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茶多糖結(jié)構(gòu)特征研究進(jìn)展

2022-09-30 07:49陸安霞葉玉龍
食品科學(xué) 2022年17期
關(guān)鍵詞:多糖分子蛋白質(zhì)

陳 麗,陸安霞,劉 飛,葉玉龍,*

(1.宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部,四川 宜賓 644000;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,四川 成都 610066;3.精制川茶四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 611130)

茶多糖不同于茶葉中的纖維素、半纖維素、淀粉等均一性多糖,是一類由單糖、蛋白質(zhì)和礦質(zhì)元素等單元組成的具有生理活性的復(fù)合植物多糖。因其具有抗氧化、降血糖、抗癌等多種生物活性,受到國內(nèi)外茶葉研究者的廣泛研究,已有大量報(bào)道對茶多糖的生物活性進(jìn)行了詳盡的總結(jié),但其結(jié)構(gòu)特征仍缺乏系統(tǒng)的綜述。

茶多糖的結(jié)構(gòu)是其呈現(xiàn)生物活性的基礎(chǔ),組成十分復(fù)雜,具有品種多樣性、生育期多樣性和茶類多樣性等。作為一類生物大分子,其層次的分類沿用了蛋白質(zhì)的分類法,也可分為1~4級結(jié)構(gòu),本文主要綜述了茶多糖在茶中的含量、分子質(zhì)量、組成單元、糖苷鍵的類型、糖鏈分支的位置等一級結(jié)構(gòu)特征以及茶多糖分子三維結(jié)構(gòu)、微觀形貌等高級結(jié)構(gòu),以尋求其中規(guī)律。

1 茶中茶多糖的含量

茶多糖在茶中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.14%~10.73%之間,除了樣品本身的影響以外,與提取、純化和定量方法有很大的關(guān)系。茶中雜質(zhì)較多且茶多糖分子質(zhì)量差異較大,茶多糖定量尚欠缺精準(zhǔn)方法。一些研究用蒽酮-硫酸法定量,此方法測定的結(jié)果為可溶性總糖的含量,粗多糖中單糖、二糖和寡糖的存在會使檢測結(jié)果偏高;對于結(jié)合有蛋白質(zhì)、無機(jī)元素等成分的茶多糖,該方法測定結(jié)果偏低。需要注意的是,與蒽酮-硫酸反應(yīng)后,茶多糖產(chǎn)物的最大吸收波長與常用的葡萄糖(glucose,Glu)標(biāo)準(zhǔn)品不同,故使用Glu標(biāo)準(zhǔn)品會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低,宜用半乳糖(galactose,Gal)、阿拉伯糖(arabinose,Ara)或一定比例的混合多糖作為標(biāo)準(zhǔn)品。也有研究者通過茶多糖提取率來反映其含量,粗多糖中的色素、蛋白等雜質(zhì)的存在同樣會導(dǎo)致結(jié)果偏高,而提純后的茶多糖因分離純化過程中的損失導(dǎo)致結(jié)果偏低。

在不同的茶樹品種中,倪德江分析了9 個(gè)茶樹品種茶多糖的含量,揭示了茶多糖的品種多樣性,趙雪豐發(fā)現(xiàn)大葉種烏龍茶多糖含量高于中、小葉種。在不同生育期茶葉中,多數(shù)研究結(jié)果表明隨著茶葉成熟度的增加,參與縮合的單糖種類可能增多,分子質(zhì)量變大,茶多糖含量隨之增加,但倪德江的研究結(jié)果與之相反,可見茶多糖含量與茶葉成熟度并非完全呈正相關(guān),造成這種差異的原因目前尚未有相關(guān)報(bào)道說明。在茶樹的不同器官中,茶花的茶多糖含量高于茶果皮和茶葉。在同一片茶葉中,葉片正面通常比背面具有更高的茶多糖含量。在不同的茶類中,黑茶的茶多糖含量普遍較高,普洱茶多糖含量在渥堆過程中逐漸增加,起堆時(shí)降低,茯磚茶多糖含量高于天尖茶多糖含量,手工筑包茯磚茶多糖含量高于機(jī)械壓包茯磚茶多糖含量。一是因?yàn)楹诓璧脑陷^老,黑茶原料本身含有較多的茶多糖;二是微生物在渥堆過程中起到了重要作用,普洱渥堆產(chǎn)生的曲霉和茯磚發(fā)花產(chǎn)生的冠突散囊菌等菌屬能夠促進(jìn)束縛態(tài)茶多糖的分解,產(chǎn)生游離態(tài)茶多糖,同時(shí)也能夠促進(jìn)茶葉中不溶性的碳水化合物、蛋白質(zhì)等分解,與其他物質(zhì)絡(luò)合,增加各種可溶性茶多糖的含量,而手工筑包的緊實(shí)程度、通氣性更有利于提高微生物活性,黑茶起堆時(shí)酵母菌呼吸的糖消耗量大于糖生成量,導(dǎo)致茶多糖含量降低。對于其他的茶類,學(xué)者們普遍認(rèn)為發(fā)酵茶多糖含量高于不發(fā)酵茶,但也有研究結(jié)果與之相反,即綠茶高于烏龍茶和紅茶,且在烏龍茶加工過程中多糖含量均呈遞減趨勢,這可能是品種和發(fā)酵工藝的差異導(dǎo)致的。如上所述,發(fā)酵過程中束縛態(tài)的茶多糖同樣向游離態(tài)轉(zhuǎn)化,使茶多糖含量上升,而茶多糖水解程度同樣很大,同時(shí)也會發(fā)生非酶促褐變反應(yīng),生成相應(yīng)的醛類和吡咯類、吡嗪類等含氮化合物,使茶多糖含量下降,成品茶中茶多糖的含量取決于各因素綜合影響程度。適宜的茶樹生長環(huán)境也有利于茶多糖的積累。鐘興剛檢測到湖南茯磚和天尖茶多糖含量均較高,這是因?yàn)檠芯吭袭a(chǎn)自湘中和湘西茶區(qū),該地區(qū)氣候溫暖,降水量適中,土壤以紅、黃壤為主,日照時(shí)間短,晝夜溫差大,環(huán)境適宜;同樣,田玲檢測到貴州六盤水的4 種茶樣茶多糖含量也較高,這也與六盤水冬無嚴(yán)寒、夏無酷暑、雨量充沛、雨熱同季、晝夜溫差大的環(huán)境特點(diǎn)有關(guān)。

綜上所述,茶多糖含量受茶樹品種、成熟度、茶樹器官、茶葉加工方法、茶樹生長環(huán)境等多種因素的綜合影響,各因素對茶多糖含量的影響見表1。

表1 不同因素影響下的茶多糖含量Table 1 The polysaccharide content of tea varies depending on various factors

續(xù)表1

2 茶中茶多糖的平均分子質(zhì)量

分子質(zhì)量是茶多糖最重要的物理特性之一,茶多糖屬于大分子化合物,其純品指的是一定分子質(zhì)量范圍的相對均一多糖組分,所以茶多糖經(jīng)過分離純化后,需進(jìn)行純度的鑒定。常用于測定多糖分子質(zhì)量的方法包括凝膠滲透色譜法(gel permeation chromatography,GPC)和凝膠過濾色譜法(gel-filtration chromatography,GFC)。在不同茶葉樣品中發(fā)現(xiàn)的茶多糖重均分子質(zhì)量在2.56~3 900.00 kDa之間(表2)。

影響茶多糖分子質(zhì)量大小的因素有提取純化方法、茶樹器官部位和加工工藝等。茶多糖分子質(zhì)量會受洗脫液的影響,用蒸餾水洗脫的茶多糖是一種非均相多糖,用NaCl溶液洗脫,隨著NaCl洗脫濃度的升高,多糖的分子質(zhì)量降低且更均勻。在茶樹不同器官中,茶花多糖的分子質(zhì)量最大,為2.56~1 460.00 kDa,茶葉多糖和茶籽多糖的分子質(zhì)量分別為3.67~758.00 kDa和3.66~961.00 kDa。不同茶類中,綠茶(9.2~251.5 kDa)比烏龍茶(5.3~100.9 kDa)的分子質(zhì)量大,紅茶最低(3.8~32.7 kDa),這可能是發(fā)酵過程中碳水化合物被酶水解導(dǎo)致的,發(fā)酵程度越深,茶多糖分子質(zhì)量越小。白茶屬于不發(fā)酵或輕發(fā)酵茶,分子質(zhì)量為29 kDa。而普洱茶中茶多糖的分子質(zhì)量比綠茶多糖GTPS(251.5 kDa)大10 倍以上,這與渥堆過程中茶多糖含量增加的原理相同。

3 茶中茶多糖的組成單元

3.1 中性單糖與糖醛酸

中性單糖和糖醛酸是茶多糖的主要組成成分,以下3 種方法可以同時(shí)檢測二者的組分:1)與1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮柱前衍生后用反相高效液相色譜(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)分析;2)用三氟乙酸水解茶多糖的糖苷鍵后,對分解得到的單糖進(jìn)行乙?;苌儆脷庀嗌V(gas chromatography,GC)或氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)分析;3)通過離子交換色譜(ion exchange chromatography,IEC)直接定性定量,IEC法比GC-MS法更方便、準(zhǔn)確。咔唑-硫酸法和間羥基聯(lián)苯法常被用來測定糖醛酸的總量,有研究表明中性己糖和戊糖會對此方法的檢測結(jié)果造成干擾,間羥基聯(lián)苯法可以排除中性糖對檢測結(jié)果的影響。

目前在茶多糖中主要發(fā)現(xiàn)了8 種中性單糖,分別是Glu、鼠李糖(rhamnose,Rha)、Ara、甘露糖(mannose,Man)、核糖(ribose,Rib)、木糖(xylose,Xyl)、Gal和巖藻糖(fucose,F(xiàn)uc),在樣品中含量普遍較高的是Gal、Glu、Rha和Ara,其中93.75%的茶多糖含有Gal,90.62%的茶多糖含有Ara。糖醛酸只有半乳糖醛酸(galacturonic acid,GalA)和葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GluA)兩種,含糖醛酸的茶多糖僅有15.62%,這些茶多糖中,糖醛酸占總糖的12.14%~63.11%,部分中性單糖和糖醛酸的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 茶多糖中典型的中性單糖和糖醛酸結(jié)構(gòu)Fig. 1 Typical monosaccharide and uronic acid structures in tea polysaccharides

茶多糖根據(jù)中性單糖和糖醛酸的比例不同可分為中性茶多糖和酸性茶多糖,Wang Yuanfeng等測得中性茶多糖含有82.7%的總糖,其中糖醛酸只占12.9%,而酸性茶多糖含有85.5%的總糖,糖醛酸占39.8%,但二者的界定范圍尚不明確。它們的單糖組成種類有一定的差異,中性茶多糖中的單糖主要是Gal(67.6%),酸性茶多糖主要含有Rha、Ara、Gal、GalA以及少量Rib。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 將原始得分轉(zhuǎn)化為百分制,評分高于60分者視為健康素養(yǎng)合格;參加孕婦學(xué)校分為定期參加、偶爾參加及未參加3個(gè)等級,課程為期3個(gè)月,2次/周,共24次課程;喂養(yǎng)方式:母乳喂養(yǎng),嬰兒僅食用母乳,未使用任何其他事物;混合喂養(yǎng),同時(shí)給予嬰兒母乳與加工食品;人工喂養(yǎng),完全未食用母乳,一直予以奶粉等加工食品喂養(yǎng)。

中性單糖與糖醛酸的組成和含量同樣與實(shí)驗(yàn)方法、鮮葉的成熟度、茶樹不同器官、茶葉加工方法、茶樹生長環(huán)境等多種因素有關(guān)。

沸水提取的茶多糖含有除Fuc和Rib以外的其他6 種中性茶多糖,酶法輔助提取的茶多糖缺少Xyl和Man;純化過程中,用蒸餾水洗脫得到的茶多糖富含GluA,是一種典型的酸性多糖,用NaCl洗脫的組分均是中性茶多糖;Scoparo等用堿法提取綠茶和紅茶中的茶多糖,得到茶多糖粗提取物,再經(jīng)過透析、凍融和離心分離出可溶性和不可溶性茶多糖兩部分,可溶性多糖的中性單糖主要是Ara、Gal,而不溶性多糖主要含有Xyl。茶樹不同器官中,茶葉、茶籽和茶花中的茶多糖均含有Rha、Ara、Gal、Glu、Xyl、GalA和GluA,茶葉多糖還含有Man和Rib,茶籽多糖也含有Man。茶花多糖的中性糖(62.84%)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于茶葉多糖(59.62%)和茶籽多糖(47.58%)質(zhì)量分?jǐn)?shù);在Wei Xinlin等的研究中,茶花多糖的糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低,為14.32%,茶葉和茶籽多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為24.32%、22.78%;Wang Yuanfeng等在茶花多糖中發(fā)現(xiàn)了GalA,未發(fā)現(xiàn)GluA。以上研究結(jié)果表明,茶花多糖是一類中性茶多糖。針對茶樹生育期對單糖含量的影響,學(xué)者們的研究得出了不同的結(jié)果,招鈺等認(rèn)為隨著茶葉成熟度的增加,中性糖含量增多,而糖醛酸含量變化不大,而倪德江卻發(fā)現(xiàn)隨著鮮葉的老化,多糖中性糖和糖醛酸含量均呈先增加后減少的趨勢,峰值出現(xiàn)在第2葉。發(fā)酵過程中存在的強(qiáng)烈酶促氧化會使中性糖、糖醛酸含量都降低,多糖中的糖鏈和肽鏈均被顯著降解。招鈺等用同一種提取檢測方法,分析得出綠茶及烏龍茶的糖醛酸含量明顯高于黑茶和紅茶,尤其是紅茶糖醛酸的含量最低,約占茶多糖總量的1.95%;烏龍茶多糖中性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(63.09%),其次為黑茶(61.25%)、綠茶(48.01%)和紅茶(31.31%),這也與烏龍茶及黑茶原料較粗老有關(guān)。陳浩用酵母菌對云南普洱大葉種曬青綠茶進(jìn)行人工發(fā)酵,發(fā)酵前期普洱茶多糖中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.08%,發(fā)酵40 d后糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長至27.41%;對貯藏1、3 年和5 年的普洱茶分析發(fā)現(xiàn),3 種普洱茶多糖都是酸性多糖,且糖醛酸含量隨著茶葉貯藏年份的增加而增加,這是因?yàn)楹诓杓庸み^程中微生物的作用往往大于熱分解和自身酶促氧化,使糖醛酸含量上升。

3.2 蛋白質(zhì)與氨基酸

許多研究發(fā)現(xiàn),茶多糖經(jīng)重復(fù)脫蛋白后仍含有少量蛋白質(zhì),表明茶多糖是蛋白質(zhì)結(jié)合的多糖,進(jìn)一步的研究表明蛋白質(zhì)通過N—或O—共價(jià)鍵與糖鏈結(jié)合在一起。前人對茶多糖結(jié)合蛋白和組成蛋白質(zhì)的氨基酸展開了一系列研究,與游離蛋白質(zhì)和氨基酸的檢測方法一樣,蛋白質(zhì)的鑒定主要采用紫外光譜法,含量分析采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)、凱氏定氮法以及福林-酚法;氨基酸主要通過酸水解后用HPLC或氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

茶多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)在茶葉中的比例為1.87%~38.00%。Lu Xinshan等用Bradford法測定得出黃山毛峰綠茶多糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.1%;Wang Yuefei等同樣用Bradford法測定了從烏龍茶中分離出的TTPS、FTPS和DTPS 3 種茶多糖中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.57%、7.68%和9.30%;Scoparo等在可溶性綠茶和紅茶多糖中發(fā)現(xiàn)了12%和19%的蛋白質(zhì);普洱茶多糖的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0%。由此并未發(fā)現(xiàn)茶多糖中蛋白質(zhì)的存在規(guī)律。此外,并不是所有的茶多糖都含有蛋白質(zhì),Lee等從綠茶中得到酸性多糖組分中未檢測到蛋白質(zhì)。

在茶多糖中共檢測到了18 種氨基酸。Chen Haixia等用HPLC法在綠茶多糖中檢測到了15 種氨基酸,以甘氨酸(glycine,Gly)、谷氨酸和天冬氨酸(aspartic acid,Asp)為主,其質(zhì)量比為1.16∶0.94∶0.50。Wang Dongfeng等用氨基酸分析儀對安徽茶樣的茶多糖氨基酸進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)了17 種氨基酸,含量較高的也是谷氨酸(24.23%)、Asp(18.27%)和Gly(17.89%)??扇苄跃G茶多糖中組成蛋白質(zhì)的氨基酸以羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)、絲氨酸(serine,Ser)、蘇氨酸(threonine,Thr)和半胱氨酸(cysteine,Cys)為主;在可溶性紅茶多糖的蛋白質(zhì)中,含量最豐富的氨基酸是Hyp、Ser、Thr和谷氨酸,值得注意的是,Cys在綠茶多糖中的相對含量為9.6%,而紅茶多糖中沒有檢測到Cys。福建白茶多糖的蛋白質(zhì)包含17 種氨基酸,以谷氨酸、脯氨酸(proline,Pro)、苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)、亮氨酸(leucine,Leu)、Ser和Asp為主。西湖地區(qū)茶樹鮮葉多糖中含有15 種必需氨基酸,總含量為68.06 mg/g,蛋白質(zhì)含量為58.49 mg/g,說明茶多糖中除了組成蛋白質(zhì)的氨基酸還含有獨(dú)立連接糖鏈的氨基酸。

茶多糖分子質(zhì)量及單糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸的組成見表2。

表2 茶多糖分子質(zhì)量及單糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸的組成Table 2 Molecular mass, monosaccharide composition, and protein and uronic acid contents of tea polysaccharides

3.3 無機(jī)元素

在茶多糖中也發(fā)現(xiàn)了鐵、鎂、鋅、硒和稀土元素(rare earth,REE)等無機(jī)元素,無機(jī)元素在茶多糖中的含量主要由原子熒光光譜(atomic fluorescence spectroscopy,AFS)或電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(inductively coupled plasma emission spectrometer,ICP)測定。富硒茶的茶多糖硒含量同樣較高,Wang Yuanfeng等報(bào)道了富硒綠茶中分離到的Se-TPS、Se-TPS1、Se-TPS2、Se-TPS3 4 種茶多糖分別含硒1.987、0.970、0.440 μg/g和0.340 μg/g。稀土微肥在我國廣泛應(yīng)用,以提高包括茶葉在內(nèi)的作物的產(chǎn)量和質(zhì)量,因此茶多糖中也存在稀土元素,Wang Dongfeng等在茶多糖檢測到1 mg/g REE,包括La、Ce、Nd、Pr和Y共5 種,它們是自然界中最常見的REE,占總量的90%左右。

4 茶中茶多糖的糖鏈結(jié)構(gòu)

茶多糖糖鏈結(jié)構(gòu)研究包括異頭物的構(gòu)型、糖苷鍵類型、單糖序列、糖鏈有無分支、分支的位置和長短等。能有效解析糖鏈結(jié)構(gòu)的方法有化學(xué)方法、物理方法和生物方法,其中最為常用的方法包括紅外光譜法、高碘酸氧化法、部分酸水解法、Smith降解法、甲基化分析法和核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)法等。

表3 茶多糖的紅外光譜分析[10,19,22,28,43]Table 3 Infrared spectral analysis of tea polysaccharides[10,19,22,28,43]

高碘酸氧化可選擇性斷裂糖分子中的連二羥基或連三羥基之間的C—C鍵,生成相應(yīng)的多糖醛、甲醛或甲酸。每開裂1 個(gè)C—C鍵消耗1 分子高碘酸,通過測定高碘酸的消耗量及甲酸的釋放量,可以推斷糖苷鍵的位置。若1 mol糖殘基消耗2 mol高碘酸的同時(shí)釋放1 mol甲酸,證明該單糖殘基中含有連三羥基,推測是以1→6或1→鍵合的吡喃己糖;若1 mol糖殘基只消耗1 mol高碘酸,證明該單糖殘基中含有連二羥基,推測是以1→2、1→4、1→2,6、1→4,6鍵合的吡喃己糖,或1→2、1→4鍵合的吡喃戊糖,或1→5鍵合的吡喃戊糖;若糖殘基不消耗高碘酸,證明該單糖殘基中無連羥基,推測是以1→3鍵合的吡喃己糖、吡喃戊糖、呋喃戊糖,或1→2鍵合的呋喃戊糖。Smith降解是將高碘酸氧化產(chǎn)物還原成穩(wěn)定的多羥基化合物后酸水解,根據(jù)水解產(chǎn)物的種類,如甘油或赤鮮醇,推斷糖苷鍵的位置;再根據(jù)產(chǎn)物的量并結(jié)合高碘酸反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)一步推測單糖殘基類型。→2)---葡萄糖-(1→的Smith降解反應(yīng)式如圖2所示。

圖2 →2)-α-D-葡萄糖-(1→的Smith降解反應(yīng)Fig. 2 →2)-α-D-Glcp-(1→ Smith degradation reaction

部分酸水解可以將茶多糖大分子裂解成小片段,其作用包含兩個(gè)方面:1)判斷單糖在糖鏈上的位置,對多糖進(jìn)行分級水解時(shí)支鏈上的單糖較骨架上的單糖更易水解;2)幫助判斷糖苷鍵和單糖殘基的類型,1→6糖苷鍵對酸水解相對穩(wěn)定、呋喃型糖殘基較易水解、己糖醛酸糖苷鍵可抵抗酸水解。

甲基化反應(yīng)可用來判斷糖苷鍵的連接位點(diǎn),發(fā)生反應(yīng)時(shí)糖基的游離—OH全部被—CH取代,經(jīng)三氟乙酸水解后產(chǎn)物的—OH所在位置即為單糖殘基的連接點(diǎn),吡啶-乙酸酐衍生得到甲基化糖醇乙酸酯后進(jìn)行GC-MS分析,用于確定糖苷鍵的位置和單糖的物質(zhì)的量比。

H和C二維NMR被用來解析復(fù)雜的茶多糖結(jié)構(gòu)信息,包括通過C、H原子化學(xué)位移來判斷單糖的類型;通過耦合常數(shù)推測茶多糖分子中各原子之間的連接關(guān)系;通過信號強(qiáng)度估計(jì)單糖殘基的重復(fù)數(shù)量;通過對比糖殘基C原子與單糖C原子化學(xué)位移確定糖基相連位置等。

茶多糖的糖鏈結(jié)構(gòu)見表4。可以看出主鏈主要由Gal、Glc、Rha組成,其中Gal最普遍,Ara多在側(cè)鏈上,Man和Fuc常在糖鏈末端,側(cè)鏈通過O-3、O-4、O-6與主鏈連接,Gal既有-型又有-型,Rha往往以-型存在。酸性茶多糖的糖醛酸多位于主鏈;同一種原料制作的紅茶和綠茶多糖糖鏈結(jié)構(gòu)相似;可溶性茶多糖和不溶性茶多糖結(jié)構(gòu)差異很大,水溶性茶多糖以→3)-Gal-(1→和→6)-Gal-(1→為主,側(cè)鏈中存在-Araf分支,這與Wang Huijun等檢測發(fā)現(xiàn)的水溶性茶多糖7WA結(jié)構(gòu)相似;而不溶性茶多糖則以少見的→4)--Xylp-(1→為主。

表4 茶多糖的糖鏈結(jié)構(gòu)Table 4 Sugar chain structures of tea polysaccharides

5 茶中茶多糖的高級結(jié)構(gòu)

茶多糖的微觀形貌特征采用原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy,SEM)和圓二色光譜(circular dichroism,CD)等方法觀察。

AFM主要是觀察茶多糖聚集體的形狀和大小,它利用細(xì)微的探針感知針尖端和樣品表面原子之間的相互作用力,通過原子力的變化反映多糖聚集體表面的起伏變化。茶多糖單鏈的直徑一般為0.1~1.0 nm,而AFM下觀察到的茶多糖直徑要大得多,這是因?yàn)槎嗵欠肿硬⒎菫閱蝹€(gè)糖鏈分子,而是由多個(gè)糖鏈締合而成,羥基和糖醛酸羧基極易本身或與另外一糖鏈形成分子內(nèi)或分子間氫鍵,導(dǎo)致多個(gè)糖鏈纏繞,形成線團(tuán)狀或者箱式結(jié)構(gòu),這也是同一種多糖可測定到不同的分子質(zhì)量的原因。茶多糖聚集體的形狀和大小受提取方法、加工工藝和酸堿度的影響。其分子的平均直徑、長度隨著NaCl洗脫液濃度的增加逐漸減?。粡臄D壓茶中提取的多糖表面呈塊狀,堅(jiān)固且不平整,有較大空腔,而未擠壓樣品的茶多糖表面呈光滑的片狀,說明在擠壓加工中,熱能和機(jī)械能的結(jié)合可以破壞多糖的微觀結(jié)構(gòu),使之形成特定的形狀;不同茶類多糖隨著茶葉發(fā)酵度的增加,茶多糖的長度縮短,綠茶多糖和烏龍茶多糖的形狀呈分枝線狀,而紅茶多糖呈球狀,三者長度分別為620~1 526、430~1 296 nm和430~1 130 nm;烏龍茶葉多糖在溶液中呈直徑0.2~0.5 μm、長0.3~0.6 μm的短棒形不均一的聚集體,在酸性環(huán)境下呈分散的短棒狀,在堿性環(huán)境下形成更大的聚集體,因?yàn)椴瓒嗵堑木奂癄顟B(tài)跟自身的化學(xué)組成有關(guān),羧基的存在使茶多糖含負(fù)離子,而載體云母是一種硅酸鋁,同時(shí)帶負(fù)電荷,長度較短、COO—含量高的茶多糖受云母排斥力影響較大。也有研究表明溫度和離子強(qiáng)度等外界因素對茶多糖構(gòu)象的穩(wěn)定性起著重要作用。

SEM利用電子束與樣品間的相互作用激發(fā)出各種信號,通過這些信號的接受、轉(zhuǎn)化、放大和顯示成像,可在熒光屏上直接微觀成像,用于研究茶多糖分子的外形長度、伸展?fàn)顟B(tài)、柔順性大小以及空間構(gòu)象。SEM下觀察到的茶多糖分子呈顆粒狀,結(jié)構(gòu)松散,隨著糖醛酸和蛋白質(zhì)含量的增加,分子間相互作用位點(diǎn)增多,作用力增大,顆粒間緊密結(jié)合,因各茶多糖分枝情況不同,形成的分子間氫鍵的位置和作用力大小也不同,就呈現(xiàn)出多層次片狀、無規(guī)則團(tuán)狀、串珠狀、螺旋狀等多種立體結(jié)構(gòu)。利用SEM在低倍鏡下還能觀察到烏龍茶多糖的折疊卷曲結(jié)構(gòu),而在高倍鏡下則呈現(xiàn)平整的圖像,這一觀察結(jié)果與綠茶多糖的SEM圖是完全不同的,這是在烏龍茶加工過程的酶促降解作用下,糖鏈和肽鏈變短,分子質(zhì)量減小,分子之間的氫鍵作用增強(qiáng)導(dǎo)致的。

CD利用不對稱分子對左、右偏振光吸收的不同來分析茶多糖分子在水溶液中的絕對構(gòu)型、構(gòu)象等三維結(jié)構(gòu)信息。因?yàn)椴瓒嗵怯绕涫侵行圆瓒嗵侨狈υ谝话阕贤鈪^(qū)的光譜活性,難以直接由CD分析得到結(jié)構(gòu)信息,通常先將茶多糖進(jìn)行分子修飾或與剛果紅(CHNOSNa)反應(yīng)后進(jìn)行CD測定推測茶多糖的構(gòu)象,具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的茶多糖可以與剛果紅形成絡(luò)合物使最大吸收波長移向長波。周鵬等將婺源粗老綠茶多糖與剛果紅反應(yīng)后,剛果紅的最大吸收波長由230 nm移向了490 nm(樣品與剛果紅混合物),說明樣品在溶液中呈現(xiàn)螺旋構(gòu)象;張艷用剛果紅-NaOH鑒定發(fā)現(xiàn)購買的粗茶多糖樣品中不存在三螺旋結(jié)構(gòu);江和源等分析了3 個(gè)茶多糖純化組分的Cotton效應(yīng),并擬合計(jì)算了這3 個(gè)組分所含蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)相對含量,發(fā)現(xiàn)這些糖蛋白質(zhì)存在-折疊、-螺旋和無規(guī)卷曲。

茶多糖的結(jié)晶性較差,不適用于常規(guī)X射線單晶衍射,利用纖維衍射結(jié)合立體化學(xué)信息與計(jì)算機(jī)模擬,可以準(zhǔn)確確定茶多糖構(gòu)型。也有研究者借鑒并運(yùn)用了部分高分子領(lǐng)域分析方法,如激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy,LSCM)、激光光散射-尺寸排阻色譜聯(lián)用法,對不同分子質(zhì)量茶多糖的空間結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行了初步探討。倪德江利用LSCM首次發(fā)現(xiàn)茶多糖聚集體帶有強(qiáng)烈的熒光,產(chǎn)生的原因是否同構(gòu)象相關(guān),尚需進(jìn)一步證實(shí)。

6 結(jié) 語

茶多糖結(jié)構(gòu)特征的研究尚不透徹,一方面是因?yàn)椴瓒嗵墙Y(jié)構(gòu)復(fù)雜,需要結(jié)合多種儀器的分析結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確解析,目前這些貴重儀器普及范圍仍然不廣,部分實(shí)驗(yàn)人員也缺乏相關(guān)儀器的專業(yè)操作訓(xùn)練,這給茶多糖結(jié)構(gòu)的研究帶來了很大的阻力;另一方面,原料和實(shí)驗(yàn)方法不同都會導(dǎo)致研究結(jié)果不同,這就需要研究人員控制單一變量,探明提取純化檢測等方法及茶樹品種、茶樹器官、加工工藝等多種因素對茶多糖結(jié)構(gòu)的影響。此外,對于產(chǎn)生這些影響的更深層原因,即茶多糖合成及降解機(jī)理鮮見詳細(xì)報(bào)道,僅有學(xué)者對糖鏈片段的化學(xué)合成進(jìn)行了一些嘗試,對于茶多糖的生物合成途徑、熱裂解和酶解的機(jī)理需進(jìn)一步深入研究。

茶多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān),現(xiàn)有的茶多糖構(gòu)效關(guān)系的相關(guān)報(bào)道包括4 個(gè)方面:一是茶多糖的分子質(zhì)量是影響其生物活性的一個(gè)重要因素。一些學(xué)者認(rèn)為分子質(zhì)量大的茶多糖由于水溶性較差、表面黏度大,難以通過組織屏障進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,限制了其抗氧化活性。也有一些學(xué)者有相反的看法,認(rèn)為高分子質(zhì)量茶多糖的己醛酸含量較高,金屬螯合能力較低,清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化活性更高;二是茶多糖的生物活性明顯與單糖組成和糖醛酸含量有關(guān)。Scoparo等發(fā)現(xiàn)紅茶和綠茶多糖即使具有相似的糖鏈,但二者的GalA殘基含量差異導(dǎo)致其抗敗血癥的能力不同;Wang Yuefei等發(fā)現(xiàn)烏龍茶多糖的抗氧化性和-葡萄糖苷酶抑制活性明顯與糖醛酸含量成正比;三是結(jié)合無機(jī)元素和蛋白質(zhì)的茶多糖具有更高的生物活性。Chen Haixia等發(fā)現(xiàn)蛋白含量較高的茶多糖組分具有更強(qiáng)的抗氧化活性;Wang Yuanfeng等發(fā)現(xiàn)富含無機(jī)元素Se的紫陽富硒茶多糖可以顯著減少劇烈運(yùn)動引起的氧化應(yīng)激,具有更高的抗氧化活性;四是修飾茶多糖結(jié)構(gòu)可以提高其生物活性,如梁進(jìn)等對茶多糖分別進(jìn)行硫酸化、乙酰化和羧甲基化修飾后,多糖主鏈和支鏈的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,導(dǎo)致活性基團(tuán)暴露,茶多糖的負(fù)電荷以及溶解度增大,從而使其抗凝血活性進(jìn)一步增強(qiáng)。進(jìn)一步深入分析闡明茶多糖的分子結(jié)構(gòu),有助于茶多糖構(gòu)效關(guān)系和生物活性的分子機(jī)制研究,從而為茶多糖作為藥物臨床應(yīng)用或作為天然產(chǎn)品在功能性食品中的應(yīng)用提供新的見解,通過修飾茶多糖結(jié)構(gòu)來拓展其生物功能也正在成為一個(gè)新的研究方向。

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