陳倚天，陳 旭，黃艷霞，董星月，張棟梁

頜骨缺損是口腔科常見的疾病之一，如唇腭裂、牙槽突裂、創(chuàng)傷導(dǎo)致的牙槽骨缺損等。修復(fù)材料主要有自體骨、異體骨和人工替代材料等。自體骨需開辟第二術(shù)區(qū)且量有限，異體骨和人工骨替代材料促血管化不足，不具備誘導(dǎo)骨生成的能力。肝素化羥基磷灰石-磷酸三鈣(hydroxyapatite-tricalcium phosphate，HA-TCP)明膠支架是一種新興的組織工程骨，通過體外構(gòu)筑支架材料-種子細(xì)胞-生長(zhǎng)因子復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)骨的形態(tài)和功能上的修復(fù)。課題組前期從模擬天然骨形態(tài)角度出發(fā)，構(gòu)建復(fù)合材料支架。本研究在支架材料上裝載血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，并用不同濃度的肝素對(duì)支架材料進(jìn)行處理，評(píng)估其理化性能、VEGF負(fù)載率和緩釋效果、抑菌能力，對(duì)其誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cell，BMSC)成骨分化能力進(jìn)行檢測(cè)，為臨床應(yīng)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和設(shè)備

1.1.1 主要試劑 肝素鈉(索萊寶，中國(guó))；rhVEGF 165(R&D，美國(guó))；牛血清白蛋白(Sigma，美國(guó))；人VEGF Elisa試劑盒(欣博盛，中國(guó))；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(ATCC，美國(guó))；間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(ScienCell，美國(guó))；α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))；特級(jí)胎牛血清FBS(Gibco，美國(guó))。

1.1.2 主要設(shè)備 電子萬(wàn)能機(jī)(MTS，美國(guó))；掃描電子顯微鏡(HITACHI，日本)；全自動(dòng)比表面積孔隙度分析儀(Micromeritic，美國(guó))；冷凍干燥機(jī)(Scanvac，丹麥)；酶標(biāo)儀(SPECTRA，美國(guó))；倒置顯微鏡(Olympus，日本)；微生物培養(yǎng)箱(ThermoFisher，美國(guó))；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Invitrogen，美國(guó))；激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國(guó))。

1.2 HA-TCP明膠支架的物理結(jié)構(gòu) (1)掃描電鏡觀察HA-TCP明膠支架表面形態(tài)、孔隙大小和分布，Image-J軟件測(cè)量孔隙大小。支架制成圓柱體(φ14.5 mm×14.5 mm)，電子萬(wàn)能機(jī)測(cè)量其壓縮強(qiáng)度，計(jì)算彈性模量。(2)HA-TCP明膠支架碾磨成顆粒凍干收集，自動(dòng)比表面積分析儀測(cè)試支架BET比表面積(介孔)(50 ℃，8 h)，繪制吸附脫附曲線、比表面積圖、孔容、孔徑分布圖。

1.3 HA-TCP明膠支架的VEGF裝載率與釋放速率 實(shí)驗(yàn)分組：肝素化HA-TCP明膠支架材料組(H0.5組：肝素濃度0.5 mg/ml；H1.0組：肝素濃度1.0 mg/ml)，設(shè)立未進(jìn)行肝素化HA-TCP明膠材料為空白對(duì)照組。取3組支架各10 mg(=6)稱重(M)，超純水浸泡30 min，濾紙吸干支架表面水分后稱重(M)，計(jì)算吸水率：P=(M-M)/ M×100%。將支架浸泡于4 ℃的1 μg/ml VEGF溶液中24 h，收集上清液稱重(m)。使用PBS沖洗，然后收集沖洗液稱重(m)。將結(jié)合VEGF的支架浸泡于1 ml PBS溶液中，每隔24 h收集上清液稱重，共14 d(m-m)，每組取3個(gè)10mg支架。酶標(biāo)儀檢測(cè)，設(shè)空白孔，標(biāo)準(zhǔn)孔，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，計(jì)算VEGF濃度，記為n(剩余上清液)、n(沖洗液)，n-n。

VEGF結(jié)合量=m-m×n/ρ-m×n/ρ；

VEGF釋放量= d(n-14×m/ρ)。

1.4 HA-TCP明膠支架的抑菌性能 取金黃色葡萄菌懸液，在9個(gè)LB培養(yǎng)基平板上分別滴加100 μl，使用涂布器均勻涂布，再將三組樣品(=3)圓片分別放入平板中心位置，37 ℃培養(yǎng)24 h后，Image-J軟件測(cè)量抑菌圈直徑。

1.5 HA-TCP明膠支架對(duì)BMSC生長(zhǎng)的影響 BMSC常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。(1)細(xì)胞生長(zhǎng)：HA-TCP明膠支架經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌后，置于BMSC細(xì)胞懸液中，搖床震蕩(37 ℃，1 h)，后靜置4 h，再加入培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，4%多聚甲醛固定4 h后凍干，掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；(2)成骨分化：用α-MEM培養(yǎng)基制備三種支架浸提液，添加到成骨培養(yǎng)基中培育BMSC細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后，茜素紅S染色液染色20～30 min，去離子水清洗，加入10%氯化十六烷吡啶1 ml，室溫下孵育30 min，酶標(biāo)儀(λ)測(cè)定吸光值。

2 結(jié) 果

2.1 HA-TCP明膠支架表征 HA-TCP明膠支架呈圓柱形，淡黃色，表面疏松多孔，質(zhì)地較硬(圖1A)。掃描電鏡下可見支架表面清晰孔隙，孔徑大小分布范圍廣，10～400 μm，孔間可見豐富的交通(圖1B)。

2.2 HA-TCP明膠支架物理特征 HA-TCP明膠在以1 mm/min的速度加力情況下，支架未發(fā)生碎裂，符合塑性形變特征。在形變量0%～15%時(shí)，應(yīng)力-應(yīng)變曲線平滑；應(yīng)力達(dá)0.76 MPa時(shí)，支架發(fā)生屈服。此后，支架逐漸被壓縮，應(yīng)力-應(yīng)變曲線出現(xiàn)細(xì)小鋸齒狀波動(dòng)，但應(yīng)力趨勢(shì)總體上升。當(dāng)支架形變量達(dá)65%，應(yīng)力達(dá)2.4 MPa時(shí)，支架塌陷，應(yīng)力明顯下降(圖2A)。對(duì)曲線5%內(nèi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合計(jì)算，支架彈性模量0.93 MPa，支架屈服強(qiáng)度0.76 MPa，最大承壓2.4 MPa。

2.3 BET比表面積測(cè)試 支架吸附脫附過程中吸附量-相對(duì)壓力的曲線形態(tài)近似為Type V型等溫線，在多層吸附過程中，發(fā)生毛細(xì)血管冷凝現(xiàn)象，吸附脫附曲線自0.25倍分壓開始分離，直至接近1.0倍分壓重新達(dá)到平衡(圖2B)，符合大孔材料特征。支架介孔于2～50 nm之間，最大量孔徑集中于20 nm處，平均大小為25.96 nm(圖2C)，BET比表面積為(1.01±0.06)m/g(圖2D)，介孔在10～28 nm時(shí)，脫附速度較快，隨后基本平緩(圖2E)。

2.4 HA-TCP明膠支架VEGF負(fù)載和釋放 三組HA-TCP明膠支架的吸水率在組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(>0.05)。空白組與H組和H組支架VEGF結(jié)合率之間均有顯著差異(<0.05)，H組與H組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。從支架VEGF釋放量率-時(shí)間曲線可以看出(圖3)，空白組自第1天起即釋放迅速，第4天累積釋放75%；在5 d后，H組釋放曲線較平緩，釋放速度明顯減緩；7 d后H組釋放曲線平緩，釋放率低于空白組和H組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。

2.5 HA-TCP明膠支架的抑菌性能 空白組抑菌圈直徑為(7.30±0.11)mm，H組抑菌圈直徑為(9.67±0.20)mm，H組抑菌圈直徑為(11.07±0.43)mm(=3)，三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，H組抑菌能力最強(qiáng)。

2.6 HA-TCP明膠支架對(duì)BMSC成骨分化的影響 掃描電鏡下可見，細(xì)胞在HA-TCP明膠支架上生長(zhǎng)良好，主要分布在材料表面，呈片狀、島狀分布，表面有突觸伸出，可見較多分泌顆粒(圖4)。定量檢測(cè)顯示，H組和H組的鈣化沉淀量高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。H組和H組無(wú)差異(圖5)。

3 討 論

3.1 支架理化性能對(duì)BMSC的影響 口腔頜面部骨無(wú)過大負(fù)載，對(duì)修復(fù)材料的絕對(duì)強(qiáng)度無(wú)過高要求，但是要求材料良好的可塑性和形態(tài)適應(yīng)性。Logie等認(rèn)為，支架應(yīng)具有足夠的機(jī)械完整性，以提供穩(wěn)定的固定，支架的楊氏模量與宿主骨相似十分重要，可以避免潛在的應(yīng)力遮擋。Discher等發(fā)現(xiàn)，支架的彈性還可以調(diào)節(jié)BMSC形態(tài)、增殖和分化行為。本研究制作的肝素化HA-TCP明膠支架，最大壓縮強(qiáng)度2.4 MPa，小于松質(zhì)骨，壓縮強(qiáng)度可達(dá)到穩(wěn)定的要求，滿足臨床使用，其彈性模量與松質(zhì)骨大致相同，應(yīng)力應(yīng)變行為類似松質(zhì)骨，無(wú)明顯的屈服點(diǎn)，應(yīng)力應(yīng)變曲線較平直，最大壓縮量可達(dá)65%，在植入過程中，可根據(jù)缺損形態(tài)塑形，可用于不規(guī)則區(qū)域的充填。這些特點(diǎn)保證了應(yīng)力傳遞。

骨組織工程支架微觀結(jié)構(gòu)最重要的是孔隙率、孔徑的大小以及孔與孔之間的連通性。支架的孔徑大小取決于所設(shè)計(jì)的骨組織類型。較小孔徑(直徑<75 μm)適合纖維組織的形成，而中等孔徑(直徑在75～100 μm)適合未礦化骨組織的形成，較大孔徑(直徑>200 μm)適合全礦化骨組織的形成，血管化則需要大孔徑(直徑>300 μm)，適于細(xì)胞生長(zhǎng)的材料孔徑范圍較大(直徑50～1000μm)。本研究制作的支架孔徑10～400 μm，分布范圍廣且均勻，滿足血管化、細(xì)胞生長(zhǎng)和成骨的要求。BET結(jié)果顯示，除10～400 μm的孔徑外，還存在15～25 nm的孔隙，利于細(xì)胞因子的交通、信號(hào)傳遞。

3.2 肝素和VEGF修飾支架對(duì)BMSC的影響 骨是一個(gè)高度血管化的器官，血管生成在成骨中起著重要的作用，VEGF是調(diào)控血管發(fā)育和血管生成的重要生長(zhǎng)因子之一。血管生成增加帶來(lái)了骨祖細(xì)胞以及礦化所必需的營(yíng)養(yǎng)、氧氣和礦物質(zhì)。成骨因子，如BMP2，從血管釋放，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化。而成熟的成骨細(xì)胞產(chǎn)生血管生成因子，如PDGF和VEGF，進(jìn)一步支持血管生成。因此，調(diào)節(jié)骨內(nèi)VEGF水平是治療受損骨修復(fù)和改善骨再生的潛在策略。肝素模擬ECM中生長(zhǎng)因子的結(jié)合方式，能有效保護(hù)生長(zhǎng)因子活性。Xu等采用反相乳液聚合技術(shù)，合成了肝素修飾的透明質(zhì)酸基水凝膠支架，BMP-2以恒定劑量接近零級(jí)釋放，可有效促進(jìn)MSCs軟骨誘導(dǎo)形成。VEGF在血管形成中具有重要的作用，其作用依賴于體內(nèi)適宜的釋放濃度。研究證實(shí)，長(zhǎng)期、穩(wěn)定、劑量相對(duì)較低的VEGF含量可能具有更好的遠(yuǎn)期效果，只有當(dāng)?shù)蜐舛萔EGF與高濃度BMP-2聯(lián)用時(shí)才會(huì)促進(jìn)骨形成，其原因在于VEGF有抑制BMPs/TGF-β下游的可能。本研究中的支架孔隙、介孔分布理想、吸水率高，物理吸附功能加好，提高了VECG結(jié)合率，也得出了相似結(jié)論。

3.3 支架的抑菌性 10%的骨缺損修復(fù)因細(xì)菌感染而失敗，材料表面改性、修飾提高抑菌性也一直是植入材料的研究熱點(diǎn)。本研究中支架材料具有一定的抑菌效果，與肝素修飾有關(guān)。肝素具有一定的抗菌活性，可與膠原形成類ECM結(jié)構(gòu)，有效結(jié)合抗菌肽等生物蛋白，提高材料抗感染能力。

本研究結(jié)果表明，載VEGF肝素化HA-TCP明膠支架材料具有與天然松質(zhì)骨相似的彈性模量和力學(xué)特性，壓縮強(qiáng)度可滿足臨床需求，孔徑分布范圍廣，肝素能顯著提高VEGF載量，具有更強(qiáng)的抑菌能力，可促進(jìn)血管再生，BMSC附著后生長(zhǎng)良好，并表現(xiàn)較好的骨分化能力，是一種理想的骨缺損修復(fù)材料，有較好的臨床應(yīng)用潛力。

致謝：中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所黃宇彬博士。