沈鑒東，謝佳孜，吳畏，蔡令波，汪道武，劉嘉茵，刁飛揚

不孕不育門診常見的染色體異常包括結構異常和數(shù)目異常，其中結構異常主要包括染色體相互易位、羅氏易位和倒位等，因其可導致染色體不平衡配子的產(chǎn)生，可導致不孕、反復自然流產(chǎn)和胎兒畸形等不良妊娠結局，臨床上可以通過植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）來降低不良妊娠風險[1]。不孕不育人群中染色體數(shù)目異常主要涉及性染色體的非整倍體，常見的有45,X、47,XXX、47,XXY和47,XYY等，在新生兒中發(fā)生率約為1/420[2]。這類性染色體異?；颊咴跍p數(shù)分裂產(chǎn)生配子的過程中理論上會導致胚胎性染色體異常比例升高，但是實際發(fā)生率并不高，且與染色體非整倍體類型有關[1,3]。本研究回顧性分析既往南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科（本中心）伴有性染色體異常的夫婦行PGT的治療周期中胚胎染色體異常情況及性染色體異常占比，探討此類人群中PGT的臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象2015年1月—2021年12月本中心收治了夫婦雙方之一攜帶有性染色體非整倍體且選擇PGT助孕的23對夫婦，共24個促排卵周期，其中包括男性47,XYY及其嵌合體6例，男性47,XXY及其嵌合體2例，均伴有嚴重少、弱精子癥；女性47,XXX 4例，女性45,X嵌合體8例（9個促排卵周期），女性X染色體節(jié)段性缺失3例（其中1例涉及X和Y染色體片段重組）。見表1。

1.2 卵巢刺激、胚胎培養(yǎng)及活檢、胚胎移植采用臨床常規(guī)促排卵方案，當超聲監(jiān)測成熟卵泡（直徑≥16 mm）數(shù)量達到4枚及以上時，或者主導卵泡群已達到成熟大?。ㄖ睆健?6 mm）時，皮下注射人絨毛膜促性腺激素6 500 U（艾澤，默克雪蘭諾公司，德國），36～37 h后經(jīng)陰道超聲引導下穿刺取卵。卵子置于通用體外受精培養(yǎng)液（Origio公司，丹麥）中3 h，拆除顆粒細胞，選擇MⅡ期卵子進行卵細胞質內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），受 精 后 卵 子 置 于Quinn’s卵裂期培養(yǎng)液（Sage公司，美國）中，在濕化37℃三氣培養(yǎng)箱（5%CO2，5%O2和90%N2）中孵育至第3天。利用激光破膜儀（MTG公司，德國）在受精后第3天（D3）胚胎透明帶上打孔，直徑約30μm，后改用Quinn’s囊胚培養(yǎng)液（Sage公司，美國）培養(yǎng)至D5或D6囊胚形成。D5或D6囊胚采用直徑35μm活檢針（Humagen公司，美國）活檢滋養(yǎng)外胚層細胞（4～10個），胚胎活檢后即采用玻璃化冷凍技術（玻璃化冷凍、解凍試劑盒，Kitazato Biophama公司，日本）進行胚胎冷凍保存，待胚胎檢測結果擇期復蘇移植，每個移植周期移植1枚囊胚。

1.3 胚胎檢測活檢細胞采用核酸擴增試劑盒（SurePlex Kit，Illumina公司，美國）進行全基因組擴增，然后采用基于二代測序（next generation sequencing，NGS）技術的染色體拷貝數(shù)分析，采用VeriSeq-MiSeq Kit（Illumina公司，美國）制備文庫，在MiSeq測序平臺（MiSeqDx Universal Kit V3 SBS，美國）上進行全基因組低深度測序。下機數(shù)據(jù)采用云平臺分析（PGXCloud，網(wǎng)址為www.pgxcloud.com），生物信息分析算法原理同先前的報道[4]。其中染色體異常比例＜20%報告為整倍體，異常比例在20%～80%報告為嵌合體，異常比例＞80%報告為非整倍體。

1.4 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計2021年6月前復蘇移植周期的臨床結局，復蘇周期移植結局包括未孕、自然流產(chǎn)和活產(chǎn)。臨床妊娠指胚胎移植后B超見宮內妊娠囊。活產(chǎn)率=活產(chǎn)數(shù)/移植周期數(shù)×100%，自然流產(chǎn)率=自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。嵌合體胚胎移植后均行羊水穿刺產(chǎn)前診斷，均未見異常?；純撼錾箅娫掚S訪患兒一般健康情況。

2 結果

23對性染色體異常夫婦的24個促排卵周期，共獲得可檢測囊胚77枚，明確診斷76枚（98.70%），其中40枚（52.63%）為整倍體可移植胚胎，13枚（17.10%）為嵌合體胚胎，23枚（30.26%）為非整倍體不可移植胚胎。6個周期因為患者個人原因，沒有返院移植。18個復蘇移植周期獲得9例（50.00%）健康活產(chǎn)，見表2。

表2 活檢周期胚胎檢測結果及復蘇移植結局

2.1 47,XYY及其嵌合體在6例47,XYY及其嵌合體治療周期中，男性患者均有嚴重少、弱精子癥，共檢測20枚囊胚，均明確診斷，其中13枚整倍體胚胎和1枚嵌合體胚胎，異常不可移植胚胎6枚，異常率為30.00%（6/20），且沒有發(fā)現(xiàn)性染色體異常胚胎。有1例患者因為個人因素，沒有返院移植。5個復蘇移植周期中獲得4例健康活產(chǎn)。

2.2 47,XXY及其嵌合體在2例47,XXY及其嵌合體中，共檢測5枚囊胚，均明確診斷，其中3枚整倍體胚胎和1枚嵌合體非整倍體，異常不可移植移植胚胎為1枚，異常率為20.00%（1/5），無性染色體異常胚胎。2個復蘇移植周期未獲得活產(chǎn)。

2.3 47,XXX在4例47,XXX治療周期中，共檢測14枚囊胚，均明確診斷，其中9枚整倍體胚胎和3枚嵌合體非整倍體，異常不可移植胚胎為2枚，異常率為14.29%（2/14），其中性染色體非整倍體嵌合體2例。4個復蘇移植周期中獲得3例健康活產(chǎn)。

2.4 45,X嵌合體在8例45,X嵌合體患者的9個促排卵周期中共檢測32枚囊胚，31枚明確診斷，其中13枚整倍體胚胎和7枚嵌合體非整倍體，異常不可移植胚胎為11枚，異常率為35.48%（11/31），其中1個異常胚胎合并有X染色體非整倍體嵌合體。6個復蘇移植周期僅獲得1例健康活產(chǎn)。

2.5 X染色體節(jié)段性缺失女性在3例女性X染色體節(jié)段性缺失治療周期中，共檢測6枚囊胚，均明確診斷，其中2枚整倍體胚胎和1枚嵌合體非整倍體，異常不可移植胚胎為3枚，異常率為50.00%（3/6），異常胚胎均表現(xiàn)為母源X染色體節(jié)段性缺失，見圖1。1個復蘇周期移植1枚非整倍體嵌合體胚胎，獲得1例健康活產(chǎn)。

圖1 X染色體節(jié)段性缺失女性PGT異常胚胎結果圖

3 討論

3.1 PGT的適應證及其臨床價值從1990年首次報道以來，PGT已廣泛應用于染色體異常、單基因病生育風險的預防[5]。2017年，歐洲人類生殖和胚胎學會等國際組織聯(lián)合發(fā)布聲明，建議將PGT的名稱根據(jù)應用指征不同分為：染色體結構異常PGT（PGT for structure rearrangement，PGT-SR）、單基因病PGT（PGT for monogenic disease，PGT-M）和非整倍體篩查PGT（PGT for aneuploidy，PGT-A）[6]。其中PGT-A應用于胚胎植入前非整倍體篩查，以期提高臨床體外受精-胚胎移植治療的臨床妊娠率，但是目前存在較大爭議性[7-8]。近些年，高通量遺傳檢測技術，如染色體微陣列分析、二代測序等用于PGT，顯著改善了PGT胚胎檢測的準確性和效率，本文筆者所在團隊也較早就在國內開展了基于高通量遺傳檢測技術的PGT，并取得了理想的妊娠結局[9-11]。對于性染色體異常夫婦的胚胎性染色體異常比例以及PGT的應用文獻報道不多，2018年《胚胎植入前遺傳學診斷/篩查專家共識》[1]對性染色體異常是否行PGT給予一定的建議，但是對于不同類型的性染色體異常夫婦胚胎的性染色體異常發(fā)生率，相關直接證據(jù)較少，不同類型性染色體異常后代出現(xiàn)性染色體異常的風險也存在差異，本研究回顧性分析本中心既往性染色體異常夫婦PGT的胚胎染色體檢測結果以及妊娠結局，對性染色體異常夫婦性染色體異常配子或胚胎淘汰機制及臨床遺傳咨詢具有一定參考意義。

3.2 47,XYY綜合征患者的生育風險47,XYY綜合征在男性新生兒中的發(fā)生率約為1∶1 000。一般來說，47,XYY綜合征表型存在變異，可能具有的表現(xiàn)包括行為異常風險增加、輕微學習困難、語言發(fā)育遲緩和身材高大等[12]。采用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）分析47,XYY綜合征男性患者精子及卵裂胚發(fā)現(xiàn)，性染色體異常比例均較46,XY正常男性增加[13]，支持可對47,XYY綜合征患者實施PGT。而本研究5例患者的20枚囊胚均未發(fā)現(xiàn)性染色體異常，這提示47,XYY綜合征患者性染色體異常胚胎可能在囊胚形成前被淘汰。實際上47,XYY綜合征患者后代染色體異常發(fā)生率不足1%[14-15]。因此，中華醫(yī)學會男科學分會建議47,XYY綜合征男性患者的生育治療按常規(guī)處理[3]。

3.3 47,XXX綜合征患者的生育風險47,XXX綜合征即X三體綜合征，在女性中的發(fā)病率約為1∶1 000，患者表型較輕微或者沒有明顯異常表型，所以估計實際診斷的患者僅占10%[16]?；颊邒胗變浩谡Z言發(fā)育可落后于同齡兒，輕微的學習困難，平均智商相對于普通人群低約20分，身體特征包括身材常較高，內眥贅皮，肌張力減退和第五指彎曲等。此外，卵巢早衰、精神行為異常也較普通人群更常見[17]。雖然也有研究報道47,XXX女性生育的后代出現(xiàn)性染色體異常，但是一般認為發(fā)生風險不足1%；但是，47,XXX嵌合體女性生育性染色體異常后代的風險比染色體正常女性增加[16]。本研究中4例47,XXX患者夫婦中有1例患者卵巢功能減退（AMH=0.36 ng/mL），其他3例患者卵巢功能正常，共檢測14枚囊胚，其中2枚涉及X染色體和Y染色體的非整倍體嵌合體，這2枚胚胎均涉及多條染色體的非整倍體嵌合體，推測其可能是受精后胚胎細胞有絲分裂過程錯誤所致。

3.4 47,XXY綜合征患者的生育風險47,XXY綜合征即Klinefelter綜合征，在男性新生兒中的發(fā)病率約為1∶600～1∶500[18]。典型的臨床表型包括身材高、男性乳房女性化、睪丸小等，表型具有異質性，有些患者表型不典型[19]。95%～99%的患者由于生殖細胞的丟失和輸精管的透明樣變性而導致男性不育。ICSI技術誕生后，發(fā)現(xiàn)43%的47,XXY綜合征患者可以通過傳統(tǒng)睪丸穿刺（c-TESE）獲得精子，而45%的患者可以通過顯微睪丸精子提?。╩-TESE）獲得精子，通過TESE-ICSI可以獲得約50%的活產(chǎn)率[20]。通過FISH技術對47,XXY綜合征患者精液進行分析發(fā)現(xiàn)，正常精子比例從50%到93.7%不等[21]。有很多研究報道47,XXY男性通過ICSI助孕獲得了染色體正常的后代[21]，但是也有研究報道47,XXY男性的后代仍為47,XXY[22]。在利用FISH技術的PGT中，發(fā)現(xiàn)47,XXY綜合征患者胚胎整倍體率（54.0%）顯著低于核型正常男性（77.2%）；分析性染色體發(fā)現(xiàn)，47,XXY綜合征胚胎性染色體異常率占13.2%，而核型正常男性為3.1%；并且常染色體非整倍體中具有顯著差異的是18號和21號染色體，這些都提示在47,XXY綜合征咨詢中需慎重討論生育風險，酌情選擇PGT或者產(chǎn)前診斷[21]。本研究中1例47,XXY和1例47,XXY/46,XY嵌合體，共活檢5枚囊胚，檢測結果提示未涉及性染色體異常。

3.5 45,X綜合征患者的生育風險45,X綜合征即特納綜合征（Turner syndrome），是女性最常見的性染色體異常，在新生兒中發(fā)病率約1∶1 700[23]，常由X染色體整條或者部分缺失導致，嵌合體核型也比較常見，與其表型輕重變異有關?；颊叱１憩F(xiàn)為早發(fā)性卵巢功能不全，身材矮小，也有一些患者會有復雜心血管異常表型[24]、代謝[25-26]和免疫異常[27]。文獻報道45,X綜合征的自然妊娠率可達5.6%[28]，甚至高達14%[29]。但是，45,X綜合征的妊娠并發(fā)癥顯著增加，如妊娠早期妊娠丟失、妊娠期高血壓疾病、主動脈夾層、早產(chǎn)，以及胎兒染色體異常和先天畸形等[29]。Dogˇer等[30]研究顯示，在22例45,X嵌合體的52次妊娠中，活產(chǎn)率僅占32.7%，流產(chǎn)率高達67.3%。45,X綜合征患者妊娠丟失率高的原因可能有：胎兒染色體異常風險增加[28]，雌激素過低導致子宮內膜容受性降低[31]，伴發(fā)甲狀腺自身免疫性疾病的風險高[32]。對于45,X綜合征患者生育的后代中性染色體異常比例，由于相當部分患者后代并沒有做羊水穿刺或者產(chǎn)后的染色體診斷，文獻中并沒有報道明確發(fā)生率。有研究報道X環(huán)狀染色體嵌合體母親生育X環(huán)狀染色體嵌合體后代[29]。本研究中8例45,X嵌合體的9個治療周期，共檢測32枚囊胚，僅1例患者（病例10）的1個胚胎出現(xiàn)X染色體片段缺失嵌合體改變，可能來自于受精卵形成后的有絲分裂過程。所有PGT治療周期結局并不理想，與先前文獻報道的45,X及其嵌合體臨床妊娠丟失率高的現(xiàn)象相符。所以，對此類患者進行輔助生殖技術治療前，應該充分告知其不良的妊娠結局風險。

3.6 X染色體節(jié)段性缺失女性值得注意的是，在45,X嵌合體患者中并未觀察到性染色體減數(shù)分裂錯誤導致的胚胎性染色體異常風險顯著增加，但是在3例X染色體節(jié)段性缺失的病例[der（X）t（X;Y）（p22.3;q11.2）、del（X）（p21）和del（X）（q22.3q27.1）]中，共檢測了6個囊胚，有3個胚胎均出現(xiàn)相應的X染色體節(jié)段性缺失，異常率達50.00%。共1次復蘇周期移植1枚非整倍體嵌合體胚胎，獲得健康活產(chǎn)。這提示對于X染色體節(jié)段性缺失這一特殊類型的45,X綜合征，由于著絲粒和紡錘體功能完整，異常染色體可能遵循孟德爾遺傳，生育遺傳風險較大，這組病例的胚胎中并沒有觀察到X染色體節(jié)段性缺失的男性胚胎，可能與此類男性胚胎早期致死有關，無法發(fā)育到囊胚階段。由于患者卵巢功能減退，可檢測胚胎數(shù)目較少，PGT無可移植胚胎風險高，患者夫婦助孕前需充分咨詢相關風險。

綜上所述，性染色體異常是生殖醫(yī)學門診常見的染色體異常類型，其生殖預后差異較大。47,XYY、47,XXX、47,XXY患者胚胎性染色體異常風險不高；45,X及其嵌合體的臨床妊娠結局較差，胚胎種植率低、流產(chǎn)率高；對于X染色體節(jié)段性缺失45,X綜合征患者胚胎性染色體異常風險較高，輔助生殖技術前均需要審慎咨詢相關風險。