劉小娥，蘇世平

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 林學院，蘭州 730070)

土壤鹽漬化已經(jīng)成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要問題之一，據(jù)報道中國目前有鹽漬化土地面積約3 600 萬hm2[1-2]，占中國耕地面積的4.88%[2-4]，占全球鹽堿地面積的3.6%，預計到2050年，50%的可用耕地將面臨鹽漬化威脅[4]，因此，鹽堿化土地的治理顯得尤為重要。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不合理的施肥和灌溉容易引起土地鹽堿化，一方面，在灌溉過程中，由于水質(zhì)不達標，導致水中的鹽分隨灌溉進入土壤；另一方面，由于不合理的灌溉，導致水分滲入土壤深層，將土壤深層殘存的鹽分溶解后通過土壤水分蒸發(fā)運移到土壤表層，加速了土壤鹽漬化。

土壤鹽漬化發(fā)生后，對植物造成鹽脅迫，嚴重影響植物的正常生長發(fā)育。植物在遭受鹽脅迫時，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[游離脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)]含量出現(xiàn)不同程度的升高[5-8]，抗氧化酶[過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)]活性在低鹽濃度下呈升高趨勢，隨著鹽濃度的增加而逐漸降低[9-10]，光合色素含量也隨鹽濃度的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢[11]；植物在鹽脅迫時表現(xiàn)出生物產(chǎn)量降低，植株高生長減緩、根系生長受限，葉片變小，出現(xiàn)壞死斑點等受害癥狀[12]。不同種類的鹽脅迫，如酸性鹽、中性鹽和堿性鹽，對植物的作用機理不同，同時植物對鹽脅迫的耐受程度因鹽分種類和鹽分濃度的不同而不同[13]。中國西北地區(qū)土壤鹽分主要以中性鹽和堿性鹽為主，而NaHCO3是常見的堿性鹽。植物在NaHCO3脅迫下，由于Na+的脅迫而導致細胞膜的結構和功能發(fā)生改變，細胞膜上原有的Ca2+被Na+取代，使細胞膜出現(xiàn)微小漏洞而引起原生質(zhì)等產(chǎn)生滲漏，導致細胞內(nèi)的離子種類和濃度發(fā)生變化，也會因鹽分在細胞內(nèi)大量積累引起原生質(zhì)凝固，造成葉綠素破壞，光合作用速率急劇下降[11,14]，嚴重影響植物的生長發(fā)育。NaHCO3脅迫除了引起離子毒害和滲透脅迫外，還有高的pH脅迫，pH升高導致Fe2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+等金屬離子的有效性降低[15]，從而造成植株生理代謝障礙，導致生長受抑。

三色堇(Violatricolor)隸屬于堇菜科(Violaceae)堇菜屬(Viola)，為多年生草本，喜排水良好、肥沃、富含有機質(zhì)的pH為5.4～7.4的弱酸性、中性壤土或粘壤土生長，常用作花壇、花池、花鏡以及模紋花壇擺放的材料，同時三色堇全株可入藥，具有散瘀、止咳、清熱解毒的功能；也有研究表明，三色堇花朵富含黃酮、花青素和類胡蘿卜素[16]，有較高的食用價值。因此，隨著三色堇使用價值的不斷擴展，其栽培面積將不斷增加，三色堇的研究將會越來越多地受到關注。目前對三色堇的研究多集中在栽培、干旱脅迫[17]、NaCl脅迫[18-19]、高溫脅迫[20-22]及重金屬脅迫[23]等方面。其中，在鹽脅迫方面的研究，分別集中在滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(Pro、SS、SP)、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)、生長、膜脂過氧化(MDA)等方面，而關于三色堇在NaHCO3脅迫下生理生化方面的研究比較少見；同時，植物的耐鹽性不是某一個指標或某一類指標的單獨表現(xiàn)，而是眾多生理生化特性綜合作用的結果。因此，本研究以三色堇為研究材料，采用不同濃度NaHCO3處理，探討在NaHCO3脅迫下三色堇植株滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶、光合色素、膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物以及生長方面的響應機理，以及三色堇對土壤NaHCO3脅迫的生理耐受限度，為今后鹽堿地三色堇的栽培提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料培育

試驗所用材料為種子播種獲得的三色堇實生苗。將基質(zhì)(丹麥生產(chǎn))先用蒸餾水浸泡48 h后，倒掉水分，再用蒸餾水沖洗3～5次，以清除基質(zhì)中可溶性離子；之后，用50%(g/V)的可濕性多菌靈粉劑滅菌后密封5 d，然后裝入營養(yǎng)缽(直徑100 mm，高150 mm)供播種用。播種時將基質(zhì)用蒸餾水澆透，每缽播種2粒種子，等萌發(fā)后長出2片真葉時每營養(yǎng)缽保留1株幼苗；每隔7 d用霍格蘭氏(Hoagland’s)營養(yǎng)液澆灌1次，每盆200 mL；待幼苗生長45 d(5～6片真葉)時進行NaHCO3脅迫處理，NaHCO3處理過程中不再澆灌Hoagland’s營養(yǎng)液。

1.2 試驗處理

試驗設置0(蒸餾水澆灌，CK)、25、50、100、150、200 mmol·L-16個濃度NaHCO3處理，每處理3次重復，每重復30株(缽)，每2 d處理1次。為避免鹽沖激效應，對濃度高于25 mmol·L-1的處理，每隔1 d用高一濃度處理液進行澆灌，直至到達設定濃度后，每隔1 d用目標濃度的處理液澆灌1次，每次灌溉量為基質(zhì)持水量的2倍，確保有2/3的處理溶液流出，以此將前期集余鹽分沖洗掉，以保證NaHCO3濃度恒定[24]，在全部處理達到目標濃度的一天定為鹽脅迫處理的第1天。本研究中，蒸餾水pH值為7.01，各濃度NaHCO3溶液pH值均為8.30。灌溉濃度順序見表1。在處理的第7天和14天，每重復隨機選擇10株幼苗進行生長指標和生理指標測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生理指標在每重復的30株三色堇幼苗中隨機選擇10株，每株選擇大小一致的葉片3片，共30片，裝入液氮中，供生理指標測定，每個指標測定時，用直徑為0.5 cm的打孔器進行每葉片取樣，混合葉片樣品作為測定樣品。游離脯氨酸(Pro)含量采用磺基水楊酸提取法測定；可溶性糖(SS)含量采用蒽酮比色法測定；可溶性蛋白(SP)含量采用考馬斯亮藍染色法測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑光化還原法測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定，MDA采用硫代巴比妥酸法測定，葉綠素含量采用酒精提取法測定。以上方法參考李合生[25]、高俊鳳[26]的方法。

1.3.2 株高生長量在處理的第0天、第7天、第14天測定三色堇幼苗莖基部至頂芽處的高度，分別記為H0、H7、H14(cm)，據(jù)此計算株高凈生長量。

Δi=Hi-H0

式中，Δi為處理后第i天的株高凈生長量，H0為處理第0天的株高，Hi為處理后第i天的株高，i=7或14。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS17.0軟件進行方差分析，各處理之間差異性檢驗采用Duncan檢驗，采用Microsoft Excel 2010軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 NaHCO3脅迫對三色堇株高生長的影響

圖1顯示，隨著NaHCO3處理濃度的增加，三色堇植株株高生長量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，并在25 mmol·L-1處理下達到最高值；株高生長量在處理濃度小于或等于50 mmol·L-1時高于對照(0 mmol·L-1)，在其余處理濃度下均不同程度低于對照。其中，在NaHCO3處理14 d后，三色堇株高生長量在25、50 mmol·L-1處理下顯著高于對照(0.68 cm)45.59%(P<0.05)，在100 mmol·L-1時與對照相等(P>0.05)，在150和200 mmol·L-1分別比對照顯著降低16.18%和27.94%(P<0.05)?？梢?，三色堇植株對NaHCO3脅迫具有一定的耐受性，且有在低濃度(≤50 mmol·L-1)下對高生長有顯著促進作用，高濃度(>100 mmol·L-1)顯著抑制的效應。

2.2 NaHCO3脅迫對三色堇葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

三色堇幼苗葉片的可溶性蛋白(SP)、可溶性糖(SS)和脯氨酸(Pro)含量經(jīng)NaHCO3處理后均高于對照。隨著處理濃度的增加，三色堇葉片SP含量在處理的第7天和第14天均呈先上升后下降的趨勢，并均在處理濃度為50 mmol·L-1時達到最高值，在此濃度處理第7天和第14天時分別比對照顯著增加了143.93%和140.86%(P<0.05)；各濃度處理第14天的SP含量在低濃度(≤50 mmol·L-1)時高于第7天，而在高濃度(>50 mmol·L-1)時低于第7天。在濃度為200 mmol·L-1時，SP含量在處理第7天和第14天時分別比對照顯著增加了103.34%和58.15%(P<0.05)(圖2，A)。

隨著NaHCO3處理濃度的增加，三色堇植株葉片SS和Pro含量在處理的第7天呈持續(xù)升高趨勢，在第14天呈先上升后降低的趨勢。其中，葉片SS含量在NaHCO3脅迫處理第14天時以濃度為50 mmol·L-1時含量最高，比對照顯著增加了450.39%，在濃度為200 mmol·L-1時比對照顯著增加了338.91%(P<0.05)；除200 mmol·L-1處理以外，葉片SS含量在各濃度處理第14天時顯著高于第7天，且均顯著高于對照(P<0.05)(圖2，B)。同時，葉片Pro含量在NaHCO3脅迫處理的第14天以濃度為150 mmol·L-1時最高，比對照顯著增加了112.12%，在濃度為200 mmol·L-1時比對照增加了89.26%(P<0.05)；隨著處理時間的延長，鹽脅迫處理第14天時Pro含量均明顯低于第7天的，且鹽脅迫濃度越高差異越大，但兩時段各濃度處理均高于對照(圖2，C)。

2.3 NaHCO3處理對三色堇葉片抗氧化酶活性的影響

NaHCO3在一定濃度范圍內(nèi)能顯著提高三色堇幼苗葉片的抗氧化酶活性(圖3)。隨著NaHCO3處理濃度的增加，三色堇幼苗葉片POD、SOD和CAT活性在處理的第7天和第14天均呈先上升后降低的趨勢，且在處理第14天變化幅度較大。其中，在處理的第14天，三色堇幼苗葉片POD活性在NaHCO3脅迫濃度為50 mmol·L-1時最高，比對照顯著增加了108.07%(P<0.05)；在鹽濃度為200 mmol·L-1時比對照降低了3.31%，但差異不顯著(P>0.05)；隨著處理時間的延長，各濃度處理葉片POD活性在第14天均明顯高于第7天(圖3，A)。

同時，在鹽脅迫處理的第14天，三色堇葉片SOD活性在脅迫濃度為100 mmol·L-1時最高，比對照顯著增加了65.18%(P<0.05)；在脅迫濃度為200 mmol·L-1處理比對照降低了1.75%，但差異不顯著(P>0.05)；隨著脅迫處理時間的延長，除100 mmol·L-1處理外，其他濃度處理第14天的 SOD活性均低于第7天(圖3，B)。

另外，在鹽脅迫處理的第14天，三色堇葉片CAT活性脅迫濃度為50 mmol·L-1時最高，比對照顯著增加了156.96%(P<0.05)；在鹽濃度為200 mmol·L-1時比對照顯著升高了74.84%；隨著鹽脅迫處理時間的延長，各濃度處理第14天時CAT活性均顯著高于第7天(圖3，C)。

2.4 NaHCO3處理對三色堇葉片葉綠素含量的影響

隨著NaHCO3處理濃度的增加，三色堇葉片葉綠素含量(總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b)在處理第7天和第14天均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢；第14天葉綠素含量在對照和25 mmol·L-1時高于第7天，在其余濃度下均低于第7天(圖4，A～C)。其中，在鹽脅迫處理的第14天，脅迫濃度為25 mmol·L-1時最高，葉片總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b含量分別比對照增加了7.92%、8.50%和6.12%，但差異不顯著(P>0.05)；在濃度為200 mmol·L-1時分別比對照顯著降低了23.26%、28.95%和5.92%(P<0.05)。

2.5 NaHCO3處理對三色堇葉片MDA含量的影響

圖5顯示，隨著NaHCO3處理濃度的增加，三色堇葉片MDA含量在處理后第7天和第14天均呈現(xiàn)出持續(xù)升高的趨勢，且第14天始終高于第7天，但在各濃度處理下均與對照有顯著差異(P<0.05)。其中，在鹽脅迫處理的第14天，葉片MDA含量脅迫濃度為200 mmol·L-1時最高，比對照顯著增加了81.90%。

3 討 論

NaHCO3是干旱半干旱地區(qū)土壤中最常見的堿性鹽[27]，當土壤中NaHCO3含量過高時，對植物會產(chǎn)生Na+和pH脅迫，對植物的生長造成不良影響，嚴重時會使植物代謝失調(diào)，甚至死亡[28]。生長量是植物的生理生化過程反饋于植物的外在表現(xiàn)，也是能用肉眼直接觀測到的表型特征，對逆境脅迫下植物的抗逆能力能進行直觀的測定，植物在逆境環(huán)境下的生長量與抗逆能力呈正相關，生長好，則表明其抗逆能力高[29]。本研究中，在NaHCO3濃度小于等于100 mmol·L-1處理下，三色堇株高生長量高于或等于對照，而當鹽濃度大于100 mmol·L-1時，三色堇株高生長量隨著鹽濃度的升高明顯下降?？梢姡寥乐写嬖谝欢舛鹊腘aHCO3(≤100 mmol·L-1)有利于三色堇植株的生長，但當土壤中鹽濃度過高時(>100 mmol·L-1)對三色堇的高生長造成抑制。這與張木清等對NaCl脅迫下甘蔗(Saccharumofficinarum)的相關研究結果相同[30]。

同時，植物在鹽脅迫條件下會通過主動積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)SS、SP、Pro等來維持細胞滲透勢，避免鹽分過多地進入細胞，從而降低逆境脅迫對植物的危害程度，其累積量與抗逆能力呈正相關[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，三色堇植株在NaHCO3脅迫下，其葉片SS、SP、Pro積累量顯著高于對照，說明三色堇在NaHCO3脅迫下能通過提高細胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來提高細胞的滲透壓，維持細胞的吸水和保水能力，減緩鹽脅迫對細胞的傷害，這與Al-Farsi等對鹽脅迫下紫花苜蓿(Medicagosativa)的相關研究結果一致[32]。

另外，植物在逆境脅迫下會通過提高抗氧化酶活性來清除過氧化氫、超氧陰離子等ROS(活性氧)，以減緩ROS對植物細胞的傷害[9,31]，其活性與植物的抗逆性呈正相關。本研究發(fā)現(xiàn)，三色堇植株經(jīng)NaHCO3處理后，其葉片中SOD、POD、CAT活性整體呈現(xiàn)先升高后降低趨勢；在鹽濃度小于等于150 mmol·L-1時，SOD、POD、CAT活性高于對照，當鹽處理濃度大于150 mmol·L-1時，除CAT活性外，SOD、POD活性均低于對照，說明NaHCO3鹽濃度過高會加劇了三色堇細胞膜脂過氧化。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性在鹽脅迫處理14 d時均表現(xiàn)出隨濃度的升高而降低的趨勢，這可能是當NaHCO3濃度高于三色堇自身能調(diào)節(jié)的范圍時，導致滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)和抗氧化酶系統(tǒng)紊亂，防御系統(tǒng)活性已不能維持較高水平，進而抑制了三色堇的生長和發(fā)育，這與梁曉艷等對NaCl脅迫下花生(Arachishypogaea)的相關研究結果一致[3]。

此外，葉綠體是植物進行光合作用的主要細胞器，在鹽脅迫條件下，由于金屬離子的毒害作用，導致葉綠體內(nèi)葉綠素降解[33]，其降低程度與植物所受離子脅迫程度呈現(xiàn)正相關。本研究發(fā)現(xiàn)，在NaHCO3脅迫第14天時，三色堇葉片葉綠素含量以25 mmol·L-1處理時最高，超過此濃度后葉綠素降解速度加快，含量迅速降低，從而降低了光合速率，抑制了三色堇的正常生長，這與呂秀云等對鹽脅迫下藜(Chenopodiumalbum)的相關研究結果一致[34]。

最后，MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量與植物的抗逆性呈負相關[29]，因此可以用MDA含量評價植物的抗逆境能力。本研究發(fā)現(xiàn)，三色堇植株經(jīng)NaHCO3脅迫后，葉片MDA含量在整個脅迫處理期間均呈持續(xù)升高趨勢，說明隨著NaHCO3濃度的升高脅迫程度加劇，對質(zhì)膜系統(tǒng)的傷害持續(xù)加大，這與膜質(zhì)過氧化而引起的細胞膜受損導致的電解質(zhì)外滲有關。細胞膜是外界鹽離子進入植物細胞的第一道屏障，在植物抗鹽生理中有重要作用[35]，當細胞組織受到離子脅迫時，三色堇體內(nèi)自由基的大量產(chǎn)生引發(fā)膜脂過氧化[36]，細胞膜的完整性和功能受到傷害，膜的穩(wěn)定性降低，導致細胞內(nèi)的原生質(zhì)體和大分子物質(zhì)通過損傷部位大量外溢[35-37]，影響三色堇的正常代謝，嚴重時會導致細胞死亡。同時，有研究表明，當土壤中Na+過高時，Na+將會取代細胞膜上的Ca2+，導致細胞膜出現(xiàn)漏洞，細胞內(nèi)原生質(zhì)體外滲，進而引起離子種類和離子濃度發(fā)生改變，這與李子英等對鹽脅迫下柳樹(Salixpsammophila)的相關研究結果一致[29]。

4 結 論

NaHCO3處理三色堇植株后，對其葉片抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、光合色素含量、丙二醛含量以及株高生長量產(chǎn)生了顯著影響。在處理后14 d，隨NaHCO3濃度的升高，其葉片可溶性糖、可溶性蛋白、葉綠素含量和過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性，以及株高生長量均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，而丙二醛含量呈持續(xù)升高趨勢。