麥彩園 王 斌

1 廣東省婦幼保健院產(chǎn)科，廣東省廣州市 510010； 2 佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)為一類多能干細(xì)胞，在成骨和代謝中有明顯的促進(jìn)作用[1]。胎盤是一種容易獲得MSCs的來(lái)源，PMSCs已經(jīng)證實(shí)與骨MSCs具有幾乎相同的功能[2]。LRP5、β-catenin、Runx2、OPG、RANKL是Wnt/β-catenin、OPG/RANKL通路的關(guān)鍵因子。LRP5、β-catenin、Runx2是Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵的成骨因子[3]。OPG、RANKL是OPG/RANKL通路關(guān)鍵的破骨因子[4]。本文取人胎盤，培養(yǎng)PBMC，傳代，注射于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨折端。RT-qPCR檢測(cè)LRP5、β-catenin、Runx2、OPG、RANKL因子在大鼠骨髓腔的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 儀器與實(shí)試劑 培養(yǎng)基、膠原酶Ⅰ型、DNase Ⅰ、PercoⅡ液：Sigma公司，美國(guó)。FCS、TrypLE、胰酶：Bio-Rad公司，英國(guó)。qPCR試劑盒、引物：Takara公司，中國(guó)。流式細(xì)胞儀、培養(yǎng)箱、PCR檢測(cè)系統(tǒng)：Bio-Rad公司，美國(guó)。

1.2 研究對(duì)象 研究方案遵照赫爾辛斯基宣言有關(guān)規(guī)定，經(jīng)佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院的臨床試驗(yàn)及動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)，病人知情并同意。本研究選擇2021年1—12月在三水區(qū)人民醫(yī)院招募的足月生產(chǎn)婦女，取得胎盤10例。Sprague-Dawley(SD)大鼠購(gòu)自廣州賽業(yè)生物有限公司。

1.3 PMSCs獲取 取足月生產(chǎn)胎盤，排出臍帶血，拋棄臍帶和外膜。將胎盤組織(包括羊膜、絨毛膜和胎盤)解剖成約5g大小的碎片(總共300g)。將該組織置于燒杯中并用500ml HBSS/100g組織洗滌。然后將胎盤片以約10g/管平均分配。將低糖培養(yǎng)基與100U/ml膠原酶Ⅰ型和5μg/ml DNase I添加到每個(gè)試管中，總體積為50ml。將試管在振蕩器上孵育(220r/min，37℃，2h)，然后以540g脈沖離心以去除大顆粒物質(zhì)，并使細(xì)胞懸浮液通過(guò)70μm過(guò)濾器。剩余的組織用HBSS洗滌，得到的細(xì)胞懸液也通過(guò)70μm過(guò)濾器過(guò)濾。將合并的過(guò)濾細(xì)胞離心(540g，5min，20℃)并重新懸浮在30ml HBSS中，并在12ml 1.073g/ml PercollTM下鋪墊。將樣品離心(540g，20℃，20min)，取出界面并用HBSS洗滌2次(第一次在540g，20℃，10min，第二次在300g，20℃，5min)。然后將單核細(xì)胞以(2～4)×105個(gè)細(xì)胞/cm2接種在組織培養(yǎng)瓶中進(jìn)行離體擴(kuò)增。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將骨髓或胎盤細(xì)胞接種到25或75cm2組織培養(yǎng)瓶中。標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基含有20%(v/v)的FCS和50μg/ml慶大霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。非熱滅活FCS用于所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)物在加濕的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每周更換2次。在擴(kuò)增培養(yǎng)物中通過(guò)塑料黏附分離細(xì)胞，3d后將非黏附細(xì)胞從培養(yǎng)物中洗掉。

細(xì)胞培養(yǎng)物在90%～95%濃度時(shí)進(jìn)行傳代。燒瓶用HBSS洗滌并與TrypLETMSelect在37℃下孵育5～10min。去除解離的細(xì)胞，然后離心(540g，5min，4℃)沉淀。棄去上清液并將細(xì)胞重懸于組織培養(yǎng)基中。在第1代，每個(gè)實(shí)驗(yàn)將MSCs接種到三個(gè)重復(fù)的燒瓶中。從第2代開始，將細(xì)胞從一個(gè)燒瓶中接種到另一個(gè)燒瓶中。

1.5 鑒定胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞 取第3代培養(yǎng)的干細(xì)胞，以0.25%濃度的胰酶消化3min后制成單細(xì)胞懸液，加入CD90、CD44、CD34、CD45抗體表達(dá)單克隆抗體，冰上反應(yīng)20min，PBS洗2次后離心5min(4℃，1 000r/min)，棄上清，加入2ml PBS將其吹打混勻，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物。

1.6 構(gòu)建去卵巢骨質(zhì)疏松模型

1.6.1 模型建立：從廣州賽業(yè)生物有限公司購(gòu)買雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠[重(280±20)g]。將所有大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)在透明塑料籠中，在受控的光照下(12h光照/黑暗周期)，溫度(25±2)℃和濕度(50±10)%。老鼠可以自由獲取食物和水。

1.6.2 分組標(biāo)準(zhǔn)：適應(yīng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、骨質(zhì)疏松組、干細(xì)胞組。骨質(zhì)疏松組、干細(xì)胞組大鼠腹腔注射7%水合氯醛5ml/kg，麻醉成功后，先固定老鼠。然后以第12根肋骨的后部為中心將毛剃光。消毒后，切開3cm長(zhǎng)的縱向切口，仔細(xì)剝離皮膚和筋膜，然后暴露卵巢。接下來(lái)，結(jié)扎卵巢下方的輸卵管，并切除兩個(gè)卵巢。最后，沖洗切口后，縫合并包裹皮膚。對(duì)照組不摘除卵巢，僅行假手術(shù)，切開皮膚再予以縫合。

1.6.3 模型處理：進(jìn)行常規(guī)術(shù)后護(hù)理和飲食。術(shù)后8周，所有大鼠行擺鋸開放式小腿截骨制作骨折并取骨髓3ml，然后予以克氏針固定。用注射器吸取PMSCs并注射于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨折端及髓腔。骨髓行RT-qPCR檢測(cè)LRP5、β-catenin、Runx2、OPG、RANKL的水平。

1.6.4 后續(xù)處理：繼續(xù)常規(guī)護(hù)理和飲食。1個(gè)月后處死全部大鼠并開放骨折部位觀察并取骨髓3ml，RT-qPCR檢測(cè)LRP5、β-catenin、Runx2、OPG、RANKL的水平。

1.7 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 用Trizol試劑分離來(lái)自大鼠股骨的總RNA。RNA的在260/280nm處進(jìn)行吸收測(cè)量，證實(shí)達(dá)到PCR的要求。用cDNA合成試劑盒合成cDNA。使用ABI 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR。相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法計(jì)算，GAPDH作內(nèi)參對(duì)照。引物由Takara公司設(shè)計(jì)的，引物序列5’to 3’:LRP5-F：CCTGGCGCTGTGACGGCTTCC,LRP5-R：CAATGGC GCTGCTGTGGGCTGGTA;Runx2-F:GAACCCACGGCCCTCCCTGAACTC，Runx2-R:AGCGGCGTGGTGGAATGGATGGAT;β-catenin-F:TGGTGGGCTGCAGAAAATGGTT，β-catenin-R:ACGATGGCCGGCTTGTTGC;OPG-F：TCCTGGCACCTACCTAAAACAGCA,OPG-R:CTACACTTCTGCATTCACTTTGG;RANKL-F：CCATCGGGTTCCATAAAGTAGT,RANKL-R：AAAGCCCCAAAGTACGTCGCATCT;β-actin-F：CACCCGCGAGTACAACCTTC，β-actin-R：CCCATACCCACCATCACACC。所有測(cè)定均重復(fù)3次。

1.8 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及觀察指標(biāo) 取人胎盤，培養(yǎng)PMSCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代PMSCs。建立大鼠骨折模型，隨機(jī)分為三組：對(duì)照組(假手術(shù)未去卵巢)、骨質(zhì)疏松組(去卵巢骨質(zhì)疏松)、干細(xì)胞組(去卵巢骨質(zhì)疏松+干細(xì)胞治療：用注射器吸取PMSCs并注射于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨折端及髓腔)。于大鼠小腿取骨髓，行克氏針內(nèi)固定，檢測(cè)LRP5、β-catenin、Runx2、OPG、RANKL因子在大鼠骨髓腔的表達(dá)。1個(gè)月后處死動(dòng)物，骨折處骨髓再次檢測(cè)以上因子的表達(dá)。比較骨折時(shí)與1個(gè)月后各因子的變化，以及比較各組間的水平。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 流式細(xì)胞儀顯示，第3代PMSCs高表達(dá)CD44、CD90，而CD34、CD45呈陰性表達(dá)。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞具備干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，可證實(shí)為胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代PMSCs

2.2 因子LRP5、β-catenin、Runx2、OPG、RANKL在骨折端骨髓的變化

2.2.1 骨折時(shí)骨質(zhì)疏松組與干細(xì)胞組相比LRP5、β-catenin、Runx2、OPG差異不大，但與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05)；骨質(zhì)疏松組與干細(xì)胞組相比RANKL差異不大，但與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 骨折時(shí)各因子的表達(dá)

2.2.2 術(shù)后1個(gè)月與骨折時(shí)相比，對(duì)照組各指標(biāo)變化不大，而骨質(zhì)疏松組、干細(xì)胞組LRP5、β-catenin、Runx2、OPG明顯增加，RANKL明顯下降，差異明顯(P<0.05)。見圖3。術(shù)后1個(gè)月與對(duì)照組、骨質(zhì)疏松組相比，干細(xì)胞組LRP5、β-catenin、Runx2、OPG明顯上升，且RANKL明顯下降，差異明顯(P<0.05)。見圖3。

圖3 術(shù)后1個(gè)月各因子的表達(dá)

3 討論

骨髓是人類MSCs的傳統(tǒng)來(lái)源，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有增殖特性，它能促進(jìn)缺損修復(fù)，而且可通過(guò)基因修飾的方式表達(dá)治療因子，遷移并發(fā)揮治療作用[5]。MSCs在細(xì)胞治療方面比許多其他細(xì)胞類型具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兙哂忻庖咛貦?quán)，即使在大型動(dòng)物中，通常也可以跨越主要組織相容性復(fù)合體(MHC)屏障進(jìn)行移植，而無(wú)須免疫抑制[6]。人類MSCs是由多種組織和器官產(chǎn)生的，包括胎盤、臍帶血、羊膜、羊水、脂肪、肺和肝臟[7]。大多數(shù)骨髓等組織來(lái)源的Msc，比較難以獲取，相比之下，胎盤組織很容易獲得。胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的成骨能力[8-9]。

體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的PMSCs用軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，可以分化為軟骨細(xì)胞，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射后軟骨細(xì)胞均有修復(fù)，效果優(yōu)于玻璃酸鈉腔內(nèi)注射治療[10]。PMSCs可能通過(guò)調(diào)控炎癥因子水平，進(jìn)而減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)軟骨破壞[11]。

在Wnt/β-catenin通路中，LRP5存在于細(xì)胞膜表面，Wnt與LRP5/6結(jié)合形成復(fù)合體，抑制β-catenin的磷酸化。未磷酸化的β-catenin積累進(jìn)入到細(xì)胞核和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合激活下游靶基因Runx2，LRP5、β-catenin、Runx2是互相促進(jìn)的引起成骨的基因[12]。

OPG/RANKL通路包括:RANKL-核因子κβ活化受體配體、RANK-NF-κβ活化受體、OPG-RANKL的假性受體骨保護(hù)素。OPG與RANKL有著高親和力，能競(jìng)爭(zhēng)RANKL和RANK間的互相作用，抑制破骨細(xì)胞[13]。RANKL是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)僅有的促進(jìn)OC分化、阻止OC凋亡的因子[14]。

骨折時(shí)骨質(zhì)疏松組與干細(xì)胞組相比LRP5、β-catenin、Runx2、OPG差異不大，但與對(duì)照組相比明顯降低；骨質(zhì)疏松組與干細(xì)胞組相比RANKL差異不大，但與對(duì)照組相比明顯升高。說(shuō)明LRP5、β-catenin、Runx2、OPG為成骨因子，RANKL為破骨因子，與前結(jié)論一致。術(shù)后1個(gè)月與骨折時(shí)相比，對(duì)照組各指標(biāo)變化不大，而骨質(zhì)疏松組、干細(xì)胞組LRP5、β-catenin、Runx2、OPG明顯增加，RANKL明顯下降。說(shuō)明在骨折生長(zhǎng)過(guò)程中，成骨因子的增強(qiáng)，破骨因子的減弱。術(shù)后1個(gè)月與對(duì)照組、骨質(zhì)疏松組相比，干細(xì)胞組LRP5、β-catenin、Runx2、OPG明顯上升，RANKL明顯下降。說(shuō)明PMSCs明顯地促進(jìn)了成骨，同時(shí)減少了破骨。

總之，Wnt/β-catenin、OPG/RANKL通路中成骨因子LRP5、β-catenin、Runx2、OPG在骨質(zhì)疏松中下降，破骨因子RANKL在骨質(zhì)疏松中上升。PMSCs可引起LRP5、β-catenin、Runx2、OPG在骨質(zhì)疏松中上升，RANKL在骨質(zhì)疏松中下降。PMSCs通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin、OPG/RANKL通路的關(guān)鍵因子促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折成骨，促進(jìn)生長(zhǎng)。我們可以進(jìn)一步研究PMSCs預(yù)防骨質(zhì)疏松和治療骨質(zhì)疏松性骨折。