陽 梅， 李明玉， 李德淵

(1.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院眉山市婦女兒童醫(yī)院新生兒科， 四川 眉山 620010 2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院新生兒科， 四川 成都 610000)

新生兒圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic ischemic brain injury，HIE)是許多嚴(yán)重人類神經(jīng)功能障礙的重要危險(xiǎn)因素，如運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)障礙、腦癱、癲癇，甚至死亡，占新生兒總數(shù)的23%[1,2]。HIE直接導(dǎo)致大量神經(jīng)元死亡，細(xì)胞凋亡為引起神經(jīng)元死亡的一個(gè)重要途徑，尤其海馬區(qū)[3]。機(jī)體的炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)均能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。芍藥內(nèi)酯苷是一種單萜苷，是常用中藥芍藥的活性成分之一。近年來，隨著藥效學(xué)的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)其具有不同于芍藥苷的獨(dú)特藥效學(xué)特征，在神經(jīng)損傷疾病的治療方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性[4,5]。磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶/雷帕霉素哺乳動(dòng)物靶點(diǎn)(Phosphatidylinositol 3-kinase/Serine-threonine kinase/Mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR)信號(hào)通路是參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯、遷移、代謝、增殖和存活的中央樞紐[6]。多項(xiàng)研究表明，該信號(hào)通路激活后可通過減輕自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7]。本研究旨在探究芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HIE腦損傷幼鼠的神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源:45只出生9d的幼鼠及母鼠，來自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司；合格證號(hào)SCXK(京)2018-0032。

1.1.2試劑及器材:芍藥內(nèi)酯苷(貨號(hào)：39011-90-0)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色液購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，Tunel)試劑盒購自羅氏(Roche)公司；小鼠MDA、SOD、GSH 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒和小鼠白介素IL-6、IL-18、IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒均購自上海碧云天商務(wù)技術(shù)有限公司；兔抗鼠ICAM-1多抗、兔抗Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9多抗及兔抗PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR等一抗均來自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；XBS-02B型全自動(dòng)缺氧動(dòng)物模型飼養(yǎng)箱購自杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；IXplore Pro自動(dòng)化顯微鏡系統(tǒng)購自日本Olympus。

1.2方 法

1.2.1新生小鼠缺氧性腦損傷(HIE)模型的制造:將小鼠麻醉、仰臥固定，解剖顯微鏡下操作：頸中線切開皮膚，分離頸總動(dòng)脈、內(nèi)動(dòng)脈、外動(dòng)脈，尼龍繩雙重結(jié)扎頸總動(dòng)脈，中間剪斷頸總動(dòng)脈，縫合皮膚。將小鼠在電爐旁溫暖，直至全部蘇醒，再轉(zhuǎn)移至母鼠籠中休息。2h后再將小鼠轉(zhuǎn)移至恒溫缺氧箱，10%氧氣、90氮?dú)獾娜毖跸渲芯S持40min，再放置37℃恒溫箱2h，轉(zhuǎn)移至母鼠籠。

1.2.2動(dòng)物分組:45只小鼠隨機(jī)分3組，每組15只，分別標(biāo)記為假手術(shù)組、模型組、芍藥內(nèi)酯苷組。模型組、芍藥內(nèi)酯苷組小鼠均需HIE造模。假手術(shù)組小鼠，僅做分離頸內(nèi)、外、總動(dòng)脈，不做栓塞。模型組小鼠按照上述操作造模。芍藥內(nèi)酯苷組小鼠，造模后給予30mg/kg芍藥內(nèi)酯苷灌胃，每天1次，連續(xù)21d。假手術(shù)組、模型組小鼠，給予等量的蒸餾水灌胃。

1.2.3指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1腦梗死面積檢測(cè):TTC染色法檢測(cè)小鼠腦梗死：斷頭法處死小鼠，取新鮮腦組織-20℃，30min，切成2mm。置于TTC溶液孵育30min，白色為梗死區(qū)。甲醛中固定，拍照，Image J軟件分析腦梗死率(%)為梗死面積與總面積百分率。

1.2.3.2腦組織細(xì)胞凋亡檢測(cè):Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取新鮮的腦組織，4%多聚甲醛固定12h，制作石蠟切片。按照Tunel試劑盒中石蠟包埋切片的檢測(cè)方法操作。使用蛋白酶K對(duì)二甲苯、梯度乙醇處理的切片進(jìn)行室溫處理15min，PBS沖洗，晾干。濕盒內(nèi)操作標(biāo)記、顯色：用Tunel反應(yīng)混合液37℃孵育1h。DAPI室溫下反應(yīng)15min，PBS沖洗，抗熒光猝滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察，拍照。Tunel染色陽性凋亡細(xì)胞顯綠色，DAPI核染細(xì)胞顯藍(lán)色。陽性凋亡細(xì)胞的百分率為腦組織細(xì)胞凋亡率。WB檢測(cè)組織中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表達(dá)：腦組織勻漿，裂解液冰上裂解，超聲裂解，提取總蛋白。對(duì)蛋白BCA定量，沸水變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮、分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉液對(duì)膜封閉處理后滴加一抗溶液(1500倍稀釋的兔抗Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9)，37℃孵育2h，PBS沖洗，再滴加二抗溶液(500倍稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗)，繼續(xù)孵育1.5h，沖洗。滴加電化學(xué)發(fā)光顯色液，凝膠成像系統(tǒng)曝光。Image J分析條帶灰度。

1.2.3.3腦組織氧化應(yīng)激水平檢測(cè):取腦組織勻漿液做樣本。按照小鼠MDA、SOD、GSH酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒要求操作，處理樣本、判定實(shí)驗(yàn)有效性、計(jì)算樣本中MDA、SOD、GSH的含量。

1.2.3.4腦組織炎癥水平檢測(cè)ICAM-1、IL-6、IL-18、IL-1β:取新鮮的腦組織，4%多聚甲醛固定12h，制作石蠟切片。脫蠟后，反復(fù)蒸煮2次，進(jìn)行熱抗原修復(fù)。先將組織用山羊血清封閉處理，室溫下孵育1.5h。200倍稀釋的兔抗鼠ICAM-1多克隆抗體作為一抗，37℃孵育組織1h，500倍稀釋的山羊抗兔二抗作為二抗，37℃孵育組織1h。加100倍稀釋的鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)孵育30min，滴加顯色液。脫水后，封片，200倍顯微鏡下觀察、拍照。棕褐色為ICAM-1蛋白陽性，用陽性數(shù)與總細(xì)胞數(shù)百分比表示ICAM-1蛋白表達(dá)情況。取腦組織勻漿液做樣本。小鼠白介素IL-6、IL-18、IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒分析樣本中IL-6、IL-18、IL-1β的含量。具體操作步驟見各個(gè)試劑盒說明書。

1.2.3.5腦組織PI3K/AKT/mTOR通路活性檢測(cè):腦組織勻漿后，進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其中PI3K/AKT/mTOR通路關(guān)鍵基因PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的蛋白表達(dá)量。具體操作步驟同1.2.3.2中的蛋白檢測(cè)方法。

2 結(jié) 果

2.1芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HIE小鼠腦梗死面積的影響:與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦梗死率明顯升高，與模型組相比，芍藥內(nèi)酯苷組小鼠腦梗死率顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HIE小鼠腦梗死面積的影響

2.2芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HIE小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響:與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦細(xì)胞凋亡率顯著升高(圖1)，Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白顯著升高(圖2)，與模型組相比，芍藥內(nèi)酯苷組小鼠腦細(xì)胞凋亡率降低(圖1)，Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表達(dá)也降低(圖2)(P<0.05)。見表2。

表2 芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HIE小鼠腦細(xì)胞凋亡的影響

圖1 芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HIE小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響

圖2 芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HIE小鼠腦組織Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達(dá)的影響

2.3芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HIE小鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響:與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織MDA含量升高，SOD、GSH含量均降低，與模型組相比，芍藥內(nèi)酯苷組小鼠腦組織MDA含量降低，SOD、GSH含量均升高(P<0.05)。見表3。

表3 芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HIE小鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響

2.4芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HIE小鼠腦組織炎癥因子的影響:與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織ICAM-1、IL-6、IL-18、IL-1β均顯著升高，與模型組相比，芍藥內(nèi)酯苷組小鼠腦組織ICAM-1、IL-6、IL-18、IL-1β均顯著降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HIE小鼠腦組織ICAM-1表達(dá)的影響

表4 不同濃度芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HIE小鼠腦組織炎癥反應(yīng)的影響

2.5芍藥內(nèi)酯苷對(duì)小鼠腦組織PI3K/AKT/mTOR通路的影響:與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織p-PI3K、p-AKT、p-mTOR均顯著降低，與模型組相比，芍藥內(nèi)酯苷組小鼠腦組織p-PI3K、p-AKT、p-mTOR均顯著升高(P<0.05)。見圖4、表5。

圖4 小鼠腦組織PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 芍藥內(nèi)酯苷調(diào)控小鼠腦組織PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷的神經(jīng)保護(hù)功能均有研究[8,9]，但是其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制仍未清楚。Wang等[10]制造大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，探究芍藥苷的作用發(fā)現(xiàn)，芍藥苷能改善模型大鼠的神經(jīng)功能，減少腦含水量，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制活性氧ROS、MDA，SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，降低神經(jīng)元凋亡率，說明了芍藥苷可減輕大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血的早期腦損傷。Jiang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷減輕了缺氧誘導(dǎo)的大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元損傷及炎性損傷，還減輕缺氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞焦亡，進(jìn)一步研究揭示了芍藥苷抑制缺氧星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF1a/miR-210/caspase1/GSDMD信號(hào)通路的活性，說明了芍藥苷通過抑制HIF1a/miR-210/caspase1/GSDMD信號(hào)通路改善缺氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞焦亡，為缺氧性腦損傷的治療提供依據(jù)。sICAM-1參與新生兒HEI體內(nèi)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，其表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6大量釋放，加重病情[12]。此研究結(jié)果顯示：芍藥內(nèi)酯苷降低了HIE小鼠的腦梗死率、腦組織細(xì)胞凋亡率，下調(diào)了SOD、GSH，上調(diào)MDA，并下調(diào)ICAM-1、IL-6、IL-18、IL-1β，充分說明了芍藥內(nèi)酯苷增強(qiáng)了HIE小鼠抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、抗炎癥能力，以發(fā)揮對(duì)HIE小鼠的神經(jīng)保護(hù)功能。

PI3K/AKT/mTOR通路在腦缺血損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用已被廣泛研究[12,13]。Wei等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在缺血缺氧性腦損傷新生小鼠中的活性降低，中藥氧化苦參堿治療后該通路的活性得到恢復(fù)，小鼠海馬組織神經(jīng)元的自噬得到明顯減輕，神經(jīng)功能得到提高。當(dāng)歸減少缺血性腦卒中小鼠腦梗死，促進(jìn)神經(jīng)元的存活，抑制Bcl-2/Bax線粒體功能，其機(jī)制為激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活性[15]。因此，本研究推測(cè)，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可能也參與了芍藥內(nèi)酯苷的藥理作用。此研究結(jié)果顯示，HIE小鼠腦組織中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)分別下調(diào)40%、55.56%、49.31%。芍藥內(nèi)酯苷治療后，他們的表達(dá)均得到了一定恢復(fù)，趨于假手術(shù)小鼠。這說明了PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路確實(shí)在HIE小鼠中活性受到抑制，再次驗(yàn)證了前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)也說明了通路的活性受芍藥內(nèi)酯苷的調(diào)控，可能參與了芍藥內(nèi)酯苷的抵抗HIE新生小鼠腦細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥的過程。

綜上所述，芍藥內(nèi)酯苷抑制HIE新生小鼠腦組織氧化應(yīng)激、炎癥及神經(jīng)元凋亡，降低腦梗死面積，產(chǎn)生這種神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制與激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)，為芍藥內(nèi)酯苷用于臨床保護(hù)神經(jīng)奠定基礎(chǔ)。