何旎清，黃鳳凰，余敏祥，楊德衛(wèi)

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所,福州 350018)

水稻(OryzasativaL.)為人類最重要的糧食作物之一，全球超過一半以上的人口以稻米為主食。據(jù)預(yù)測(cè)，到2030年世界人口將達(dá)到80億，屆時(shí)全球?qū)λ井a(chǎn)量的需求將比現(xiàn)在增加約40%[1]。隨著人民生活水平的提高，水稻粒型已成為當(dāng)前消費(fèi)者與育種家共同關(guān)注的熱點(diǎn)，提高產(chǎn)量和改良品質(zhì)已成為現(xiàn)代水稻育種兩個(gè)主要目標(biāo)[2]。

水稻粒長(zhǎng)是水稻粒型構(gòu)成因素之一，并直接影響水稻的單產(chǎn)，其中粒長(zhǎng)對(duì)水稻粒重貢獻(xiàn)最大[3-4]。有研究表明，長(zhǎng)粒水稻品種米質(zhì)相對(duì)較好[5]。隨著人們生活條件的改善，優(yōu)質(zhì)稻米越來越受到人們的喜愛，研究表明，長(zhǎng)粒稻米通常表現(xiàn)較好的外觀品質(zhì)[6]。粒長(zhǎng)是稻米品質(zhì)重要指標(biāo)之一，水稻粒長(zhǎng)相關(guān)研究已成為當(dāng)前水稻遺傳學(xué)家和育種家研究的熱點(diǎn)。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前鑒定與粒長(zhǎng)相關(guān)的QTL有120多個(gè)(http://www.gramene.org/)。由于粒長(zhǎng)性狀受環(huán)境影響大，研究者利用不同的研究方法與材料，鑒定的QTLs之間會(huì)存在重復(fù)性[7-8]。目前已有PGL1、GS2和qTGW3等[9]12個(gè)粒長(zhǎng)相關(guān)基因被克隆。研究發(fā)現(xiàn)qTGW3有2個(gè)等位基因TGW3和GL3.3，qTGW3編碼一個(gè)類GSK3/SHAGGY家族成員的激酶OsSK41/OsGSK5，能與生長(zhǎng)素應(yīng)答因子OsARF4互作并將其磷酸化[10]。TGW3編碼一個(gè)類似糖原合酶激酶GSK3的激酶，是粒長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子，能協(xié)同改變穎殼中細(xì)胞的大小和數(shù)量[11]。GL3.3與之前發(fā)現(xiàn)的GS3在遺傳上有上位互作效應(yīng)，兩者疊加能導(dǎo)致水稻粒型顯著增大[12]。

目前雖然克隆了一些水稻粒長(zhǎng)相關(guān)的基因，但有些基因存在與不良性狀連鎖的現(xiàn)象，從而限制這些基因在生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍[13]。研究顯示，APG是粒長(zhǎng)基因PGL1拮抗性互作因子，APG是一個(gè)負(fù)向調(diào)節(jié)子，其功能受PGL1的抑制[14]。因此，鑒定和分離更多水稻粒長(zhǎng)基因?qū)λ酒焚|(zhì)遺傳改良以及揭示粒形性狀遺傳調(diào)控機(jī)理具有極其重要的意義。

本研究利用前期創(chuàng)制的長(zhǎng)粒恢復(fù)系材料R20-4，通過正向遺傳學(xué)的方法，對(duì)該長(zhǎng)粒性狀進(jìn)行基因鑒定與定位分析，同時(shí)將恢復(fù)系R20-4分別與三系不育系‘慶源A’、‘定源A’、‘啟源A’和‘靚香A’進(jìn)行測(cè)交，并對(duì)測(cè)交組合的粒長(zhǎng)進(jìn)行分析。本研究可為后期GL12-1基因的克隆、功能研究以及育種利用研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料及種植

長(zhǎng)粒恢復(fù)系R20-4為含有稻瘟病抗性基因Pigm-1的恢復(fù)系，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所通過分子標(biāo)記輔助選擇選育而成[15]。CO39為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所種質(zhì)創(chuàng)制研究室保存的遺傳材料?！畱c源A’、‘定源A’、‘啟源A’和‘靚香A’為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所選育的三系不育系。

2019年8月R20-4與CO39進(jìn)行正反交，2019年12月進(jìn)行海南加代繁殖，2020年7月R20-4、CO39以及構(gòu)建的F2群體均種植在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所連坂試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。兩個(gè)親本分別種植1個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種植4行，每行8株，所有材料均單株種植，按照常規(guī)的栽培技術(shù)進(jìn)行管理。

1.2 方法

1.2.1 長(zhǎng)粒性狀的遺傳分析將R20-4與CO39進(jìn)行正反交，待群體完全成熟后，根據(jù)F1的粒型表型，以及F2代分離群體中長(zhǎng)粒單株與短粒單株的調(diào)查比例，來分析長(zhǎng)粒性狀的遺傳特性。

1.2.2 親本與F2性狀調(diào)查分析對(duì)R20-4和CO39粒長(zhǎng)性狀進(jìn)行調(diào)查分析，稻谷粒長(zhǎng)等測(cè)定參照Tan等[16]方法進(jìn)行。成熟后，對(duì)正交F2群體中極端長(zhǎng)粒單株和短粒單株進(jìn)行取樣，選擇極端長(zhǎng)粒20株和極端短粒20株作為連鎖群體，正交F2群體中獲得的短粒單株作為后期的定位群體。

1.2.3 長(zhǎng)粒基因初步定位水稻組織DNA的提取、PCR的擴(kuò)增以及樣品電泳檢測(cè)參照楊德衛(wèi)等[17]方法。利用實(shí)驗(yàn)室506對(duì)SSR引物對(duì)R20-4和CO39進(jìn)行多態(tài)性分析，利用篩選的多態(tài)性引物，對(duì)粒長(zhǎng)基因進(jìn)行連鎖分析。

1.2.4 長(zhǎng)?；蚓?xì)定位標(biāo)記的開發(fā)和對(duì)應(yīng)分子標(biāo)記的物理距離均參照楊德衛(wèi)等[17]方法。利用粳稻品種‘日本晴’和秈稻品種‘9311’兩品系已公布的核苷酸序列(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov)，找到序列之間有差異的部分，差異大小一般選擇在50 bp以下，然后利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0在其兩側(cè)設(shè)計(jì)引物。

1.2.5 長(zhǎng)?；蛴N利用研究將恢復(fù)系R20-4分別與‘慶源A’、‘定源A’、‘啟源A’和‘靚香A’三系不育系雜交，并對(duì)配制組合F1的粒長(zhǎng)性狀進(jìn)行調(diào)查分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本粒長(zhǎng)性狀比較

為選擇定位群體的親本，本研究對(duì)恢復(fù)系R20-4和CO39粒長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)查分析顯示，恢復(fù)系R20-4粒長(zhǎng)為(11.31±0.25) mm，CO39粒長(zhǎng)為(8.25±0.18)mm(圖1)，分析表明R20-4的粒長(zhǎng)與CO39相比，差異達(dá)到極顯著水平 (P<0.01)。

2.2 恢復(fù)系R20-4長(zhǎng)粒性狀的遺傳分析

為了分析R20-4長(zhǎng)粒性狀的遺傳特性，本研究將R20-4和CO39進(jìn)行正反交。結(jié)果顯示，F(xiàn)1植株均表現(xiàn)長(zhǎng)粒的表型。將正反交F1自交收獲后種植，成熟后調(diào)查F2群體粒長(zhǎng)性狀分離情況，長(zhǎng)粒與短粒單株的分離比經(jīng)卡平方(χ2)檢驗(yàn)符合孟德爾遺傳3∶1比例(表1)，粒長(zhǎng)性狀在正反交F2群體中呈現(xiàn)雙峰分布(圖2)。以上結(jié)果說明R20-4長(zhǎng)粒性狀是由1對(duì)顯性基因控制的。

表1 長(zhǎng)粒性狀的遺傳分析

2.3 R20-4長(zhǎng)粒基因的初步定位

為了定位恢復(fù)系R20-4長(zhǎng)?；蛩谌旧w的位置，本研究利用實(shí)驗(yàn)室合成的506對(duì)SSR和Indel引物標(biāo)記，對(duì)R20-4和CO39進(jìn)行多態(tài)性篩選，有96對(duì)引物在兩個(gè)親本之間存在多態(tài)性。利用這96對(duì)引物對(duì)F2群體中的20個(gè)極端長(zhǎng)粒單株和20個(gè)極端短粒單株進(jìn)行連鎖分析。發(fā)現(xiàn)水稻第12染色體長(zhǎng)臂上標(biāo)記Indel-12-3和Indel-12-7可能與粒長(zhǎng)基因存在連鎖。對(duì)F2群體中45個(gè)小粒單株進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)Indel-12-3和Indel-12-7與短粒位點(diǎn)存在連鎖關(guān)系。最終利用314個(gè)短粒隱性單株，將該長(zhǎng)?；蛭稽c(diǎn)定位于水稻第12染色體上標(biāo)記Indel-12-3和Indel-12-7之間，物理距離約4.5 Mb，并命名為GL12-1(圖3，A)。

2.4 長(zhǎng)?；蜻M(jìn)一步定位

本研究在Indel-12-3和Indel-12-7之間合成20對(duì)Indel引物，多態(tài)性檢測(cè)顯示只有4對(duì)引物具有多態(tài)性(表2)，分別為Indel-3、Indel-6、Indel-10和Indel-16，利用這4對(duì)多態(tài)性引物對(duì)314個(gè)短粒隱形單株進(jìn)行分析，最終將GL12-1基因定位在標(biāo)記Indel-10和Indel-16之間，物理距離約為900 kb (圖3，B)。

表2 Indel引物

2.5 R20-4長(zhǎng)粒基因的利用

2021年7月分別將R20-4以及配制的4個(gè)雜交組合慶源A/R20-4、定源A/R20-4、啟源A/R20-4和靚香A/R20-4種植在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所連坂試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，待成熟后對(duì)其粒長(zhǎng)性狀進(jìn)行分析，并對(duì)其對(duì)應(yīng)的不育系粒長(zhǎng)性狀進(jìn)行分析。結(jié)果表明，組合慶源A/R20-4、定源A/R20-4、啟源A/R20-4的粒長(zhǎng)與R20-4相比，沒有明顯差異，但靚香A/R20-4的粒長(zhǎng)與R20-4相比，表現(xiàn)粒長(zhǎng)變長(zhǎng)，差異達(dá)到顯著水平(表3)。

表3 恢復(fù)系R20-4及其配制組合的粒長(zhǎng)分析

3 討 論

3.1 GL12-1可能是一個(gè)新的粒長(zhǎng)控制基因

目前為止，已發(fā)現(xiàn)120多個(gè)與粒長(zhǎng)相關(guān)的基因或QTL (http://www.gramene.org/)分布于水稻不同染色體上，主要位于第1、2、3、7和10號(hào)染色體上。本研究利用圖位克隆的方法，將R20-4長(zhǎng)粒主效基因GL12-1進(jìn)行了遺傳定位，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)間還沒有克隆的粒長(zhǎng)相關(guān)基因。因此，我們推測(cè)GL12-1可能是一個(gè)新的控制粒長(zhǎng)相關(guān)基因。

GL12-1候選基因區(qū)間900 kb內(nèi)包含有100多個(gè)候選基因，所以目前還無法確定哪個(gè)基因?yàn)槠浜蜻x基因。另外，由于CO39與R20-4均為秈稻材料，他們之間的遺傳差異較小，多態(tài)性引物少。本研究在進(jìn)一步定位過程中，合成的20對(duì)引物僅有4對(duì)具有多態(tài)性。隨后，我們?cè)贗ndel-10和Indel-16標(biāo)記之間又合成8對(duì)Indel引物，檢測(cè)結(jié)果顯示這8對(duì)引物均沒有多態(tài)性。目前我們正在構(gòu)建遺傳差異較大群體，以期完成GL12-1基因的精細(xì)定位及克隆工作。

3.2 GL12-1基因可能具有較好的育種利用價(jià)值

水稻粒長(zhǎng)性狀在不同水稻品種之間存在多樣性變化，一般在6～15 mm之間。例如粳稻品種‘川7’的粒長(zhǎng)僅有7.32 mm，而秈稻代表品種‘明恢63’粒長(zhǎng)達(dá)到10.2 mm[9]。水稻粒長(zhǎng)性狀，由于材料遺傳背景的影響，其遺傳特性也不盡相同，主要受多基因控制以及由主效基因加微效基因共同調(diào)控[18-19]。

在遺傳學(xué)方面，粒長(zhǎng)的遺傳基礎(chǔ)極為復(fù)雜。研究者利用3個(gè)長(zhǎng)粒材料與3個(gè)短粒材料配制不同的雜交組合，研究表明粒長(zhǎng)性狀為多基因控制的數(shù)量性狀，其加性效應(yīng)占比較大[20]；周清元等[21]研究表明，雜種F1的粒長(zhǎng)介于兩個(gè)親本之間；賈小麗等[22]利用重組自交系群體(recombinant inbred lines，RILs) 研究發(fā)現(xiàn)，粒長(zhǎng)性狀呈連續(xù)分布，且表現(xiàn)出明顯超親分離現(xiàn)象。

在基因功能方面，粒長(zhǎng)基因調(diào)控遺傳機(jī)理極為復(fù)雜。有的為正調(diào)控，如GLW7[23]；有的為負(fù)調(diào)控，如GS3[24]；有的由于氨基酸變化，導(dǎo)致粒長(zhǎng)變化，如qGL3[25]；有的由于結(jié)構(gòu)變異，導(dǎo)致功能喪失，從而引起粒長(zhǎng)變化，如qTGW3[11]；有的由于基因轉(zhuǎn)錄提前終止，導(dǎo)致產(chǎn)生不同大小蛋白，從而引起其粒長(zhǎng)變化，如GL3.2[26]；有的與某些蛋白或者轉(zhuǎn)錄因子互作，引起蛋白表達(dá)變化，進(jìn)而影響粒長(zhǎng)變化，如Gnp4[27-28]。

本研究利用長(zhǎng)粒材料R20-4，在配制的4個(gè)不同不育系雜交組合中，有3個(gè)組合表現(xiàn)親本R20-4粒長(zhǎng)特性，有1個(gè)組合表現(xiàn)超親遺傳的特點(diǎn)，推測(cè)長(zhǎng)?；騁L12-1以顯性遺傳為主。配制的雜交組合R20-4/靚香A表現(xiàn)超親遺傳現(xiàn)象，原因可能是在R20-4與靚香A形成雜交組合中，由于有些基因編碼蛋白之間存在互作，或者微效基因疊加，從而影響或調(diào)控其組合粒長(zhǎng)變化。

因此，本研究鑒定的長(zhǎng)?；騁L12-1在今后粒型育種可能具有較廣的應(yīng)用價(jià)值。尤其在雜交水稻選育過程中，兩個(gè)親本只需一個(gè)親本含有GL12-1，其組合就表現(xiàn)長(zhǎng)粒表型。后期我們將通過對(duì)GL12-1基因進(jìn)一步克隆，開發(fā)功能性分子標(biāo)記，并結(jié)合常規(guī)雜交技術(shù)，以期快速有效地聚合多個(gè)基因的育種目標(biāo)，這不僅降低了育種成本，同時(shí)縮短了育種時(shí)間。

最后，隨著國(guó)家的快速發(fā)展和社會(huì)的進(jìn)步，人們已經(jīng)步入小康社會(huì)，在吃飽的同時(shí)人們開始追求吃好、吃健康。長(zhǎng)粒水稻品種在外觀及口感等方面受到人們的喜愛[10, 13, 29]。一方面，在粒型形成遺傳學(xué)方面取得很大進(jìn)展，對(duì)粒型性狀遺傳及基因功能方面認(rèn)識(shí)較為明晰[10, 29]。而另一方面，對(duì)水稻粒型基因調(diào)控機(jī)理方面的研究相對(duì)較少，如在大面積田間推廣長(zhǎng)粒品種并達(dá)到產(chǎn)量提升的效果更是少之又少。因此，研究者需進(jìn)一步加大水稻粒長(zhǎng)種質(zhì)創(chuàng)新、遺傳規(guī)律探索以及調(diào)控機(jī)理等基礎(chǔ)方面研究，這對(duì)于加速水稻粒長(zhǎng)新品種選育以及解決糧食問題具有重要意義。

本研究通過圖位克隆的方法，對(duì)水稻長(zhǎng)粒基因GL12-1進(jìn)行了鑒定，該基因可能是一個(gè)新的粒長(zhǎng)基因。與不育系測(cè)交表明，GL12-1具有顯性遺傳特性，該基因在今后的水稻粒型育種中可能具有較廣泛的應(yīng)用價(jià)值。