盧欣雨，張曉偉，張佳興，趙勝宗，劉彥＊

（1.四川大學生物質與皮革工程系，四川 成都 610065；2.四川大學制革清潔技術國家工程實驗室，四川 成都 610065）

引言

目前，我國的化肥產(chǎn)量和使用量常年位居世界第一，這與我國人口基數(shù)大、耕地面積少的國情有著密切的關系。另外，農(nóng)民重化肥而輕有機肥和過于追求高產(chǎn)的觀念導致我國普遍存在化肥施用過量的情況[1-2]?；实倪^度施用會導致土壤酸化板結、鹽漬化加重、有機質含量降低、肥力下降、病蟲害發(fā)病率增高以及影響土壤微生物穩(wěn)定性等[3]。與化肥相比，有機肥料不僅包含植物所需的氮、磷、鉀等無機元素，而且含有有機酸、肽類等有機物質，其營養(yǎng)更全面，肥效更長，而且可以改善土壤環(huán)境。早在2015年，農(nóng)業(yè)部就開展了到2020年化肥農(nóng)藥使用量零增長行動，旨在減少不合理的化肥投入，推進有機肥的資源化利用[4]。合理利用蛋白類有機肥則可減少不合理的化肥投入，為實現(xiàn)高產(chǎn)無公害蔬菜果品生產(chǎn)的水肥一體化種植方式，提供重要的農(nóng)作物生長所必需的持續(xù)性營養(yǎng)來源。

在農(nóng)業(yè)中，用氨基酸作為蛋白類有機肥料的應用較多。氨基酸肥能夠為植物提供各種氨基酸類營養(yǎng)物質，具有增產(chǎn)、改善果實品質、抗逆、改良土壤、提高藥物利用率等特點[5]。氨基酸是蛋白質的最終水解產(chǎn)物，分子量小，可被植物快速直接吸收利用，能夠及時地為植物提供營養(yǎng)，但基本不具有持續(xù)性肥效。與氨基酸肥料相比，多肽類物質在農(nóng)業(yè)中的應用尚不多見。肽是蛋白質不完全水解的產(chǎn)物，包括小分子肽和多肽兩大類，我們通常將由11～50個氨基酸組成的化合物稱為多肽，將由2～10個氨基酸構成的化合物稱為小分子肽或者寡肽[6]。小分子肽同氨基酸一樣，可以被植物直接吸收利用，而多肽由于分子量較大，只有被土壤中的微生物緩慢降解后，才能為植物所利用，因此其具有持續(xù)肥效。有研究表明，多肽類肥料不僅可以為作物提供有機態(tài)營養(yǎng)成分，而且對作物的生理功能調節(jié)、細胞組織活化、促進生長、提高作物抗逆性、增強作物抗病性、增產(chǎn)增收、改善果實品質具有明顯的效果[7]。可見，氨基酸和多肽類有機肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都具有較高的應用價值。

隨著我國耕地面積不斷地減少，無土栽培技術越來越受到青睞。無土栽培是以營養(yǎng)液等人工制造的根系生長環(huán)境代替天然土壤環(huán)境，讓作物的根系始終處于適宜的生長環(huán)境條件中，從而使作物發(fā)揮最大增產(chǎn)潛力[8]。與土壤栽培相比，采用無土栽培可減少農(nóng)藥的使用量，克服土傳病害和連作障礙，實現(xiàn)高產(chǎn)以及生產(chǎn)無公害的蔬菜和果品[9]。此外，無土栽培可實現(xiàn)高度自動化，從而節(jié)省人力物力，也是實現(xiàn)水肥一體化的重要種植方式之一。

前期研究表明，作為制革含鉻固體廢棄物資源化利用的產(chǎn)物，脫鉻皮屑發(fā)酵液中富含游離氨基酸和多肽類物質等營養(yǎng)元素，水溶性好，具備作為生物有機緩釋肥的潛能，將其應用于植物種植可能會比單一肥料產(chǎn)生更好的效果，且可能在無土栽培技術中具有較好的應用前景。本文擬采用無土栽培的方式，將脫鉻皮屑發(fā)酵液應用于種子萌發(fā)和植物栽培，對脫鉻皮屑發(fā)酵液作為植物生長有機緩釋肥的肥效進行研究，評估其在植物栽培方面的應用前景。

1 實驗部分

1.1 主要材料與儀器

脫鉻皮屑發(fā)酵液：本實驗室自制。由自然降解的廢皮液中篩選得到的地衣芽孢桿菌對脫鉻皮屑[10]進行發(fā)酵得到，主要成分為易于植物吸收（分子量≤14.4 kDa）的游離氨基酸（脯氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和組氨酸）和小分子肽類物質，總游離氨基酸質量濃度為1 g/L，總肽質量濃度為13.21 g/L，鉻質量分數(shù)為2.91 mg/kg。

市售含氨基酸水溶肥（推薦使用質量濃度為100 mg/L）：永濟市禾豐源肥業(yè)有限公司。含有鈣、鎂、硫、硼、鉀、氨基酸、蛋白酶、植物生長促進劑等物質。

材料：試劑均為國產(chǎn)分析純；苜蓿種子，沭陽縣楚漢園林綠化工程有限公司；小麥種子，仲衍種業(yè)股份有限公司；

儀器：HSP-80B恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海坤天實驗儀器有限公司；SQP電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；LG10-2.4A高速離心機，北京醫(yī)用離心機廠。

1.2 實驗內容與方法

1.2.1 作為浸種劑

選取不同營養(yǎng)存儲的苜蓿種子和小麥種子作為發(fā)芽實驗材料，用不同稀釋質量濃度的脫鉻皮屑發(fā)酵液對其進行浸種處理，以期獲得促進種子高效萌發(fā)的最適發(fā)酵液質量濃度和最佳發(fā)芽效果，以及考察脫鉻皮屑發(fā)酵液對不同營養(yǎng)存儲種子發(fā)芽的影響[11-14]。

1.2.1.1 作為苜蓿種子浸種劑

將脫鉻皮屑發(fā)酵液離心除菌后進行稀釋，使稀釋后發(fā)酵液的游離氨基酸質量濃度分別為20、40、60、80、100、120 mg/L。挑選大小均勻的苜蓿種子100顆，分別用不同氨基酸含量的發(fā)酵液（用量為種子質量的5倍）于25℃下浸泡12 h。將浸泡好的種子整齊地擺放在墊有濾紙的表面皿中（濾紙用相應氨基酸含量的發(fā)酵液潤濕），然后將表面皿置于溫度為25℃，濕度為60%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，觀察并記錄種子發(fā)芽情況?？瞻讓φ諡橛盟婷撱t皮屑發(fā)酵液作為浸種劑，其它操作相同。

發(fā)芽率=（發(fā)芽個數(shù)/100）×100%

1.2.1.2 作為小麥種子浸種劑

種子換為小麥種子，其余步驟同1.2.1.1。

1.2.2 作為小麥苗水培營養(yǎng)液

將脫鉻皮屑發(fā)酵液離心除菌后進行稀釋備用，使稀釋后發(fā)酵液的游離氨基酸質量濃度分別為20、40、60、80、100 mg/L。稱取大小均勻的小麥種子4 g，加入5倍種子質量的自來水于25℃下浸泡12 h。將浸泡好的種子整齊地擺放在墊有濾紙的表面皿中，然后將其置于溫度為25℃，濕度為60%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，用自來水培養(yǎng)。待小麥種子營養(yǎng)消耗殆盡時，倒掉表面皿中殘留的水，加入一定量上述稀釋的發(fā)酵液，使得發(fā)酵液剛好淹沒麥苗根部，然后放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)（培養(yǎng)過程中補加適量自來水，使得麥苗根部剛好被淹沒）。每7天觀察記錄一次小麥的植株高度，并拍照記錄小麥的生長狀況?？瞻讓φ战M和陽性對照組分別用自來水和市售含氨基酸（質量濃度100 mg/L）水溶肥來代替脫鉻皮屑發(fā)酵液，其它操作相同。

小麥種子經(jīng)過一周常規(guī)育苗培養(yǎng)，兩周施肥培養(yǎng)后收苗，對麥苗植株的高度和干濕重及水分含量、葉片的葉綠素和蛋白質含量等品質參數(shù)進行測定。

1.2.2.1 麥苗株高

用直尺測定麥苗莖基部到最高葉片的距離。

1.2.2.2 麥苗植株的干濕重及水分含量

將麥苗連根拔起，去根部，稱量，計為濕質量。將稱量部分置于恒溫干燥箱中在100℃下殺菌0.5 h，然后在80℃下烘干至恒量，恒量結果計為干質量。

麥苗植株的含水量=（麥苗植株濕質量-麥苗植株干質量）/麥苗植株濕質量×100%

1.2.2.3 小麥葉片的葉綠素含量[15]

準確稱取0.5 g新鮮小麥葉片，搗碎勻漿，加入100 mL體積比為1∶1的乙醇、丙酮混合提取液后，放置室溫下避光處靜置提取5 h，過濾，濾液待測。以提取劑為空白溶液，分別在波長為645 nm和663 nm處測定濾液的吸光度值。

葉綠素a=(12.72×A663-2.59×A645)×V/(1000×m)

葉綠素b=(22.88×A645-4.67×A663)×V/(1000×m)

總葉綠素=(8.05×A663+20.29×A645)×V/(1000×m)

式中：葉綠素a、b、總葉綠素，mg/g；V為提取液的總體積，mL；m為樣品的鮮重，g。

1.2.2.4 小麥葉片的蛋白質含量[16]

準確稱取0.2～2.0 g烘干的小麥葉片，放入100 mL定氮瓶中，加入0.4 g硫酸銅、6 g硫酸鉀及20 mL硫酸，輕搖后于瓶口放一小漏斗。將定氮瓶置于電爐上加熱碳化，直至液體顏色呈藍綠色并澄清透明后，繼續(xù)加熱0.5 h。關閉電源，取下定氮瓶，加入20 mL水，冷卻后定容到100 mL容量瓶中?？瞻讓嶒灋椴患有←溔~片，其它操作相同。采用凱氏定氮法對處理好的樣品進行蛋白質含量的測定，按照式（1）進行計算。

式中：X為樣品中蛋白質的質量分數(shù)，%；V1為樣液消耗硫酸標準液體積(mL)；V2為空白試劑消耗硫酸標準液的體積(mL)；V3為吸取消化液的體積(mL)；C為硫酸標準溶液的濃度(mol/L)；0.0140為與1 mL硫酸[c(1/2 H2SO4)=1.000 mol/L]標準溶液相當?shù)牡|量(g)；6.25為氮換算為蛋白質的系數(shù)。

2 結果與討論

2.1 作為種子浸種劑

觀察發(fā)芽前的苜蓿種子和小麥種子可知，兩類種子的個體差別很大，單個小麥種子比單個苜蓿種子重大約20倍，因而小麥種子的營養(yǎng)儲存較苜蓿種子豐富。

2.1.1 苜蓿種子發(fā)芽情況

由圖1可以看出，苜蓿種子的發(fā)芽率隨著時間的延長而增加。培養(yǎng)24 h，種子基本上還處于未發(fā)芽階段；48 h后，已有近一半的種子開始發(fā)芽；72 h后，所有組的種子發(fā)芽數(shù)量均已過半。相比于水培苜蓿種子，實驗組的發(fā)芽率均更高，且不同質量濃度脫鉻皮屑發(fā)酵液浸種處理的苜蓿種子的發(fā)芽率隨著發(fā)酵液質量濃度的升高先增加后減少，質量濃度為80 mg/L時發(fā)芽率最高，這說明適宜質量濃度的發(fā)酵液浸種處理苜蓿種子可以起到催芽作用，且最佳催芽質量濃度為80 mg/L。經(jīng)過72 h培養(yǎng)，還有約1/3的種子沒有發(fā)芽，可以考慮通過適當延長時間來提高發(fā)芽率。

圖1 苜蓿種子發(fā)芽情況Fig.1 Germination rates of alfalfa seeds

2.1.2小麥種子發(fā)芽情況

圖2顯示，不同浸種處理的小麥種子在24 h時大部分都已發(fā)芽，48 h后的發(fā)芽率幾乎沒有明顯的變化，說明小麥種子的發(fā)芽此時已基本結束。24 h、48 h和72 h三個階段的小麥種子發(fā)芽率都隨著浸種質量濃度的升高反而逐漸降低，說明較高質量濃度發(fā)酵液的浸種處理對小麥種子的發(fā)芽有一定的抑制作用，且發(fā)酵液質量濃度越高抑制作用越強。這可能與小麥種子自身的結構有關，小麥種子大、子葉肥厚，具有足夠的營養(yǎng)用于發(fā)芽，額外施加高營養(yǎng)的蛋白發(fā)酵液會使種子發(fā)芽時營養(yǎng)過剩，造成種子生長活力下降，從而抑制發(fā)芽。因此，在實驗所用的質量濃度范圍內，發(fā)酵液對小麥種子沒有催芽作用。

圖2 小麥種子發(fā)芽情況Fig.2 Germination rates of wheat seeds

2.2 作為小麥苗水培營養(yǎng)液

2.2.1 麥苗株高

由圖3可以看出，施肥麥苗的平均高度均比水培的高，這說明有機蛋白類肥料可以促進麥苗植株的生長。而施肥組中，對比于市售肥料，質量濃度在40～100mg/L的實驗組麥苗株高均有明顯增加，這可能是因為質量濃度較高的發(fā)酵液中尚存在較多的小分子肽和多肽等，它們被微生物分解后能夠給植物生長提供源源不斷的營養(yǎng)成分供給。其中，質量濃度同為100 mg/L的實驗組植株高度比市售肥料的高，說明脫鉻皮屑發(fā)酵液比一般市售的氨基酸肥營養(yǎng)成分更豐富。因此，脫鉻皮屑發(fā)酵液作為一種植物生長生物有機緩釋肥，具有較好的應用前景。

圖3 麥苗株高Fig.3 Plant height of wheat

2.2.2 麥苗植株的干濕重及水分含量

由圖4可以看出，與水培麥苗相比，施肥處理的麥苗鮮重、干重和水分含量均有所增加，且實驗組的麥苗鮮重、干重和水分含量隨著施肥質量濃度的升高呈現(xiàn)上升趨勢，而市售肥料組麥苗的鮮重、干重和水分含量遠不如質量濃度同為100 mg/L的實驗組。干重可以反映小麥苗對有機物質的合成和積累，麥苗的鮮重、干重和水分含量皆在發(fā)酵液質量濃度為100 mg/L時達到最高值。因此，脫鉻皮屑發(fā)酵液對麥苗鮮重、干重和水分含量的增加都有明顯的促進作用。

圖4 麥苗植株的質量及水分含量Fig.4 Plant weight and moisture content of wheat seedling

2.2.3 小麥葉片的葉綠素含量

由圖5可以看出，與水培小麥相比，經(jīng)過施肥處理的小麥葉片葉綠素含量均明顯增加，這主要是因為脫鉻皮屑發(fā)酵液和市售肥料都屬于高氮肥料，而氮元素又是組成葉綠素的重要元素，所以施加一定量的肥料可以促進植物葉綠素的合成。不同質量濃度發(fā)酵液施肥處理的小麥之間的葉綠素含量變化極小，且隨著質量濃度的升高反而有所降低。這可能是由于施肥質量濃度高時，新生葉片多且生長快，但是葉綠素的合成和積累要相對遲緩一些，所以造成葉綠素含量隨著質量濃度的升高不升反降。經(jīng)過發(fā)酵液施肥處理的小麥葉片葉綠素含量均低于市售肥料組，造成這一差異的原因可能是市售肥料含有使葉片變綠的成分（非蛋白氨基酸—5-氨基乙酰丙酸），該物質是促進葉綠素合成的前體物質，能夠直接促進葉綠素合成，防止葉片枯黃。綜上所述，施用不同質量濃度的脫鉻皮屑發(fā)酵液能明顯增加小麥葉片的葉綠素含量，在施肥質量濃度為20 mg/L時其葉綠素含量最高。

圖5 小麥葉片的葉綠素含量Fig.5 Chlorophyll contents of wheat leaves

2.2.4 小麥葉片的蛋白質含量

由圖6可知，施加肥料的小麥葉片蛋白質含量均比水培的高，說明施加蛋白類肥料可以促進小麥葉片蛋白質的合成。實驗組的小麥葉片蛋白質含量隨脫鉻皮屑發(fā)酵液質量濃度的增加呈明顯上升的趨勢，并在100 mg/L時達到最高值，并顯著高于質量濃度相同的市售肥料培養(yǎng)的小麥葉片蛋白質質量分數(shù)。由此看來，脫鉻皮屑發(fā)酵液營養(yǎng)豐富，可以顯著提高小麥葉片的蛋白質質量分數(shù)。

圖6 小麥葉片的蛋白質質量分數(shù)Fig.6 Protein contents of wheat leaves

3 結論

（1）浸種實驗結果表明，脫鉻皮屑發(fā)酵液質量濃度越高，苜蓿種子發(fā)芽率就越高，且最佳催芽質量濃度為80 mg/L，反之，小麥種子發(fā)芽率就越低。脫鉻皮屑發(fā)酵液的浸種處理效果與種子的起始營養(yǎng)狀態(tài)密切相關，適宜質量濃度的脫鉻皮屑發(fā)酵液可明顯促進顆粒較小的苜蓿種子發(fā)芽，而對于小麥這種自身營養(yǎng)比較豐富的大種子，催芽效果并不明顯。

（2）小麥苗水培實驗結果表明，施加適量質量濃度的脫鉻皮屑發(fā)酵液對小麥苗的生長具有明顯的促進效果，可顯著增加麥苗植株的高度和干濕重及水分含量、葉片的葉綠素和蛋白質含量，且最佳施肥質量濃度為100 mg/L。