羅曉輝，周偉寧，李怡，任叢勉，黃演林，盧建

馬蹄足內(nèi)翻（talipes equinovarus，TE）是常見(jiàn)的出生缺陷，活產(chǎn)兒中發(fā)病率為1‰～3‰，男女比為2∶1[1]。TE發(fā)病原因不明確，與神經(jīng)肌肉病變、骨骼發(fā)育異常和遺傳因素等有關(guān)，約20%的TE與染色體非整倍體、微缺失/微重復(fù)綜合征相關(guān)?？截悢?shù)變異（copy number variation，CNV）通常指＞1 kb的DNA片段的拷貝數(shù)增加或減少，染色體微陣列分析（chromosome microarray analysis，CMA）技術(shù)可以檢測(cè)大于100 kb的CNV。本研究對(duì)157例超聲提示為T(mén)E的胎兒進(jìn)行CMA檢測(cè)，旨在探討CMA技術(shù)在產(chǎn)前TE胎兒中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2016年1月—2020年7月在廣東省婦幼保健院（我院）產(chǎn)前診斷中心就診的孕婦因胎兒超聲提示TE接受介入性產(chǎn)前診斷并行CMA者157例。由我院產(chǎn)前診斷系統(tǒng)獲取病例的臨床資料。①一般資料：年齡、介入性產(chǎn)前診斷穿刺孕周、孕產(chǎn)史和臨床診斷等。②相關(guān)檢查資料：超聲檢查、CMA檢測(cè)結(jié)果等。所有孕婦均接受檢測(cè)前遺傳咨詢(xún)并簽署《CMA檢測(cè)知情同意書(shū)》，本研究已經(jīng)過(guò)院倫理委員會(huì)審核同意（倫理審批號(hào)：202201124），并且已經(jīng)取得患者的臨床資料用于科學(xué)研究的知情同意書(shū)。納入研究的TE胎兒根據(jù)是否合并其他系統(tǒng)異常，分為孤立性TE組（107例）和復(fù)雜性TE組（50例）2組，孤立性TE組孕婦年齡（28.29±4.41）歲，穿刺孕周（24.58±3.06）周；復(fù)雜性TE組孕婦年齡（29.37±4.58）歲，穿刺孕周（24.04±4.05）周，2組的年齡、穿刺孕周比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為1.41和0.93，P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集根據(jù)孕周在超聲定位下進(jìn)行胎兒產(chǎn)前標(biāo)本取材。孕16～24周的孕婦行羊膜腔穿刺取羊水30 mL，孕24周以后的孕婦行臍血穿刺取3 mL，行CMA檢測(cè)。

1.2.2 CMA檢測(cè)和CNV的判斷采用美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司CytoScan 750K芯片平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)。胎兒樣本DNA排除母源性污染后，按照標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析使用芯片平臺(tái)配套的ChAS軟件。CMA技術(shù)敏感度、分辨率高，可檢出＞100 kb的CNV，無(wú)法檢測(cè)染色體平衡易位、點(diǎn)突變等。分析過(guò)程參照本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)以及在線(xiàn)公共數(shù)據(jù)庫(kù)，如DECIPHER，Databaseof Genomic Variants（DGV），Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM），UCSC Genome Browser，參照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics，ACMG）指南[2]對(duì)CNV進(jìn)行判定。CNV分為五類(lèi)：致病性CNV（pathogenic CNVs，pCNV）、可能致病CNV（likely pathogenic CNVs，lpCNV）、臨床意義不明CNV（variants of uncertain clinical significance，VUS）、可能良性CNV（likely benign CNV）及良性CNV（benign CNV）。產(chǎn)前診斷CMA報(bào)告pCNV、lpCNV和符合實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)的VUS（缺失＞500 kb，重復(fù)＞1 Mb），而對(duì)于良性CNV、可能良性CNV和不符合報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)的VUS不予報(bào)告。本研究將CMA檢出的染色體變異分為染色體非整倍體和CNV兩類(lèi)，有臨床意義的CNV包括lpCNV和pCNV。

1.2.3 胎兒TE有臨床意義的CNV陽(yáng)性率與低風(fēng)險(xiǎn)妊娠人群風(fēng)險(xiǎn)值比較根據(jù)文獻(xiàn)[3]中高齡/焦慮孕婦妊娠的胎兒有臨床意義的CNV發(fā)生率并不隨年齡增長(zhǎng)而升高及文獻(xiàn)[4]胎兒產(chǎn)前超聲異常孕婦相較于超聲無(wú)異常者有臨床意義CNV的發(fā)生率顯著增高的結(jié)論，將高齡/焦慮孕婦、產(chǎn)前超聲無(wú)異常妊娠人群定義為低風(fēng)險(xiǎn)妊娠人群，分別選取超聲無(wú)異常妊娠人群和高齡/焦慮妊娠人群兩個(gè)隊(duì)列的有臨床意義CNV的陽(yáng)性率作為低風(fēng)險(xiǎn)妊娠人群的背景風(fēng)險(xiǎn)值。①超聲無(wú)異常妊娠隊(duì)列的背景風(fēng)險(xiǎn)值確定。本研究將Sagi-Dain等[5]無(wú)明顯超聲異常胎兒的CMA結(jié)果中有臨床意義的CNV陽(yáng)性率0.84%（47/5 541）作為超聲無(wú)異常妊娠隊(duì)列中有臨床意義的CNV的背景風(fēng)險(xiǎn)值。②高齡/焦慮隊(duì)列的背景風(fēng)險(xiǎn)值確定。本研究將文獻(xiàn)薈萃中高齡/焦慮孕婦有臨床意義的CNV陽(yáng)性率0.84%（106/12 546）[6]確定為高齡/焦慮妊娠人群中有臨床意義的CNV背景風(fēng)險(xiǎn)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；定性資料用頻數(shù)/構(gòu)成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CMA在TE胎兒中染色體變異檢出情況本研究157例TE胎兒中，染色體變異陽(yáng)性率為12.10%（19/157），非整倍體陽(yáng)性率為5.73%（9/157），以21-三體、18-三體和性染色體非整倍體為主；CNV陽(yáng)性率為6.37%（10/157），包括6例pCNV、1例lpCNV和3例VUS（臨床資料見(jiàn)表1），有臨床意義的CNV陽(yáng)性率為4.46%（7/157），以微缺失/微重復(fù)綜合征為主。孤立性TE組和復(fù)雜性TE組有臨床意義的染色體變異陽(yáng)性率、染色體非整倍體陽(yáng)性率、有臨床意義的CNV陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 CMA檢出的10例CNV的TE胎兒的臨床資料及分析結(jié)果

表2 CMA在TE胎兒檢出有臨床意義的染色體變異情況

2.2 TE胎兒中有臨床意義的CNV陽(yáng)性率與低風(fēng)險(xiǎn)妊娠人群背景風(fēng)險(xiǎn)值比較157例TE胎兒中有臨床意義的CNV陽(yáng)性率（16/157）顯著高于超聲無(wú)異常妊娠隊(duì)列（47/5 541）和高齡/焦慮妊娠隊(duì)列（106/12 546），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=13.26，95%CI：7.34～23.96，χ2=121.881，P＜0.001；OR=13.32，95%CI：7.67～23.11，χ2=142.399，P＜0.001]。孤立性TE組有臨床意義的CNV陽(yáng)性率（5/107）顯著高于超聲無(wú)異常妊娠隊(duì)列（47/5 541）[OR=5.73，95%CI：2.23～14.70，χ2=16.834，P＜0.001]和高齡/焦慮妊娠隊(duì)列（106/12 546）[OR=5.75，95%CI：2.29～14.40，χ2=17.879，P=0.002]。復(fù)雜性TE組有臨床意義的CNV陽(yáng)性率（2/50）與超聲無(wú)異常妊娠隊(duì)列（47/5 541）[OR=4.87，95%CI：1.15～20.63，χ2=5.666，P=0.071]和高齡/焦慮妊娠隊(duì)列（106/12 546）[OR=4.89，95%CI：1.17～20.38，χ2=5.832，P=0.068]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

染色體微缺失/微重復(fù)是胎兒先天性畸形的重要遺傳學(xué)病因，而CMA作為產(chǎn)前超聲異常的首選臨床遺傳學(xué)分析工具，不僅可以檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)變異、染色體嵌合體（嵌合比例＞20%）和染色體純合狀態(tài)（absence of heterozygosity，AOH），還可以檢測(cè)全基因組水平的CNV。

3.1 TE胎兒染色體非整倍體陽(yáng)性率及其臨床意義染色體非整倍體是胎兒TE的重要遺傳學(xué)病因，本研究中染色體非整倍體陽(yáng)性率為5.73%（9/157），以21-三體、18-三體和性染色體非整倍體為主，與既往文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。既往研究認(rèn)為，胎兒復(fù)雜性TE與染色體非整倍體高度相關(guān)，復(fù)雜性TE需要介入性產(chǎn)前診斷排除非整倍體，而對(duì)于孤立性TE是否需要介入性產(chǎn)前診斷存在爭(zhēng)議[7-8]。本研究中孤立性TE與復(fù)雜性TE組相比，染色體非整倍體陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均有較高的陽(yáng)性率，因此，筆者認(rèn)為，對(duì)于孤立性TE仍需要介入性產(chǎn)前診斷。

3.2 TE胎兒有臨床意義的CNV陽(yáng)性率及其臨床意義本研究TE胎兒中CMA檢出CNV陽(yáng)性率為6.37%（10/157）。既往文獻(xiàn)報(bào)道CNV是復(fù)雜性TE的重要病因[8]，有文獻(xiàn)報(bào)道孤立性TE、復(fù)雜性TE組中檢出有臨床意義的CNV陽(yáng)性率分別為3.06%（7/229）和5.00%（2/40）[9]。郭喬麗等[10]研究報(bào)道CMA在孤立性TE、復(fù)雜性TE組中有臨床意義CNV的陽(yáng)性率分別為5.26%（2/38）、26.67%（4/15），以上兩項(xiàng)研究數(shù)據(jù)存在差異，但是復(fù)雜性TE組中有臨床意義的CNV均高于孤立性TE組。本研究中孤立性TE組、復(fù)雜性TE組的有臨床意義的CNV陽(yáng)性率相近，分別為4.67%（5/107）和4.00%（2/50），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此對(duì)孤立性TE胎兒不能忽視CNV的檢測(cè)。本研究與上述兩項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)存在差異，后續(xù)尚需聯(lián)合多中心，積累大樣本量臨床數(shù)據(jù)，為產(chǎn)前遺傳咨詢(xún)提供參考依據(jù)。此外，對(duì)于攜帶CNV的TE胎兒，應(yīng)驗(yàn)證CNV的遺傳學(xué)來(lái)源，結(jié)合影像學(xué)檢查以及雙親表型，為胎兒父母提供詳細(xì)的遺傳咨詢(xún)，并對(duì)出生兒進(jìn)行長(zhǎng)期追蹤隨訪(fǎng)。后續(xù)我們可以通過(guò)多中心合作不斷積累數(shù)據(jù)，完善出生后病例的隨訪(fǎng)，建立本地人群CNV數(shù)據(jù)庫(kù)，以便對(duì)攜帶CNV的胎兒評(píng)估積累臨床證據(jù)。

3.3 TE胎兒相對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)妊娠人群發(fā)生有臨床意義CNV的風(fēng)險(xiǎn)既往有研究發(fā)現(xiàn)，胎兒有臨床意義的CNV發(fā)生率不隨年齡增長(zhǎng)而升高，CMA檢測(cè)不應(yīng)局限于35歲或以上[3，11]。本研究提示TE胎兒發(fā)生有臨床意義的CNV陽(yáng)性率（4.46%）顯著高于低風(fēng)險(xiǎn)妊娠人群（0.84%），其中孤立性TE胎兒發(fā)生有臨床意義的CNV陽(yáng)性率顯著高于低風(fēng)險(xiǎn)妊娠人群，而復(fù)雜性TE胎兒組發(fā)生有臨床意義的CNV陽(yáng)性率與低風(fēng)險(xiǎn)妊娠人群相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能與本研究復(fù)雜性TE樣本量偏小有關(guān)。此外，值得注意的是復(fù)雜性TE胎兒中有臨床意義的CNV的陽(yáng)性率（4.00%）約為低風(fēng)險(xiǎn)妊娠人群（0.84%）的5倍，因此認(rèn)為對(duì)于TE胎兒，無(wú)論是否合并其他系統(tǒng)結(jié)構(gòu)畸形，均要考慮發(fā)生CNV的高風(fēng)險(xiǎn)性。

3.4 本研究中檢出有臨床意義的CNV的TE病例的分析TE是一些常見(jiàn)的微缺失/微重復(fù)綜合征的常見(jiàn)表型[12]，本研究有臨床意義的CNV，4例（4/7）為微缺失/微重復(fù)綜合征，以22q11.2微缺失綜合征（22q11.2 deletion syndrome，22q11.2 DS）（3/7）最為常見(jiàn)，既往研究發(fā)現(xiàn)22q11.2 DS多與心臟畸形、腭裂和免疫系統(tǒng)功能低下等表型相關(guān)，目前普遍認(rèn)為單倍劑量敏感基因T-box1轉(zhuǎn)錄因子（TBX1）缺失是22q11.2 DS的重要致病原因。本研究例1右側(cè)TE，左側(cè)腦室臨界增寬（10 mm），例2雙側(cè)TE，例3右側(cè)TE，CMA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分 別 缺 失3.25 Mb、2.88 Mb和2.9 Mb，均 提 示 為22q11.2 DS。Homans等[13]研究顯示22q11.2 DS患者中TE的發(fā)生率（3.3%，48/1 466）是普通人群（約1‰）的30倍，提示TE與22q11.2 DS具有極高相關(guān)性。目前僅檢索到一篇文獻(xiàn)報(bào)道TBX1缺失的新生小鼠的頭枕骨軟骨間加速礦化導(dǎo)致融合[14]，目前足內(nèi)翻與22q11.2 DS相關(guān)性機(jī)制待進(jìn)一步研究。

例4胎兒雙側(cè)TE，CMA檢出16p13.11區(qū)段缺失1.5 Mb，CMA提示為16p13.11微缺失綜合征，主要表現(xiàn)為顱面部異常，神經(jīng)認(rèn)知異常等，其表現(xiàn)度和外顯率存在差異[15]，目前尚未見(jiàn)16p13.11缺失與TE相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，該例可能為產(chǎn)前診斷中的偶然發(fā)現(xiàn)。例5雙側(cè)TE，雙腎盂分離，羊水過(guò)多，檢出Xp22.31缺失1.7 Mb，該缺失包含STS基因，涉及X染色體性連鎖魚(yú)鱗病，再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，目前尚無(wú)研究提示該基因與肢體解剖結(jié)構(gòu)畸形相關(guān)，為產(chǎn)前診斷中的意外發(fā)現(xiàn)。例6右側(cè)TE，羊水過(guò)少，CMA結(jié)果發(fā)現(xiàn)14q24.3-q32.33重復(fù)29.9 Mb，可導(dǎo)致14q三體綜合征，主要表現(xiàn)為智力低下、發(fā)育遲緩和特殊面容等先天異常。例7雙側(cè)TE，CMA檢出5q31.1區(qū)域發(fā)生2.7 Mb缺失，遺傳自母親，該區(qū)段包含的PITX1基因，屬于同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族，主要在胚胎中胚層分化后半期表達(dá)，參與下肢發(fā)育。有研究提示PITX1變異或缺失致使膝蓋以下的肌肉和骨骼量減少[16]。另有動(dòng)物研究提示小鼠PITX1與小鼠足內(nèi)翻樣表型高度有關(guān)[17]，其具體致病機(jī)制還在進(jìn)一步研究中。目前研究提示TE與染色體非整倍體、CNV相關(guān)外，基因變異也是TE的重要遺傳學(xué)病因[18]，因此對(duì)核型分析和CMA均陰性的TE胎兒進(jìn)行基因檢測(cè)有助于明確病因。

綜上所述，TE胎兒有臨床意義的CNV發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著高于低風(fēng)險(xiǎn)妊娠人群，染色體非整倍體和CNV是產(chǎn)前TE重要的遺傳學(xué)病因，CMA技術(shù)在TE胎兒中可以提高約6%（10/157）的CNV檢出率，CMA在檢測(cè)TE胎兒染色體微缺失/微重復(fù)具有重要的臨床價(jià)值。