菌種間的自誘導(dǎo)分子AI- 2活性的影響，見圖3。結(jié)果表明：組合物顯著減少了種間AI- 2信號分子的產(chǎn)生(減少率80.7%)，效果與發(fā)酵液相近，說明組合物可以通過影響變異鏈球菌和白色念珠菌之間的群體感應(yīng)進(jìn)而影響生物被膜的形成。Nahar等[23]采用生物發(fā)光法發(fā)現(xiàn)風(fēng)味酶具有群體感應(yīng)淬滅活性，可以顯著減少鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌AI- 2信號的產(chǎn)生，并抑制生物膜形成。

*表示與陰性對照組差異顯著(P<0.05)。圖3 組合物對雙菌群體感應(yīng)信號分子AI- 2 產(chǎn)生的抑制Fig.3 Inhibition of dual-species microbe quorum sensing signal molecule AI- 2 production by compositions

2.4 組合物對生物被膜結(jié)構(gòu)的影響

成熟的生物被膜是由大量的胞外聚合物，如胞外多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)組成的三維立體結(jié)構(gòu)，具有高倍成像的掃描電子顯微鏡是觀察生物被膜形成和胞外基質(zhì)的絕佳工具，在生物被膜結(jié)構(gòu)研究中被廣泛應(yīng)用[24-25]。通過掃描電鏡對生物被膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，見圖4。陰性對照組生物被膜結(jié)構(gòu)致密，具有一定厚度，呈明顯的起伏波浪狀；而植物乳桿菌CCFM8724和組合物組合干預(yù)后，生物被膜結(jié)構(gòu)被明顯破碎，在放大20 000倍下可以觀察到明顯的內(nèi)陷，生物被膜變得疏松，且基質(zhì)厚度明顯減少，生理活性受到影響。Krzyciak等[26]在掃描電鏡下觀察了唾液乳桿菌對變異鏈球菌和白色念珠菌生物被膜結(jié)構(gòu)的影響，也觀察到了生物被膜厚度顯著減少，結(jié)構(gòu)松散。

圖4 掃描電鏡觀察組合物對生物被膜結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of compositions on dual-species biofilm structure observed by scanning electron microscopy

2.5 雙菌生物被膜抑制機理分析

為進(jìn)一步探究組合物抑制雙菌生物被膜生成的可能作用機理，將3種代謝物與變異鏈球菌PtxA蛋白、白色念珠菌Fba蛋白分別進(jìn)行分子對接分析，結(jié)果見圖5。變異鏈球菌中吸收并磷酸化抗壞血酸的PtxA蛋白可能對該菌能在接近無氧的口腔環(huán)境中旺盛生長具有關(guān)鍵性作用[2]。由PtxA基因編碼的PtxA蛋白是PTS中的抗壞血酸家族的重要組成，它與變異鏈球菌抗壞血酸代謝過程相關(guān)，對該蛋白質(zhì)的三維晶體結(jié)構(gòu)解析和體外酶活實驗也證明PtxA蛋白對抗壞血酸磷酸化具有特異性[27]。使用AutoDock軟件進(jìn)行簇分析時，默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)為2.0 ?。將分子對接產(chǎn)生的10個對接結(jié)果按照結(jié)合能大小排序，找出結(jié)合能最小的構(gòu)象結(jié)果，如圖5(a)～圖5(c)，并將構(gòu)象相近的對接結(jié)果結(jié)合成簇。PtxA蛋白與環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽、3-苯乳酸、苯丙酸的成簇分析結(jié)果如圖5(d)～圖5(f)。3個體系最優(yōu)勢簇占據(jù)絕對優(yōu)勢，表明結(jié)果收斂性較好。PtxA蛋白與3-苯乳酸、苯丙酸的結(jié)合能相差不大，分別為-22.0、-21.8 kJ/mol，PtxA蛋白與環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽的結(jié)合能相對較弱，為-16.3 kJ/mol。

圖5 3種代謝物與變異鏈球菌PtxA蛋白分子對接結(jié)果Fig.5 Molecular docking results of three metabolites with Streptococcus mutans PtxA protein

3種代謝物和白色念珠菌Fba蛋白分子對接分析結(jié)果見圖6。將分子對接產(chǎn)生的10個對接結(jié)果按照結(jié)合能大小排序，找出結(jié)合能最小的構(gòu)象結(jié)果，如圖6(a)～圖6(c)，并將構(gòu)象相近的對接結(jié)果結(jié)合成簇。Fba蛋白與環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽、3-苯乳酸、苯丙酸的成簇分析結(jié)果如圖6(d)～圖6(f)。3個體系最優(yōu)勢簇占據(jù)絕對優(yōu)勢，表明結(jié)果收斂性較好。Fba蛋白與3-苯乳酸、苯丙酸的結(jié)合能相差不大，分別為-17.7、-18.5 kJ/mol，而Fba蛋白與環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽的結(jié)合能相對較強，為-23.1 kJ/mol。因此，環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽、3-苯乳酸、苯丙酸可以通過分子間相互作用力、范德華力、氫鍵等相互作用方式結(jié)合到變異鏈球菌和白色念珠菌的靶點蛋白上，從而發(fā)揮干預(yù)糖代謝，影響二者生物被膜形成的作用。

圖6 3種代謝物與白色念珠菌Fba蛋白分子對接結(jié)果Fig.6 Molecular docking results of three metabolites with Candida albicans Fba protein

3 結(jié) 論

本研究揭示了環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽、3-苯乳酸、苯丙酸的組合物能夠減少變異鏈球菌和白色念珠菌雙菌生物被膜量、水不溶性胞外多糖及胞外蛋白產(chǎn)量、群體感應(yīng)信號分子AI- 2產(chǎn)量，同時破壞生物被膜結(jié)構(gòu)。分子對接結(jié)果從分子水平上揭示了組合物可能的作用機理，組合物可以與變異鏈球菌PtxA蛋白和白色念珠菌Fba蛋白靶點結(jié)合，其中，環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽和白色念珠菌Fba蛋白具有較強的結(jié)合能力，而3-苯乳酸、苯丙酸與變異鏈球菌PtxA蛋白具有較強的結(jié)合能力，組合物與致病菌上的靶點蛋白結(jié)合進(jìn)而影響其糖代謝，抑制二者形成生物被膜。本研究旨在為植物乳桿菌CCFM8724及其代謝物環(huán)亮氨酸脯氨酸二肽、3-苯乳酸、苯丙酸開發(fā)防齲的口腔益生菌和后生元產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。