馬高興，王 晗，楊文建，蘇安祥，裴 斐，馬 寧，胡秋輝

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023）

食用菌多糖是近年來研究較多的一種活性高分子，在治療代謝綜合征和作為營養(yǎng)膳食補(bǔ)充劑方面療效好且應(yīng)用前景廣闊。杏鮑菇是我國廣泛栽培的一種食用真菌，具有多種活性物質(zhì)（如多糖、多酚、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素），營養(yǎng)價(jià)值豐富。杏鮑菇多糖的營養(yǎng)活性已得到廣泛研究，主要包括降壓、抗菌、抗炎、抗病毒、抗糖尿病、降血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等活性。然而，目前對不同提取方法獲得的多糖結(jié)構(gòu)和免疫活性進(jìn)行比較并闡明其構(gòu)效關(guān)系的研究較少。

研究表明，不同提取工藝對多糖的結(jié)構(gòu)特征和營養(yǎng)活性有顯著影響。目前，應(yīng)用于不同來源天然多糖提取的工藝很多。由于蘑菇中的多糖大部分屬于水溶性多糖，因此熱水提取法被廣泛應(yīng)用。超聲波輔助提取技術(shù)由于具有提取效率高、耗時(shí)短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。微波具有很強(qiáng)的穿透力，可以破壞真菌的細(xì)胞壁，從而能更有效地提取真菌中的有效成分，因此微波提取法也得到了廣泛的應(yīng)用。真菌的細(xì)胞壁可以被酶水解，此外，酶輔助提取具有條件溫和、多糖得率高、能耗低的特點(diǎn)，有利于維持多糖生物活性。但酶的價(jià)格較高，因此酶輔助提取的應(yīng)用受到了限制。近年來，亞臨界液體萃取技術(shù)和脈沖電場輔助萃取技術(shù)等創(chuàng)新技術(shù)也被應(yīng)用于從不同植物和動(dòng)物中提取多糖組分，但由于成本和能耗的限制，這些技術(shù)還沒有得到廣泛應(yīng)用。

由于不同提取純化工藝分離的多糖結(jié)構(gòu)特征不同，其生物活性也存在一定差異。綜合考慮提取成本、提取率等因素，本研究采用熱水法、超聲波法和超聲波輔助熱水法提取杏鮑菇多糖。測定總糖、蛋白、糖醛酸和硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)等理化指標(biāo)。采用高效液相色譜法、傅里葉變換紅外光譜法和紫外光譜法分別對杏鮑菇多糖的單糖組成、分子質(zhì)量、特征官能團(tuán)進(jìn)行分析。最后，探究杏鮑菇多糖對RAW264.7細(xì)胞的增殖作用和吞噬作用。本研究旨在比較不同提取方法得到的杏鮑菇多糖結(jié)構(gòu)和活性差異，初步闡釋杏鮑菇多糖的結(jié)構(gòu)特征與活性之間的相關(guān)性，為制備具有特定營養(yǎng)活性的杏鮑菇多糖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇粉 南京華潤蘇果市場。

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品和T系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（T-500、T-70、T-40和T-10） 瑞典烏普薩拉公司；三氯甲烷、正丁醇、95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇 上海源葉生物科技有限公司；杜氏改良Eagle（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、pH 7.3、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國賽默飛世爾科技公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)盒-8（cell counting kit-8，CCK-8） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；UV-9000紫外-可見分光光度計(jì) 上海Metash公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；Allegra-64R型冷凍離心機(jī)美國貝克曼公司；KQ-500E型數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；Tensor27傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；8000系列CO細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲提取杏鮑菇多糖

杏鮑菇粉先用85%乙醇溶液浸泡12 h，去除色素、小分子脂類等物質(zhì)。離心（4 000 r/min、20 min）除去乙醇，以固液比1∶36（/）向沉淀物中加入蒸餾水。然后在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)所得最佳工藝條件（464 W、38 ℃、30 min、80 kHz）下進(jìn)行超聲處理。4 000 r/min、15 min離心后收集上清液。上清液60 ℃蒸發(fā)濃縮至原來體積的一半。然后用3 倍體積的95%乙醇溶液沉淀12 h。離心（8 000 r/min、20 min） 后用10 倍體積的蒸餾水重新溶解沉淀，并將提取液與Sevag試劑按照體積比5∶1混合除去蛋白。離心（10 000 r/min、15 min）后取上層懸浮液。將懸浮液加入透析袋（截留分子質(zhì)量8 000～14 000 Da，后同），置于10 倍懸浮液體積的蒸餾水中透析24 h除去Sevag試劑，然后60 ℃蒸發(fā)濃縮，收集濃縮后的溶液并凍干，所得多糖粉末命名為U。計(jì)算多糖提取率（凍干多糖粉末質(zhì)量與杏鮑菇粉末質(zhì)量的比值×100%，后同）。

1.3.2 熱水浸提杏鮑菇多糖

杏鮑菇粉先用85%乙醇溶液浸泡12 h。離心（4 000 r/min、20 min）除去乙醇，以固液比1∶20加入蒸餾水，在60 ℃下水浴加熱2 h。隨后，將混合物離心（4 000 r/min、15 min），收集上清液。上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)并濃縮到原體積的一半。然后用3 倍體積95%乙醇溶液醇沉12 h，離心（8 000 r/min、20 min）后得到沉淀。最后用10 倍體積的蒸餾水重新溶解沉淀，并將提取液與Sevag試劑按照體積比5∶1混合除去蛋白。離心（10 000 r/min、15 min）后取上層懸浮液。將懸浮液倒入透析袋，置于10 倍懸浮液體積的蒸餾水中透析24 h除去Sevag試劑，然后60 ℃蒸發(fā)濃縮，收集濃縮后的溶液并凍干，所得多糖粉末命名為H，計(jì)算多糖提取率。

1.3.3 超聲輔助熱水提取杏鮑菇多糖

杏鮑菇粉用85%乙醇溶液浸泡12 h。離心（4 000 r/min、20 min）除去乙醇，以固液比1∶36（/）向沉淀物中加入蒸餾水。然后在最佳工藝條件（464 W、38 ℃、30 min、80 kHz）下進(jìn)行超聲處理。然后60 ℃水浴加熱2 h。隨后，將混合物離心（4 000 r/min、15 min）并取上清液60 ℃蒸發(fā)濃縮至原來體積的一半。然后用3 倍體積95%乙醇溶液醇沉12 h。離心（8 000 r/min、20 min）后用10 倍體積的蒸餾水重新溶解沉淀，并將提取液與Sevag試劑按照體積比5∶1混合除去蛋白。離心（10 000 r/min、15 min）后取上層懸浮液。將懸浮液倒入透析袋，置于10 倍懸浮液體積的蒸餾水中透析24 h除去Sevag試劑，然后60 ℃蒸發(fā)濃縮收集濃縮后的溶液并凍干，所得多糖粉末命名為U+H，計(jì)算多糖提取率。

1.3.4 總糖、蛋白、糖醛酸和硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

分別采用苯酚硫酸法和考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定杏鮑菇不同多糖組分的總糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

參考文獻(xiàn)[11]的方法測定糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在棕色瓶中配制質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL咔唑-乙醇溶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。配?.54 mg/mL四硼酸鈉硫酸溶液，室溫保存?zhèn)溆?。? 支試管，分別加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度（0、10、20、30、40、50、60、70 μg/mL）的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別加入5 mL 9.54 mg/mL四硼酸鈉硫酸溶液，充分混勻后沸水浴10 min，待各管室溫下冷卻后再向其中加入0.2 mL 1.25 mg/mL咔唑乙醇溶液，混勻后沸水浴15 min，冷卻后測定530 nm波長處吸光度。以葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1.0 mL適當(dāng)質(zhì)量濃度（約0.2 mg/mL）的多糖樣品溶液，參考上述方法測定530 nm波長處的吸光度并代入葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖樣品溶液中糖醛酸質(zhì)量濃度，按照式（1）計(jì)算糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中：為多糖樣品溶液中糖醛酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為所取多糖樣品溶液中多糖的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

采用氯化鋇-明膠法測定硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)。稱取1.0 g明膠，加入200 mL 60～70 ℃去離子水，待冷卻后置于4 ℃冰箱靜置12 h，得5 g/L明膠溶液。稱取0.5 g氯化鋇溶于100 mL 5 g/L明膠溶液中，得到5 g/L氯化鋇-明膠溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。配制不同質(zhì)量濃度（0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL）硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1.0 mL加入6 支試管中，依次向各管加入0.7 mL 8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸溶液、0.5 mL 5 g/L氯化鋇明膠溶液，混勻后靜置15～20 min，測定360 nm波長處吸光度。以硫酸鉀質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取各多糖樣品約10 mg，加至1 mL的1 mol/L鹽酸溶液中，100 ℃水解6 h，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，向殘?jiān)尤? mL去離子水使之完全溶解。取0.2 mL水解液于試管中，添加去離子水定容至1.0 mL，再依次加入0.7 mL 8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸溶液、0.5 mL 5 g/L氯化鋇-明膠溶液，混勻后靜置15～20 min，測定360 nm波長處的吸光度。另取0.2 mL水解液，添加去離子水至溶液體積為1.0 mL，再依次加入0.7 mL 8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸溶液、0.5 mL 5 g/L明膠溶液，測定360 nm波長處的吸光度。將兩次反應(yīng)體系的吸光度之差代入硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可得多糖樣品硫酸鉀的質(zhì)量濃度，最后按式（2）計(jì)算多糖樣品中硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)（以硫酸鉀計(jì)）。

式中：為多糖樣品中硫酸鉀質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為所取多糖樣品溶液的體積/mL；為所取多糖的質(zhì)量/mg。

1.3.5 紫外光譜分析

配制0.5 mg/mL多糖溶液，采用UV-9000紫外-可見分光光度計(jì)在200～400 nm范圍內(nèi)掃描。分析260 nm和280 nm波長處是否有吸收峰，確定樣品中是否含有核酸和蛋白質(zhì)。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

多糖樣品采用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～500 cm掃描32 次，分辨率為2 cm。

1.3.7 單糖組成分析

單糖組成的測定參考文獻(xiàn)[13-14]的方法并稍作修改。用去離子水制備不同單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.5 mg/mL）。分別取100 μL不同單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液加入試管中，加入100 μL 0.3 mol/L NaOH溶液和100 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液，在70 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)反應(yīng)2 h。冷卻后，加入100 μL HCl（0.3 mol/L）溶液中和，加入1 mL去離子水。加入1.5 mL氯仿萃取5 min，離心（4 000 r/min、15 min）后棄去氯仿層，按上述步驟重復(fù)萃取3 次。處理后的單糖溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。

將5 mg的凍干多糖樣品溶于5 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液中，在密封玻璃管中110 ℃水解2 h。水解后蒸發(fā)濃縮干燥，加入5 mL甲醇洗滌5 次，去除多余的三氟乙酸，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑后，加入1 mL去離子水，得到水解樣品溶液。將100 μL的溶液轉(zhuǎn)移到密封玻璃試管中，按照單糖標(biāo)準(zhǔn)品1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化的方法進(jìn)行多糖樣品衍生化，用0.45 μm微孔膜過濾后，采用1260高效液相色譜儀（配備C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和紫外檢測器）進(jìn)行分析。流動(dòng)相為磷酸鹽-乙腈（體積比83∶17）；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.8 杏鮑菇多糖分子質(zhì)量測定

參考文獻(xiàn)[15]采用高效液相色譜法對杏鮑菇多糖的分子質(zhì)量進(jìn)行了分析。用去離子水配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL的不同分子質(zhì)量（12.6、49.6、70.8、126、498 kDa）的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以及3 種多糖溶液（2 mg/mL）。色譜柱：TSK-GEL G4000 SWXL（7.8 mm×300 mm）；蒸發(fā)光檢測器；柱溫25 ℃；流動(dòng)相：去離子水；流速0.6 mL/min；以各標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子質(zhì)量的對數(shù)（lg）為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制分子質(zhì)量擬合葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以不同色譜峰的峰面積百分比表征其分子質(zhì)量分布比例。

1.3.9 杏鮑菇多糖的免疫調(diào)節(jié)活性測定

1.3.9.1 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出小鼠巨噬細(xì)胞凍存管在37 ℃水浴15 min，加入1 mL完全培養(yǎng)基（含89%（體積分?jǐn)?shù)）DMEM高糖培養(yǎng)基、10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清和1%（體積分?jǐn)?shù)）青霉素-鏈霉素，下同），然后將凍存管中培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至無菌離心管，1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，加入2 mL完全培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去完全培養(yǎng)基，加4 mL PBS洗去未貼壁細(xì)胞后棄去PBS，加入2 mL完全培養(yǎng)基后輕柔地將貼壁細(xì)胞吹打下來，800 r/min離心3 min后棄去完全培養(yǎng)基，加入4 mL完全培養(yǎng)液將細(xì)胞輕柔吹散，移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞處于對數(shù)生長期，然后以1.5×10個(gè)/T25瓶的接種量進(jìn)行傳代，約活化2 次后取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.9.2 3 種杏鮑菇多糖的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

用DMEM高糖培養(yǎng)基配制不同質(zhì)量濃度（0、5、10、25、50、100、200 μg/mL）的3 種多糖溶液，用0.22 μm微孔膜過濾后得到不同質(zhì)量濃度的多糖培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，將T25瓶中的培養(yǎng)液棄去，加入4 mL PBS洗去未貼壁細(xì)胞后棄去PBS，加入2 mL新鮮完全培養(yǎng)基將貼壁巨噬細(xì)胞輕柔吹散，將巨噬細(xì)胞懸液接種于96 孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液（約2×10個(gè)/mL），37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后移去培養(yǎng)液。組每孔加入200 μL不同質(zhì)量濃度多糖培養(yǎng)基；組每孔加入200 μL DMEM高糖培養(yǎng)基；組每孔不含細(xì)胞，僅加入200 μL DMEM高糖培養(yǎng)基；每組設(shè)置8 個(gè)平行。在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后移去培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后測定450 nm波長處吸光度，按照式（3）計(jì)算細(xì)胞增殖率。

式中：為不添加多糖樣品的組吸光度；為只含有培養(yǎng)基的組吸光度；為添加樣品的組吸光度。

1.3.9.3 3 種杏鮑菇多糖的吞噬能力測定

將巨噬細(xì)胞密度調(diào)整為5×10個(gè)/mL，以100 μL/孔接種于96 孔板上，在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后移去培養(yǎng)基，參照1.3.9.2節(jié)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分組。每孔加入200 μL不同質(zhì)量濃度多糖培養(yǎng)基或DMEM高糖培養(yǎng)基，每組濃度設(shè)置8 個(gè)平行，培養(yǎng)24 h后，每孔加入中性紅染色液20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。去除含有中性紅染色液的細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌3 次。加入200 μL細(xì)胞裂解液，室溫下?lián)u床裂解10 min，測定樣品540 nm波長處吸光度。按照公式（4）計(jì)算每孔的細(xì)胞吞噬率，以細(xì)胞吞噬率表征巨噬細(xì)胞吞噬能力。

式中：為不加樣品的組吸光度；為只含有培養(yǎng)基的組吸光度；為添加樣品的組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 26.0軟件處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。采用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種杏鮑菇多糖基本理化指標(biāo)分析結(jié)果

如表1所示，3 種杏鮑菇多糖的提取率分別為3.13%、3.65%和4.57%。結(jié)果表明，3 種提取方法提取率無顯著性差異。在提取率無顯著差異的情況下，與熱水提取法相比，超聲波提取時(shí)間短、提取溫度低，這是因?yàn)槌暡芷茐恼婢?xì)胞壁，促進(jìn)多糖的溶解。U+H的蛋白和總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.44%和46.79%，高于U和H。超聲波具有機(jī)械作用，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶解，超聲處理后再用熱水提取，進(jìn)一步促進(jìn)了杏鮑菇中多糖和蛋白質(zhì)的溶解。3 種多糖中均存在糖醛酸，表明多糖中存在酸性多糖。此外，U、H和U+H的硫酸基含量無明顯差異。

表1 3 種杏鮑菇多糖的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical properties of three polysaccharides from P. eryngii

2.2 3 種杏鮑菇多糖紫外光譜分析結(jié)果

核酸和蛋白質(zhì)分別在260 nm和280 nm波長處有特征吸收峰。U、H和U+H的紫外吸收光譜如圖1所示。3 種多糖在280 nm波長處有吸收峰，表明多糖中存在蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析結(jié)果相印證。

圖1 3 種杏鮑菇多糖紫外光譜圖Fig. 1 UV spectra of three polysaccharides from P. eryngii

2.3 3 種杏鮑菇多糖傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

傅里葉變換紅外光譜可以顯示多糖各基團(tuán)的特征吸收峰。U、H和U+H的紅外光譜范圍為4 000～500 cm，如圖2所示。所得峰均為多糖的典型吸收峰。多糖的紅外光譜在3 400 cm附近有1 個(gè)寬而強(qiáng)的峰，表明多糖中存在羥基。在3 500 cm附近較寬的吸收峰為羥基的O—H伸縮振動(dòng)所引起，因此，紅外光譜在該區(qū)域存在吸收說明U、H和U+H含有羥基，表明這些物質(zhì)是多糖。2 930 cm和2 360 cm附近的特征峰是由C-H伸縮振動(dòng)引起的。在1 650 cm處的強(qiáng)吸收對應(yīng)羰基的伸縮振動(dòng)。然而，1 405 cm處寬而強(qiáng)的吸收峰可以歸因于蛋白質(zhì)—CH和—CH的對稱變形。1 260 cm處的吸收峰可能由C—O—C拉伸振動(dòng)所引起。此外，在1 150 cm和950 cm之間的吸收峰可歸因于磷酸鹽的拉伸振動(dòng)。3 種多糖在1 100～1 010 cm處有強(qiáng)吸收峰，表明存在吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)。

圖2 3 種杏鮑菇多糖傅里葉變換紅外光譜Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of three polysaccharides of P. eryngii prepared by different methods

2.4 3 種杏鮑菇多糖單糖組成分析結(jié)果

3 種杏鮑菇多糖樣品單糖組成如圖3所示。當(dāng)保留時(shí)間為29 min時(shí)，3 種多糖均有較大的吸收峰，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，證實(shí)該物質(zhì)為葡萄糖，說明U、H和U+H主要由葡萄糖組成。保留時(shí)間為13 min時(shí)的吸收峰為甘露糖，保留時(shí)間為34.18 min時(shí)的吸收峰為半乳糖，保留時(shí)間為37.80 min時(shí)的吸收峰為木糖，保留時(shí)間為42.16 min時(shí)的吸收峰為巖藻糖。根據(jù)單糖組成分析，3 種多糖均由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和巖藻糖組成，但物質(zhì)的量比不同。如圖3所示，U中甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和巖藻糖的物質(zhì)的量比為8.60∶80.90∶7.41∶2.68∶0.57。而另外兩種多糖H和U+H的甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和巖藻糖物質(zhì)的量比分別為9.36∶79.72∶8.18∶2.60∶0.42和6.75∶82.66∶7.14∶2.30∶1.12。其差異可能與提取方法不同有關(guān)。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）和3 種杏鮑菇多糖樣品（B）單糖組成高效液相色譜圖Fig. 3 High performance liquid chromatogram of mixed monosaccharde standard (A) and monosaccharide composition of three polysaccharides (B)from P. eryngii prepared by different extraction methods

2.5 3 種杏鮑菇多糖的分子質(zhì)量分析結(jié)果

利用高效液相色譜儀測定U、H和U+H的分子質(zhì)量分布，結(jié)果如圖4所示。U、H和U+H的洗脫峰均為多重峰，但都不是單一的對稱峰，說明3 種多糖都不是均勻多糖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量擬合葡聚糖的線性回歸方程為lg＝-3.392 5+29.413（＝0.993 3）。U在5.26、10.90 min和13.21 min處出現(xiàn)色譜峰，分子質(zhì)量分別為13 152、281、53 kDa，分子質(zhì)量分布比例分別為83.61%、3.02%、13.37%。H在5.62、10.89 min和13.16 min處出現(xiàn)色譜峰，分子質(zhì)量分別為10 232、281、61 kDa，分子質(zhì)量分布比例分別為93.15%、1.94%、4.90%。U+H在5.59 min和13.17 min處出現(xiàn)色譜峰，分子質(zhì)量分別為10 471 kDa和60 kDa，分子質(zhì)量分布比例分別為98.59%、1.40%。

圖4 3 種杏鮑菇多糖高效液相色譜圖Fig. 4 High performance liquid chromatograms of three polysaccharides from P. eryngii prepared by different extraction methods

2.6 3 種杏鮑菇多糖對RAW264.7細(xì)胞的增殖作用

采用CCK-8試劑盒測定3 種杏鮑菇多糖干預(yù)后巨噬細(xì)胞的增殖率以分析杏鮑菇多糖的毒性作用。由圖5可知，U在低質(zhì)量濃度（5、10 μg/mL）條件下對巨噬細(xì)胞有毒性作用，可能因?yàn)樵诔曌饔孟?，不斷有較大分子質(zhì)量的多糖被提取出來，而隨著超聲時(shí)間的延長，部分大分子質(zhì)量多糖會(huì)被降解為小分子質(zhì)量多糖。不同分子質(zhì)量多糖對巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出不同的受體親和力，而大分子質(zhì)量多糖通常表現(xiàn)出較強(qiáng)的刺激活性。U在50～200 μg/mL范圍內(nèi)對巨噬細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。H在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對巨噬細(xì)胞均無毒性作用，H在高質(zhì)量濃度（50～200 μg/mL）范圍內(nèi)對巨噬細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)效果（＜0.05）。U+H在測試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，且在0～25 μg/mL范圍內(nèi)呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，在25 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值，在50～200 μg/mL范圍內(nèi)有增殖效果但不呈濃度依賴性。本研究中3 種多糖對RAW264.7細(xì)胞的影響均表明U、H和U+H可以激活免疫細(xì)胞。

圖5 3 種杏鮑菇多糖對巨噬細(xì)胞增殖作用影響Fig. 5 Effects of three polysaccharides from P. eryngii prepared by different extraction methods on the proliferation of macrophages

2.7 3 種杏鮑菇多糖對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響

吞噬作用可作為巨噬細(xì)胞活化的指標(biāo)。巨噬細(xì)胞被激活后會(huì)增強(qiáng)增殖、吞噬作用，促進(jìn)一氧化氮和細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及細(xì)胞形態(tài)的改變，并抑制多種腫瘤細(xì)胞和微生物的生長。用中性紅試劑盒測定3 種多糖對巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響。由圖6可知，與培養(yǎng)基中未添加多糖的巨噬細(xì)胞相比，3 種多糖對巨噬細(xì)胞吞噬能力均有顯著的促進(jìn)效果（＜0.05）。U在25、200 μg/mL條件下吞噬率分別為173.87%、193.45%，吞噬效果最佳。H在低質(zhì)量濃度（5～50 μg/mL）條件下吞噬率最大為127.27%，在高質(zhì)量濃度（100、200 μg/mL）下吞噬率分別為151.34%、163.64%。即H在低質(zhì)量濃度條件下對吞噬率的影響顯著低于高質(zhì)量濃度（＜0.05）。U+H在低質(zhì)量濃度（5～25 μg/mL）下吞噬效果最佳，最高可達(dá)到187.62%，在50、100、200 μg/mL條件下，吞噬效果顯著下降（＜0.05）。相同質(zhì)量濃度的3 種杏鮑菇多糖對巨噬細(xì)胞吞噬率的影響有明顯差異，推測吞噬率的差異與多糖的結(jié)構(gòu)差異相關(guān)。

圖6 3 種杏鮑菇多糖對巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響Fig. 6 Effects of three polysaccharides of P. eryngii prepared by different extraction methods on phagocytosis of macrophages

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用不同方法制備杏鮑菇多糖，并對多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步表征，最后通過杏鮑菇多糖對增殖和吞噬作用的影響評價(jià)了杏鮑菇多糖的免疫活性。研究表明，不同提取工藝對多糖的結(jié)構(gòu)特征和營養(yǎng)活性有顯著影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3 種方法提取的多糖理化特性無明顯差異，但單糖組成的物質(zhì)的量比和分子質(zhì)量有明顯差異。在超聲作用下，杏鮑菇中大分子質(zhì)量多糖會(huì)被提取出來，隨著超聲時(shí)間的延長，部分大分子質(zhì)量多糖會(huì)被降解為小分子質(zhì)量多糖，所以超聲提取多糖與水煮提取、超聲輔助水煮提取多糖分子質(zhì)量與分布比例有明顯差異。而不同分子質(zhì)量的多糖對巨噬細(xì)胞的刺激活性也有差異，大分子質(zhì)量多糖通常表現(xiàn)出較強(qiáng)的刺激活性，所以超聲提取多糖在低質(zhì)量濃度下會(huì)表現(xiàn)出輕微毒性，水煮提取多糖和超聲輔助水煮提取多糖在所有實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對RAW264.7細(xì)胞無毒性作用，并能激活細(xì)胞吞噬活性。綜上，3 種杏鮑菇多糖均具有一定的免疫活性，可以激活巨噬細(xì)胞并增強(qiáng)其吞噬活性，但作用效果差異明顯。免疫活性的差異可能與多糖的單糖組成和分子質(zhì)量有關(guān)。未來關(guān)于3 種杏鮑菇多糖增強(qiáng)免疫活性的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。