陳小培，田海芝，任正楠，潘禮龍，孫 嘉,*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是特發(fā)性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩?。–rohn’s disease）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）。近年來，該疾病的發(fā)病率迅速上升，其全球發(fā)病率超過0.3%。除遺傳因素外，環(huán)境因素在IBD的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，大多數(shù)環(huán)境因素主要通過影響腸道菌群從而介導(dǎo)IBD的發(fā)病過程，如西方飲食的長期攝入會(huì)破壞腸道菌群平衡，降低菌群多樣性，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物刺激先天免疫細(xì)胞的激活，引起腸道炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而損傷腸道上皮屏障，導(dǎo)致細(xì)菌易位，并進(jìn)一步刺激炎癥反應(yīng)發(fā)生，加速IBD的發(fā)生發(fā)展。目前IBD的臨床治療藥物主要為氨基水楊酸鹽、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑，然而這些藥物可能會(huì)引起機(jī)會(huì)性感染或不良并發(fā)癥等副作用。腸道菌群對(duì)于IBD發(fā)病至關(guān)重要，臨床患者體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)以大腸桿菌為主的致病性細(xì)菌異常富集。目前，益生菌的使用已成為IBD防治研究的重點(diǎn)方向之一?；谀c道菌群和炎癥反應(yīng)在IBD發(fā)病中的重要作用，亟待開發(fā)既能調(diào)節(jié)腸道菌群，又能抑制炎癥反應(yīng)的治療方案。

抗菌肽又名宿主防御肽，是生物體先天性防御系統(tǒng)中的重要組成成分，存在于大多數(shù)生物體中。新近研究表明，除維持宿主體內(nèi)的腸道菌群穩(wěn)態(tài)功能以外，部分抗菌肽還具有免疫調(diào)節(jié)作用。臨床數(shù)據(jù)已發(fā)現(xiàn)，IBD患者體內(nèi)抗菌肽（如防御素、導(dǎo)管素和c型凝集素）分泌不足可導(dǎo)致腸道內(nèi)生態(tài)失調(diào)和黏膜屏障損傷。-防御素是脊椎動(dòng)物特有的防御素之一，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，人源防御素3（human-defensin 3，hBD3）為防御素家族中抗菌效果最強(qiáng)的抗菌肽，其抑炎作用已在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)中被證實(shí)。

在針對(duì)UC的臨床試驗(yàn)中，可分泌hBD2的益生菌大腸桿菌Nissle1917表現(xiàn)出與藥物美沙拉嗪相當(dāng)?shù)寞熜Ш桶踩浴Ｈ欢?，相比hBD2，抗菌效果更強(qiáng)且具有抗炎能力的hBD3在IBD中的作用及其對(duì)腸道菌群的影響仍有待挖掘。由于抗菌肽對(duì)酸性環(huán)境十分敏感，若直接口服-防御素，胃酸可能會(huì)破壞其抑菌活性。植物乳植桿菌（）是國家衛(wèi)生部《可食用的菌種名單》中列出的益生菌之一，被廣泛應(yīng)用于腸道炎癥的干預(yù)研究，其可黏附在腸道黏膜上并存活數(shù)天，是表達(dá)生物活性物質(zhì)的良好載體。故本實(shí)驗(yàn)選取植物乳植桿菌為載體構(gòu)建重組菌株，通過Usp45分泌信號(hào)驅(qū)動(dòng)hBD3直系同源蛋白鼠源-防御素14（mouse-defensin 14，mBD14）的分泌，實(shí)現(xiàn)mBD14在小鼠結(jié)腸中的靶向遞送。本研究旨在揭示表達(dá)mBD14的重組植物乳植桿菌在葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium，DSS）誘發(fā)的小鼠結(jié)腸炎中的作用及其潛在機(jī)制，評(píng)估益生菌和抗菌肽在UC中的作用，為IBD防治提供新策略。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量為（20±2）g，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008），飼養(yǎng)于江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

植物乳植桿菌來自江南大學(xué)食品微生物學(xué)培養(yǎng)物保藏中心。

DSS、SYBR Green Supermix染料 翌圣生物科技（上海）有限公司；熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，F(xiàn)ITC-Dextran）德國Merck KGaA公司；FastDNA糞便DNA提取試劑盒安倍醫(yī)療器械貿(mào)易（上海）有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）引物 上海生工公司；-actin抗體 武漢愛博泰克生物科技有限公司；Claudin-1抗體、Cleaved-白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-18抗體 英國Abcam公司；Occludin抗體 美國Bimake公司；ZO-2抗體 美國Proteintech公司；凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）抗體、Cleaved-IL-1β抗體 美國Cell Signaling Technology公司；NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）抗體 美國HuaBio公司；Caspase-1 p20抗體 美國Santa Cruz Biotechnology公司；mBD14抗體 美國MyBioSource公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ST40R冷凍離心機(jī)、MULTISKAN GO全波長酶標(biāo)儀美國Thermo Fisher Scientific公司；1150H組織石蠟包埋機(jī)、PM2245手動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī) 德國萊卡公司；Pannoramic MIDI切片電子掃描儀 匈牙利3DHISTECH公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；qPCR儀、ChemiDoc Touch凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 重組菌株的構(gòu)建及鑒定

采用基因工程技術(shù)將含有Usp45分泌信號(hào)肽、連接體Linker和基因序列的融合基因（）克隆到pNZ8148質(zhì)粒中得到重組質(zhì)粒，然后將其電轉(zhuǎn)化到植物乳植桿菌感受態(tài)細(xì)胞中后進(jìn)行培養(yǎng)，得到的陽性克隆體，命名為/pNZ8148-mBD14（/mBD14）。將攜帶空載pNZ8148質(zhì)粒的菌株命名為/pNZ8148（/0）。重組植物乳植桿菌菌株培養(yǎng)于MRS液體培養(yǎng)基中至OD為0.4～0.6獲得重組菌株菌液，對(duì)重組菌株菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并通過PCR檢測進(jìn)行驗(yàn)證。將重組菌株在含有溶菌酶（質(zhì)量濃度1 g/L）的MRS（Man-Rogosa-Sharpe）培養(yǎng)基中培養(yǎng)（30 ℃、1 h），吸取部分菌液在室溫下離心（12 000×、15 min），分離出的上清液為分泌蛋白，菌體沉淀用2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸并超聲破碎，再次離心（12 000×、15 min）獲得的上清液即為菌內(nèi)蛋白。

1.3.2 牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)前對(duì)MRS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌，冷卻到適宜溫度后加入植物乳植桿菌，隨后倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，待其凝固后在培養(yǎng)皿表面垂直擺放牛津杯，輕輕加壓使牛津杯與培養(yǎng)基無空隙接觸，在杯中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.24% MRS培養(yǎng)基、質(zhì)量濃度5 ng/mL氯霉素和/mBD14上清液，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h后，觀察牛津杯周圍有無抑菌圈生成，判斷mBD14是否會(huì)影響植物乳桿菌的生長。

1.3.3 動(dòng)物模型構(gòu)建

全部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由江南大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（JN.141 No2020930b0481108），并遵循國家、國際動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理原則開展。將BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常組（Control）、模型組（DSS）、預(yù)處理組（DSS+）、/0預(yù)處理組（DSS+/0）和/mBD14預(yù)處理組（DSS+/mBD14），每組6～8 只。動(dòng)物干預(yù)實(shí)驗(yàn)為期15 d，在實(shí)驗(yàn)的前7 d，每天通過灌胃分別給予正常組和模型組每只小鼠200 μL PBS，預(yù)處理組每只小鼠200 μL實(shí)驗(yàn)菌懸液（2×10CFU）；第8天，所有小鼠正常飲水；隨后7 d，模型組和預(yù)處理組的小鼠通過自由攝入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% DSS的飲用水誘導(dǎo)結(jié)腸炎。在實(shí)驗(yàn)的第15天，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%異氟烷麻醉小鼠，快速收集血液后頸椎脫臼法處死小鼠，取結(jié)腸組織、血清及腸道內(nèi)容物等樣品保存于-80 ℃冰箱中用于后續(xù)檢測。

1.3.4 炎癥嚴(yán)重程度評(píng)估

通過疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）和結(jié)腸長度綜合評(píng)估小鼠結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度。在DSS誘導(dǎo)期間，每日觀察所有小鼠的身體狀況并以分?jǐn)?shù)形式記錄，主要包括3 個(gè)指標(biāo)：體質(zhì)量減輕率（0：0%；1：1%～5%；2：5%～10%；3：＞10%）、糞便稠度（0：正常；1：軟而結(jié)實(shí)；2：較軟；3：腹瀉）和直腸出血情況（0：正常；1：糞便隱血陽性；2：隱血陽性及可見顆粒性出血；3：肛門周圍出血），3 個(gè)指標(biāo)的總和即DAI評(píng)分。動(dòng)物處理結(jié)束后，收集每只小鼠的結(jié)腸并測量其長度。

1.3.5 組織病理學(xué)檢測

新鮮的結(jié)腸遠(yuǎn)端組織在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中避光固定24～36 h后，經(jīng)過脫水和石蠟包埋獲得包有組織的蠟塊，隨后將其切成厚度為5 μm的組織切片并使用蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，H&E）染色法對(duì)切片進(jìn)行處理。待貼有組織切片的載玻片風(fēng)干后，在顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織病理變化，并使用掃描儀拍攝高分辨率切片圖像。對(duì)于組織學(xué)評(píng)分，本實(shí)驗(yàn)使用的評(píng)分系統(tǒng)如下：隱窩結(jié)構(gòu)破壞程度（0：正常；2：＜50%；4：50%～90%；6：＞90%），黏膜水腫程度（0：正常；2：輕度水腫；4：中度水腫；6：嚴(yán)重水腫），炎癥范圍（0：無炎癥；2：＜10%；4：10%～50%；6：＞50%）。組織學(xué)評(píng)分即為3 項(xiàng)指標(biāo)之和。

1.3.6 qPCR分析

采用TRIzol法提取小鼠結(jié)腸中的總RNA，首先稱取適量的結(jié)腸組織加入1 mL TRIzol，將其置于高通量組織研磨機(jī)中快速破碎，隨后加入三氯甲烷進(jìn)行抽提，離心（12 000×、4 ℃、10 min）后吸取上清液并加入等體積的異丙醇，再次離心得到絮狀白色RNA沉淀，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液（無酶去離子水配制）清洗兩次沉淀，待殘留乙醇揮發(fā)后用無酶去離子水將沉淀溶解。使用EasyQuick RT MasterMix逆轉(zhuǎn)錄試劑將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，-actin為內(nèi)參，F(xiàn)ast SYBR Green Master Mix混合體系，進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)總體系為20 μL，包括SYBR Green Supermix染料（10 μL）、無菌去離子水（7 μL）、正向序列引物（0.5 μL）、反向序列引物（0.5 μL）和cDNA（2 μL）。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)。按照2法計(jì)算目的基因（、、、和）相對(duì)內(nèi)參基因（）的表達(dá)變化。本實(shí)驗(yàn)使用的引物如表1所示。

表1 qPCR使用的特異性引物Table 1 Specific primers used for qPCR

1.3.7 腸道通透性的測定

本實(shí)驗(yàn)使用熒光示蹤劑FITC-Dextran來檢測小鼠的腸道通透性。在準(zhǔn)備解剖小鼠前，對(duì)小鼠進(jìn)行禁食處理，同時(shí)給每只小鼠灌胃500 mg/kg的FITC-Dextran，灌胃4 h后眼球取血法收集血液，將其置于避光處靜置一定時(shí)間后離心得到血清。使用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長492 nm和發(fā)射波長525 nm的條件下測定各個(gè)樣本的吸光度。通過梯度稀釋FITC-Dextran溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算出血清中的FITC-Dextran質(zhì)量濃度。

1.3.8 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

稱取適量的結(jié)腸組織于離心管中，加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液并在低溫條件下進(jìn)行組織破碎，經(jīng)過兩次離心（14 000×、4 ℃、15 min）后得到清澈的蛋白溶液，吸取少量蛋白溶液用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，其余蛋白溶液與上樣緩沖液混合。設(shè)置樣本的蛋白上樣量為30 μg，根據(jù)蛋白質(zhì)量濃度計(jì)算出各個(gè)樣本的上樣體積。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品后，待藍(lán)色指示條帶到達(dá)膠的底部時(shí)停止電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂乳溶液封閉結(jié)束后，分別用ZO-2、Occludin、Claudin-1、NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、Cleaved-IL-18和Cleaved-IL-1β蛋白的抗體4 ℃孵育過夜，然后用對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗體室溫孵育2 h，顯色液孵育數(shù)秒后置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中曝光觀察。采用Image Lab軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以-actin為內(nèi)參蛋白，歸一化處理后確定各個(gè)蛋白的表達(dá)情況。

1.3.9 結(jié)腸內(nèi)容物DNA提取及細(xì)菌定量

在解剖小鼠時(shí)，收集所有小鼠的結(jié)腸內(nèi)容物樣品并保存到-80 ℃冰箱中。取適量樣品，使用糞便DNA提取試劑盒提取小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中的DNA，通過qPCR檢測結(jié)腸內(nèi)容物中嗜黏蛋白阿克曼菌（）、大腸桿菌（）、具核梭桿菌（）和金黃色葡萄球菌（）相對(duì)于總細(xì)菌（16S rDNA）的表達(dá)量。引物序列如表1所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。單因素方差分析和雙因素方差分析用于評(píng)估各組間的顯著性差異，＜0.05被視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均在GraphPad Prism V.8.0.2軟件中進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 mBD14生產(chǎn)菌L. plantarum/mBD14的構(gòu)建及mBD14的表達(dá)

將抗菌肽基因編碼的蛋白序列與信號(hào)肽序列進(jìn)行融合，使抗菌肽以融合蛋白從益生菌中自然分泌，是利用益生菌載體傳遞抗菌肽到腸道環(huán)境的有效策略。本實(shí)驗(yàn)選擇Usp45作為分泌信號(hào)肽，Usp45與外源蛋白序列或肽連接時(shí)可促進(jìn)它們分泌到胞外。融合基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后嵌入pNZ8148質(zhì)粒的I和I位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pNZ8148-mBD14，將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入植物乳植桿菌感受態(tài)細(xì)胞中得到/mBD14（圖1A）。在含有氯霉素（質(zhì)量濃度5 μg/L）的MRS固體培養(yǎng)基上涂布菌液，培養(yǎng)后得到的單菌落即陽性轉(zhuǎn)化子（圖1B）。挑取單個(gè)菌落，經(jīng)培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，通過PCR檢測mBD14基因片段的表達(dá)，可見大小約382 bp的擴(kuò)增條帶，與含融合基因的穿刺菌質(zhì)粒PCR結(jié)果一致（圖1C）。同時(shí)，Western blot和抑菌圈實(shí)驗(yàn)表明/mBD14能夠表達(dá)和分泌mBD14蛋白，且mBD14蛋白不會(huì)影響其載體植物乳植桿菌的生長（圖1D、E）。

圖1 L. plantarum/mBD14的構(gòu)建及mBD14的表達(dá)Fig. 1 Construction of L. plantarum/mBD14 and expression of mBD14

2.2 L. plantarum/mBD14對(duì)小鼠結(jié)腸炎癥狀的緩解作用

在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，典型的表觀指標(biāo)包括腹瀉、便血和體質(zhì)量減輕。用DSS處理小鼠7 d后，觀察到與Control組相比，未進(jìn)行細(xì)菌預(yù)處理的DSS組小鼠體質(zhì)量顯著下降（圖2A），DAI評(píng)分顯著增加（圖2B）。結(jié)腸縮短也是小鼠結(jié)腸炎模型的關(guān)鍵病理事件之一。對(duì)所有小鼠解剖后測量其結(jié)腸長度，發(fā)現(xiàn)DSS組小鼠的結(jié)腸明顯變短，進(jìn)一步證明小鼠結(jié)腸炎模型建立成功。在誘導(dǎo)結(jié)腸炎前，分別給予小鼠、/0和/mBD14進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示，與DSS組相比，/mBD14能夠顯著改善體質(zhì)量的減輕（＜0.05），降低DAI評(píng)分和緩解結(jié)腸縮短，而攝入和/0的小鼠與DSS組小鼠相比，DAI評(píng)分和結(jié)腸長度未表現(xiàn)出明顯差異（圖2B、C）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明/mBD14能夠緩解由DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，而兩種對(duì)照菌株無明顯保護(hù)作用。

圖2 L. plantarum/mBD14對(duì)緩解小鼠急性結(jié)腸炎癥狀的影響Fig. 2 L. plantarum/mBD14 alleviates the symptoms of acute colitis in mice

2.3 L. plantarum/mBD14對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

利用qPCR檢測小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中嗜黏蛋白阿克曼菌、大腸桿菌、具核梭桿菌和金黃色葡萄球菌的相對(duì)豐度，結(jié)果如圖3所示，小鼠經(jīng)過DSS處理后，結(jié)腸內(nèi)致病菌大腸桿菌、具核梭桿菌和金黃色葡萄球菌相對(duì)豐度顯著增加（＜0.001、＜0.05、＜0.01），下一代益生菌嗜黏蛋白阿克曼菌相對(duì)豐度顯著降低（＜0.05），與臨床上IBD患者的變化一致。相比于DSS組，/mBD14預(yù)處理組小鼠結(jié)腸內(nèi)嗜黏蛋白阿克曼菌相對(duì)豐度顯著升高（＜0.05），而大腸桿菌、具核梭桿菌和金黃色葡萄球菌相對(duì)豐度出現(xiàn)顯著下降趨勢（＜0.001、＜0.05、＜0.01），其相對(duì)豐度均接近于Control組，且和/0預(yù)處理能夠顯著抑制大腸桿菌和具核梭桿菌的增加（＜0.001、＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)表明/mBD14能夠顯著抑制DSS誘導(dǎo)的多種致病性細(xì)菌富集，維持小鼠結(jié)腸內(nèi)腸道菌群平衡。

圖3 L. plantarum/mBD14對(duì)調(diào)節(jié)結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群相對(duì)豐度的影響Fig. 3 L. plantarum/mBD14 regulates the gut microbiota in mice with acute colitis

2.4 L. plantarum/mBD14對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸道損傷的保護(hù)作用

通過H&E染色對(duì)小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行組織病理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)DSS組表現(xiàn)出嚴(yán)重的結(jié)腸組織損傷，其隱窩結(jié)構(gòu)明顯消失，結(jié)腸組織周圍水腫，免疫細(xì)胞浸潤，且DSS處理小鼠的組織病理學(xué)評(píng)分均高度顯著高于Control組（＜0.001）。經(jīng)/mBD14預(yù)處理小鼠的結(jié)腸組織切片有明顯改善，可見其結(jié)腸形態(tài)變化和炎癥浸潤減少（圖4A），且組織學(xué)評(píng)分在所有攝入DSS的處理組中最低（圖4B）。此外，有研究表明，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎會(huì)帶來腸道屏障功能的損傷，并出現(xiàn)腸道通透性增加、緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)等現(xiàn)象。通過檢測小鼠血清中FITC-Dextran的質(zhì)量濃度來評(píng)估小鼠的腸道通透性。如圖4C所示，與Control組相比，DSS組小鼠血清中FITC-Dextran質(zhì)量濃度顯著升高（＜0.05），而/mBD14預(yù)處理組與DSS組相比FITC-Dextran質(zhì)量濃度顯著降低（＜0.05），表明/mBD14能夠維持腸道完整性，使FITC-Dextran無法滲透進(jìn)入血液。緊密連接蛋白在維持腸屏障功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過Western blot檢測緊密連接蛋白（ZO-2、Occludin和Claudin-1）的表達(dá)情況來進(jìn)一步驗(yàn)證/mBD14對(duì)腸道屏障功能的保護(hù)作用。如圖4D所示，與DSS組相比，/mBD14能夠顯著提高緊密連接蛋白的表達(dá)量（＜0.05），而其他兩種對(duì)照菌株未表現(xiàn)出明顯的效果。綜上，/mBD14預(yù)處理能夠改善DSS誘導(dǎo)的腸道屏障。

圖4 L. plantarum/mBD14保護(hù)結(jié)腸炎小鼠腸道屏障功能Fig. 4 L. plantarum/mBD14 protects intestinal barrier function in mice with acute colitis

2.5 L. plantarum/mBD14對(duì)結(jié)腸炎小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

DSS直接作用于結(jié)腸上皮，可損傷腸道屏障，導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌及其代謝物擴(kuò)散到黏膜下層組織，從而誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)。利用qPCR檢測小鼠結(jié)腸內(nèi)促炎性細(xì)胞因子、、、和基因表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示，在DSS組小鼠中這些促炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)水平高度顯著升高（＜0.001）。而/mBD14預(yù)處理顯著降低了促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)（＜0.01、＜0.001）。同時(shí)和在和/0預(yù)處理組的表達(dá)量也顯著下調(diào)（＜0.05、＜0.01）。而和的過度表達(dá)在IBD發(fā)病機(jī)制中起重要作用，本實(shí)驗(yàn)已在mRNA水平上檢測到和的顯著變化。有研究表明在IBD患者和小鼠急性結(jié)腸炎中，NLRP3被激活，與接頭分子ASC和Caspase-1形成炎癥小體復(fù)合體，導(dǎo)致Caspase-1的激活，促進(jìn)pro-IL-1β和pro-IL-18裂解形成活性的IL-1β和IL-18。采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)DSS組小鼠結(jié)腸內(nèi)剪切后的IL-18和IL-1β的蛋白表達(dá)量極顯著升高（＜0.01），而/mBD14預(yù)處理使剪切后的IL-18和IL-1β的蛋白表達(dá)極顯著抑制（＜0.01），進(jìn)一步檢測其上游通路NLRP3炎癥小體的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與DSS組小鼠相比，/mBD14顯著抑制了NLRP3及其下游ASC和Caspase-1的蛋白表達(dá)（＜0.01、＜0.05），而或/0均未產(chǎn)生抑制作用（圖5F）。綜上，/mBD14抑制DSS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體及下游炎癥通路的激活，減少IL-1β和IL-18的分泌，進(jìn)而緩解結(jié)腸炎癥。

圖5 L. plantarum/mBD14抑制結(jié)腸炎小鼠的腸道炎癥反應(yīng)Fig. 5 L. plantarum/mBD14 inhibits the intestinal inflammatory responses in mice with acute colitis

3 討 論

IBD患者腸道內(nèi)存在嚴(yán)重菌群失調(diào)，其腸道微生物多樣性明顯低于健康人群。在UC患者中發(fā)現(xiàn)嗜黏蛋白阿克曼菌的豐度降低，可能是由于結(jié)腸黏蛋白的減少。大腸桿菌被認(rèn)為是IBD的潛在病原體，特別是黏附侵襲性大腸桿菌的某些菌株，在IBD患者中顯著升高。此外，從UC患者體內(nèi)分離出一種高侵入性菌株——具核梭桿菌，該菌株的豐度與UC的發(fā)展呈正相關(guān)。金黃色葡萄球菌在IBD患者的腸淋巴濾泡中發(fā)現(xiàn)，可能與患者發(fā)生感染有關(guān)。在本研究所構(gòu)建的小鼠急性結(jié)腸炎模型中，小鼠結(jié)腸內(nèi)嗜黏蛋白阿克曼菌的豐度顯著降低，而大腸桿菌、具核梭桿菌和金黃色葡萄球菌的豐度顯著升高，這些變化均與UC患者體內(nèi)變化一致。Mergaert等的研究表明抗菌肽在維持腸道生態(tài)平衡方面起重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)/mBD14預(yù)處理能夠抑制致病菌大腸桿菌、具核梭桿菌和金黃色葡萄球菌的擴(kuò)散及益生菌嗜黏蛋白阿克曼菌的消耗，表明/mBD14能夠有效緩解結(jié)腸炎發(fā)病過程中腸道菌群紊亂的現(xiàn)象。

腸道屏障的破壞會(huì)加劇腸道細(xì)菌易位，導(dǎo)致腸道黏膜免疫系統(tǒng)識(shí)別細(xì)菌抗原并產(chǎn)生過激的免疫反應(yīng)，是IBD的核心病理特征。腸道屏障功能障礙發(fā)生于IBD的早期階段，主要表現(xiàn)為腸道緊密連接功能和蛋白組成的改變。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中已報(bào)道，hBD3可增強(qiáng)多種緊密連接蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)在小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，/mBD14通過上調(diào)緊密連接蛋白（ZO-2、Occludin和Claudin-1）的表達(dá)抑制DSS誘導(dǎo)的腸道通透性增加，維持屏障功能。同時(shí)，在結(jié)腸炎動(dòng)物模型和IBD患者中，活化的免疫細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎性細(xì)胞因子，包括IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17A和IL-18等，造成腸道炎癥損傷。IL-1家族細(xì)胞因子IL-1β和IL-18由單核巨噬細(xì)胞（mononuclear macrophages，MNPs）和腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IECs）產(chǎn)生，在腸道炎癥中具有促炎效應(yīng)；IL-1β通過誘導(dǎo)可分泌IL-17A的先天淋巴樣細(xì)胞（innate lymphoid cells，ILCs）和輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）細(xì)胞激活來促進(jìn)腸道炎癥；IL-18在結(jié)腸炎中通過調(diào)控杯狀細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄程序來抑制杯狀細(xì)胞成熟，導(dǎo)致腸道黏膜屏障的破壞。IL-6由腸道中的多種免疫細(xì)胞（如MNPs、IECs和Th2細(xì)胞等）產(chǎn)生，可通過激活I(lǐng)L-6信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT3）通路來增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和防止T細(xì)胞凋亡。由MNPs產(chǎn)生的IL-12可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的分化，促進(jìn)干擾素（interferon，IFN）-γ的分泌。在本實(shí)驗(yàn)的結(jié)腸炎模型中，結(jié)腸內(nèi)、、、和的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高。細(xì)菌預(yù)處理組中/mBD14能夠顯著抑制結(jié)腸內(nèi)這些促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，和/0對(duì)和也具有顯著抑制作用，可能是由于植物乳植桿菌作為益生菌在小鼠急性結(jié)腸炎中產(chǎn)生有益作用。

NLRP3炎癥小體的形成對(duì)IL-1家族細(xì)胞因子的產(chǎn)生至關(guān)重要。由微生物誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活已在IBD患者和小鼠急性結(jié)腸炎中被證實(shí)。免疫細(xì)胞中的NLRP3可感知各種微生物及其代謝物產(chǎn)物。在UC患者中，共生體免疫球蛋白G作用于表達(dá)腸道駐留受體FcγR的MNPs，誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活和IL-1β的產(chǎn)生。在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中，奇異變形桿菌的細(xì)菌毒素溶血素刺激單核細(xì)胞內(nèi)NLRP3，誘導(dǎo)IL-1β的釋放。此外，大腸桿菌在IBD患者腸道中富集并通過激活NLRP3炎癥小體來促進(jìn)IL-1β的產(chǎn)生。這些研究表明腸道細(xì)菌可調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的活性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)/mBD14預(yù)處理可顯著抑制NLRP3炎癥小體及其下游炎癥通路的激活，這可能與/mBD14可降低致病菌（如大腸桿菌）在結(jié)腸中異常富集有關(guān)。

工程益生菌的應(yīng)用可實(shí)現(xiàn)抗菌肽在腸道中的靶向遞送，其中乳酸菌已成功用作細(xì)菌載體，利用重組技術(shù)表達(dá)抗菌肽（如表達(dá)鼠源導(dǎo)管素相關(guān)抗菌肽的乳酸乳球菌NZ9000）可預(yù)防小鼠自身免疫性糖尿病和結(jié)腸炎的發(fā)展，本實(shí)驗(yàn)中表達(dá)mBD14的植物乳植桿菌可緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，表明工程益生菌在改善人類健康方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了具有Usp45分泌序列的重組菌株，即表達(dá)mBD14的植物乳植桿菌/mBD14，實(shí)現(xiàn)了mBD14在腸道中的靶向遞送。用/mBD14對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠進(jìn)行預(yù)處理，可明顯緩解結(jié)腸炎癥狀。同時(shí)，/mBD14能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，維持腸道屏障完整性，減少促炎性因子的表達(dá)，抑制NLRP3炎癥小體及下游炎癥通路的激活，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。這一策略可促進(jìn)益生菌和抗菌肽對(duì)于IBD的臨床應(yīng)用。