邱澤慧，鄭 堯，王錫昌,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海 201306）

我國河鲀魚資源豐富，消費市場廣闊，其中，暗紋東方鲀（）是我國養(yǎng)殖量最多的河鲀魚之一，其營養(yǎng)價值高、風味獨特。但受河豚毒素的安全性制約，養(yǎng)殖暗紋東方鲀只能以加工品的形式進行流通，其中，冷凍品是最主要的加工流通形式。解凍是水產(chǎn)冷凍品在加工消費前必不可少的處理環(huán)節(jié)，并且會顯著影響產(chǎn)品的持水性、質構等食用品質，目前，已有許多學者對養(yǎng)殖暗紋東方鲀在凍藏期間發(fā)生的品質變化進行了研究，但鮮見有關解凍方式對養(yǎng)殖暗紋東方鲀品質影響的報道。

解凍方式包括流水解凍、靜水解凍、室溫解凍和冷藏解凍等傳統(tǒng)解凍方式以及微波解凍、射頻解凍、超聲輔助解凍等新型解凍方式。已有許多學者研究了不同解凍方式對水產(chǎn)品品質的影響，如王雪松研究了5 種不同解凍方式對冷凍竹莢魚品質的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波流水解凍能夠較好地保持魚肉的品質；姜晴晴等認為低溫解凍方式對帶魚的破壞性最小，能較好地維持其肌肉品質；余文暉等發(fā)現(xiàn)靜水解凍能夠較好地維持金槍魚的品質。其中，持水性與質構特性作為最重要的兩個品質，直接影響了消費者對于水產(chǎn)品的接受程度，一般來說，消費者更愿意接受汁液損失少、肉質緊實的水產(chǎn)品。在解凍過程中，持水性與質構特性如硬度、咀嚼性、彈性等會發(fā)生不同程度的改變，并且相互影響，從而影響水產(chǎn)品的口感，且蛋白質變性也會改變產(chǎn)品的持水性與質構特性?，F(xiàn)階段，鮮有以養(yǎng)殖暗紋東方鲀?yōu)樵线M行不同方式解凍的研究，且不同的解凍方式對凍品產(chǎn)生影響的研究結果也不盡相同。因此，有必要探究解凍方式對暗紋東方鲀持水性及質構特性的影響，為凍品暗紋東方鲀選取最佳的解凍方法提供理論依據(jù)。

本實驗選取冷藏解凍、室溫解凍、流水解凍和超聲波輔助解凍4 種方法對冷凍養(yǎng)殖暗紋東方鲀進行解凍處理，研究不同解凍方式對河鲀魚持水性及質構特性的影響，并嘗試探尋其內在機理，旨在為冷凍水產(chǎn)品在解凍過程中的品質控制提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍品養(yǎng)殖暗紋東方鲀（質量為（278.1±22.2）g，體長為（25.1±1.1）cm）于2021年3月購自中國江蘇南通中洋集團，經(jīng)加工廠取內臟、去皮、液氮冷凍，置于泡沫箱中在低溫狀態(tài)下于24 h內運輸至實驗室。實驗時，僅使用河鲀魚的背部肌肉（白色肌肉部分），并置于-18 ℃的條件下凍藏備用。

5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、溴酚藍指示劑上海阿拉丁有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）試劑、考馬斯亮藍R-250美國Sigma公司；蛋白標準品、牛血清白蛋白標準品北京索萊寶公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Ultra-Turrax分散機/勻漿機 德國IKA集團；UV-1800PC紫外-可見分光光度計 上海美譜達公司；H1850R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀公司；RX6000C無紙記錄儀 杭州美控自動化技術有限公司；AE-6500垂直電泳槽 日本Atto公司；TA.XT Plus型質構儀 英國Stable Micro Systems公司；F-7100熒光分光光度計 日本日立高新技術公司。

1.3 方法

1.3.1 解凍處理與解凍曲線的測定

隨機取出4 組冷凍河鲀魚塊，分別按照表1所示方法進行解凍，解凍過程中將熱電偶的探頭插入河鲀魚背部肌肉中心位置，實時記錄河鲀魚塊中心溫度，以4 ℃作為解凍終點，從-18 ℃升高到4 ℃所需要的時間即為河鲀魚塊的解凍時間。

表1 暗紋東方鲀的4 種解凍方法Table 1 Operating conditions of four thawing methods for frozen Takifugu obscurus

1.3.2 解凍損失率的測定

對1.3.1節(jié)各方式解凍魚塊進行解凍損失率計算，如式（1）所示。

式中：為解凍前河鲀魚塊質量/g；為解凍后河鲀魚塊質量/g。

1.3.3 質地剖面分析

將河鲀魚背部肌肉切塊（1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm）。質地剖面分析（texture profile analysis，TPA）測試參考姜啟興的方法并略有修改。使用P/5平底柱形探頭，測試前速率為2 mm/s，測試速率為1 mm/s，測試后速率為5 mm/s，壓縮程度為50%，間隔時間為5 s，觸發(fā)力為5 g，每組處理樣品測8 組平行，結果去掉最高值與最低值后取平均值。

1.3.4 剪切力測定

剪切力測試的樣品處理方式與TPA測試的樣品相同。剪切力測試參考楊靜的方法，并略作修改。使用燕尾刀片，測試前速率為5 mm/s，測試速率為1 mm/s，測試后速率為10 mm/s，壓縮程度為50%，每組樣品測8 組平行，結果去掉最高值與最低值后取平均值。

1.3.5 感官評定

邀請8 名經(jīng)過一定感官評定培訓的人員（4男4女）組成評定小組，對河鲀魚肉進行感官評價。將解凍后的河鲀魚背部肌肉于沸水中煮5 min，依據(jù)表2的感官評定標準進行評定，結果去掉最高和最低評分后取平均值。

表2 暗紋東方鲀肉感官評定標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of Takifugu obscurus meat

1.3.6 肌原纖維蛋白與肌漿蛋白的提取與質量濃度的測定

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）與肌漿蛋白（sarcoplasmic protein，SP）的提取參考楊慧的方法并略作修改。在4.0 g切碎的魚肉中加入5 倍體積預冷緩沖液（0.1 mol/L NaCl、 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），均質（10 000 r/min、30 s）2 次后離心（10 000 r/min、10 min、4 ℃），取上清液作為SP溶液；剩余的沉淀加入20 mL上述緩沖液繼續(xù)離心（10 000 r/min、10 min、4 ℃），重復2 次，棄去上清液，所得沉淀加入20 mL上述緩沖液，4 ℃下浸提30 min，用雙層紗布過濾，濾液即為MP溶液。采用雙縮脲法測定蛋白質量濃度，以牛血清白蛋白為標準品繪制標準曲線，將所提蛋白質溶液與雙縮脲試劑以體積比1∶4混合，靜置30 min，于540 nm波長處測定吸光度。蛋白質溶液根據(jù)實驗要求調整至合適的質量濃度。

1.3.7 蛋白質巰基含量的測定

蛋白質巰基含量的測定根據(jù)Zhang Longteng等所述的方法并稍作修改。將0.5 mL 4 mg/mL蛋白質溶液添加到4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）中，充分混合后將0.5 mL 0.4 mg/L的DTNB加入4.0 mL的混合物中，40 ℃水浴25 min。對照組采用0.6 mol/L的NaCl代替蛋白質溶液，于412 nm波長處測定上清液的吸光度（）。根據(jù)式（2）計算巰基含量。

式中：為蛋白質的稀釋系數(shù)；為蛋白質濃度（4 mg/mL）；為摩爾吸光系數(shù)（13 600 L/（mol·cm））。

1.3.8 內源熒光強度的測定

根據(jù)Zhang Mingcheng等所述的方法并稍作修改。用0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0，0.6 mol/L NaCl）將蛋白質溶液稀釋至0.3 mg/mL。發(fā)射波長范圍在300～400 nm，激發(fā)波長為295 nm，掃描速率設置為1 200 nm/min。

1.3.9 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳

根據(jù)Laemmli所述的方法進行SDS-PAGE。將蛋白樣品稀釋至1.2 mg/mL，與蛋白上樣緩沖液以體積比1∶4混合，將樣品煮沸5 min。在質量分數(shù)5%濃縮膠和8%分離膠中進行電泳，上樣量為10 μL，在80 V電壓下電泳30 min，120 V電壓下電泳90 min，凝膠用質量分數(shù)0.1%考馬斯亮藍R-250染色10 min，用脫色液脫色2 h。利用凝膠成像儀觀察凝膠電泳結果。

1.3.10 MP的溶解度測定

根據(jù)Zhang Dong等所述的方法進行蛋白質溶解度的測定。用0.02 mol/L的PBS（pH 6.0、0.6 mol/L NaCl）將MP溶液的質量濃度調整為2 mg/mL，在高速冷凍離心機中以4 800 r/min離心10 min，取上清液，用1.3.6節(jié)方法測定蛋白質量濃度。按照公式（3）計算蛋白質溶解度。

1.3.11 微觀結構的觀察

根據(jù)Jiang Qingqing等所述的方法并稍作修改。將解凍后的樣品分割成5.0 mm×5.0 mm×5.0 mm的小塊，置于體積分數(shù)為2.5%的戊二醛溶液中4 ℃下固定24 h，并用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）洗脫3 次，之后將樣品脫水凍干。噴金后于掃描電子顯微鏡下觀察魚肉縱切面的微觀結構。放大倍數(shù)為200 倍。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實驗至少做3 組平行，得出的結果以平均值±標準差表示。所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析，用SPSS軟件對各平均值間的差異顯著性進行分析，以＜0.05表示差異顯著，并用GraphPad 7軟件制圖。使用XLSTAT軟件運行偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLS-R）。

2 結果與分析

2.1 不同解凍方式下養(yǎng)殖暗紋東方鲀的解凍曲線

不同解凍方式下暗紋東方鲀的中心溫度變化如圖1所示，冷藏解凍、室溫解凍、流水解凍和超聲輔助解凍到達解凍終點所需要的時間分別為210、120、22 min和10 min。由于水的傳熱效率較高，因此流水解凍和超聲輔助解凍所花費的時間更短，而超聲波的物理效應使得水中不對稱氣泡破裂，產(chǎn)生的高速射流改善了熱傳遞，從而提升了超聲輔助解凍的解凍效率，縮短了解凍時間。

圖1 不同解凍方式下暗紋東方鲀的中心溫度變化Fig. 1 Changes in internal temperature of frozen Takifugu obscurus during thawing

2.2 不同解凍方式對養(yǎng)殖暗紋東方鲀持水性及質構的影響

2.2.1 解凍方式對養(yǎng)殖暗紋東方鲀解凍損失率的影響

冷凍水產(chǎn)品解凍后的解凍損失率是衡量冷凍水產(chǎn)品持水性的重要指標，同時也與水產(chǎn)品的經(jīng)濟價值密切相關。由圖2可知，超聲輔助解凍的解凍損失率顯著高于其他處理組（＜0.05），為12.34%，而冷藏解凍的解凍損失率最低，為8.93%，這與Li Dongni等的研究結果相似。推測可能是由于采購前該養(yǎng)殖暗紋東方鲀經(jīng)過了快速冷凍，細胞內水分子的體積發(fā)生快速變化從而產(chǎn)生了一定的內應力，而當解凍速率很快時，細胞體積再一次發(fā)生快速變化產(chǎn)生內應力，從而使細胞更容易被破壞；相反，慢速解凍則不會增大其內應力。因此，超聲輔助解凍雖然縮短了解凍時間，但是超聲波也使細胞內的水分子發(fā)生劇烈的物理運動，增大了內應力，導致大量的汁液流失，而冷藏解凍盡管經(jīng)歷了較長的解凍時間，但并不會增大細胞內應力，從而使解凍損失率相對較低。

圖2 不同解凍方式對暗紋東方鲀解凍損失率的影響Fig. 2 Effects of different thawing methods on thawing loss of Takifugu obscurus

2.2.2 解凍方式對養(yǎng)殖暗紋東方鲀質構特性的影響

質構特性是衡量水產(chǎn)品品質的重要指標，并會顯著影響水產(chǎn)品的感官特性。冷凍水產(chǎn)品在解凍的過程中，肌肉硬度、彈性、咀嚼性等的差異與肌肉蛋白質的變性程度密切相關。如圖3A、B所示，部分解凍方式處理下養(yǎng)殖暗紋東方鲀的硬度與膠著性有顯著性差異（＜0.05），彈性、內聚力與咀嚼性的差異并不顯著（＞0.05）。經(jīng)過冷藏解凍后河鲀魚背部肌肉的硬度最大，為562.09 g，顯著高于流水解凍組；膠著性為246.80，顯著高于室溫解凍與流水解凍組（＜0.05），這可能是因為冷藏解凍減緩了肌肉蛋白質的降解，維持了細胞間的結合力，從而較好地保護了魚肉的質構。

剪切力作為表征質構特性的重要指標，可以反映水產(chǎn)品在解凍過程中肌肉蛋白質的化學結構狀態(tài)。由圖3C可知，冷藏解凍組的剪切力高于其他3 組，比流水解凍組高出22.31%。推測是由于在流水解凍過程中，肌肉纖維部分被破壞，蛋白質發(fā)生變性，剪切力降低，而冷藏解凍則可以較好地保護肌肉纖維結構。綜合看來，冷藏解凍組肌肉組織結構受到的損傷較小，對質構特性的保護效果優(yōu)于其余3 種解凍組。

圖3 不同解凍方式對暗紋東方鲀質構特性的影響Fig. 3 Effects of different thawing methods on texture properties of Takifugu obscurus

2.2.3 不同解凍方式對養(yǎng)殖暗紋東方鲀感官品質的影響

冷凍水產(chǎn)品在解凍過程中，其肌肉組織會因為物理、化學等作用發(fā)生一定的改變，從而使水產(chǎn)品的感官特性發(fā)生改變，這直接影響消費者對解凍產(chǎn)品的購買欲。從表3可以看出，冷藏解凍條件下暗紋東方鲀的質地和多汁性評分分別比流水解凍條件下的評分高出了30.0%、41.7%，與解凍損失率和質構特性的結果相印證，進一步說明冷藏解凍對暗紋東方鲀魚塊的肌肉損傷較小，且能較好維持肌肉的持水性與質地。超聲輔助解凍下的肌肉組織評分最高，這可能由于其快速的解凍速率維持了肌肉組織緊密完整的狀態(tài)。

表3 不同解凍方式對河鲀魚肉感官品質的影響Table 3 Effects of thawing methods on sensory quality of Takifugu obscurus

2.3 解凍方式對養(yǎng)殖暗紋東方鲀微觀結構的影響

圖4展示了不同解凍方式處理后養(yǎng)殖暗紋東方鲀縱切肌肉組織的微觀結構。冷藏解凍后的肌纖維排列最緊密，間隙均勻，組織結構保持最完整，表明其持水性最好，與上述解凍損失分析結果相符。相較于冷藏解凍組，其余3 種解凍組肌纖維間的空隙變大，導致持水性下降；其中室溫解凍組與流水解凍組的肌纖維破壞程度最大，肌纖維不再緊湊，肌肉出現(xiàn)了卷曲與斷裂，這可能會導致蛋白質發(fā)生較大程度的變性。綜上所述，冷藏解凍能夠較好地維持暗紋東方鲀的持水性與質構特性，并保持其微觀結構的緊密性與完整性。

圖4 解凍方式對暗紋東方鲀微觀結構的影響（×200）Fig. 4 Effects of thawing methods on microstructure of Takifugu obscurus (× 200)

2.4 解凍方式對養(yǎng)殖暗紋東方鲀蛋白性質的影響

2.4.1 MP的溶解度和巰基含量

蛋白質溶解度通常指的是蛋白質的肽鍵或者氨基酸側鏈與水相互作用后的離散程度，因此也可作為一項反映蛋白質變性程度的指標。如圖5A所示，冷藏解凍組的MP溶解度總體上顯著高于其余3 種解凍組（＜0.05），且較超聲輔助解凍組增加10.92%，刁小琴等同樣發(fā)現(xiàn)冷藏解凍后豬肉的MP溶解度最大。推測原因是低溫能夠減弱蛋白質的交聯(lián)程度，而超聲波的空化效應和機械效應會促進蛋白質通過疏水作用產(chǎn)生聚集體，導致蛋白質發(fā)生一定程度的變性，從而使溶解度降低。因此，盡管超聲輔助解凍未對暗紋東方鲀魚塊的表面肌肉組織造成較大的負面影響，但肌肉蛋白質仍然受到了一定程度的破壞。

圖5 不同解凍方式對暗紋東方鲀MP溶解度（A）和蛋白質巰基含量（B）的影響Fig. 5 Effects of different thawing methods on solubility of myofibrillar protein (A) and carbonyl content (B) in Takifugu obscures

蛋白質中含有大量的巰基（—SH），在解凍過程中，巰基會被氧化成為二硫鍵，因此巰基含量的減少表明蛋白質發(fā)生了變性。MP為結構蛋白，與肌肉收縮有關，并影響肉制品的質構、多汁性等食用品質。SP中含有大量酶類，這些酶類與肉制品的持水性相關，并間接影響肌肉的質構特性。如圖5B所示，在MP中，冷藏解凍組的巰基含量最高，為22.94 nmol/mg pro，比室溫解凍與流水解凍組均高約8%，這與王雪松等的研究結果趨勢一致，說明冷藏解凍對MP巰基含量的影響較小，這也與質構特性相對應。超聲輔助解凍組的MP巰基含量僅次于冷藏解凍組，推測是由于超聲輔助解凍縮短了解凍時間，減緩了MP巰基的氧化。在SP中，室溫解凍后樣品的巰基含量最低，分別比冷藏解凍、流水解凍與超聲輔助解凍組低5.5%、4.5%、7.5%（＜0.05），室溫解凍對SP巰基含量影響最大，而其余3 種解凍方式對SP的影響差異不顯著（＞0.05）。

2.4.2 蛋白質構象

內源熒光光譜法可以通過測定蛋白質結構中的芳香氨基酸殘基來表征蛋白質的三級結構，當?shù)鞍踪|三級結構發(fā)生改變時，最大熒光峰位（）與熒光強度也會發(fā)生變化，的紅移表示蛋白質結構展開，藍移則表示蛋白質發(fā)生聚集。如圖6所示，對于養(yǎng)殖暗紋東方鲀MP，4 種解凍方式下的沒有顯著性差異（＞0.05），但超聲輔助解凍組的熒光強度明顯低于其他3 種解凍組，這可能是由于超聲波使得蛋白質分子產(chǎn)生了交聯(lián)聚集，導致色氨酸殘基被包埋或被氧化，這與前述結果相對應。對于SP來說，不同解凍方式處理SP的集中在335 nm附近，相比于其他3 種解凍方式，流水解凍組的藍移，說明SP表面疏水性增大，蛋白質發(fā)生聚集。

圖6 不同解凍方式對暗紋東方鲀蛋白內源熒光光譜的影響Fig. 6 Effects of different thawing methods on intrinsic fluorescence spectrum of proteins in Takifugu obscures

2.4.3 蛋白質的交聯(lián)與裂解

圖7為經(jīng)過4 種不同解凍方式處理后MP與SP的電泳圖譜。MP主要包含肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）（約200 kDa）與肌動蛋白（約45 kDa），相比于其他兩種解凍方式，室溫解凍與超聲輔助解凍組的凝膠頂部出現(xiàn)了一些大分子聚合物，這表明MHC、肌動蛋白發(fā)生了一定程度的交聯(lián)。經(jīng)過4 種解凍方式處理后，MP的電泳圖譜沒有顯著差異，這也可能是由于一些交聯(lián)程度大的蛋白質未進入凝膠。此外，不同解凍方式造成的MHC交聯(lián)或降解都會降低蛋白質的溶解度，從而影響質構特性與持水性等食用品質。而暗紋東方鲀的SP與MP構成不同，主要包含一些具有代謝功能的酶類，其分子質量主要分布在20～100 kDa，而35～48 kDa的蛋白條帶較為明顯，但經(jīng)過不同解凍處理后樣品的SP組成并沒有發(fā)生較為明顯的變化。

圖7 不同解凍方式對暗紋東方鲀蛋白質SDS-PAGE圖譜的影響Fig. 7 Effects of different thawing methods on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis pattern of proteins from Takifugu obscurus

2.5 不同解凍方式對養(yǎng)殖暗紋東方鲀質構及持水性的影響機制

如圖8所示，使用PLS-R分析質構特性、持水性與蛋白質變性的相關關系。首先，在本研究中，對于MP而言，硬度、剪切力、質地、多汁性和、溶解度、巰基含量之間具有很強的相關性，這也意味著MP的變性會引起質構特性的下降，并對感官特性產(chǎn)生一定的影響，這與吳興閣等的研究結果一致；對于SP而言，巰基含量的下降會使肌肉組織變得更加松散，且硬度、剪切力、多汁性與有很強的相關性。其次，冷藏解凍對質構特性與感官特性有強相關性，且冷藏解凍對SP的以及MP的巰基含量、溶解度與影響較大，超聲輔助解凍與肌肉組織的相關性強，且影響SP的巰基含量，這也說明冷藏解凍能較好地保持肌肉的質地，減輕蛋白質變性的程度，超聲輔助解凍能夠較好地維持肌肉的組織。然而，由圖8可知，解凍損失率與蛋白質變性的指標相關性不強，只受到SP巰基含量的影響，推測可能是因為冰晶造成的機械損傷在解凍損失中占據(jù)主導地位，這與Zheng Yao等的研究結果相似。因此綜合看來，蛋白質的變性會造成質構與感官品質的下降，使水產(chǎn)品的質地發(fā)生改變，并間接對持水性造成影響。

圖8 偏最小二乘回歸相關分析Fig. 8 Partial least squares regression correlation

3 結 論

本研究中采用4 種解凍方式處理養(yǎng)殖暗紋東方鲀，其中，室溫解凍與流水解凍組的質構特性與感官品質較差，肌肉纖維的間隙較大，蛋白質變性程度較高；超聲輔助解凍的解凍效率最高，質構特性與感官評價較好，但解凍損失率最大，且超聲波的空化效應和機械效應使MP受到損傷，發(fā)生一定程度的變性；冷藏解凍的解凍時間最長，但能夠最大程度地保持河鲀魚的持水性與質構特性，維持肌肉結構的緊密性與完整性，且蛋白質變性程度也較低。同時，PLS-R分析結果表明，蛋白質的變性會導致水產(chǎn)品的質構特性與感官特性下降，但其對解凍損失的影響較小。綜上所述，4 種解凍方式中，冷藏解凍對SP與MP的破壞較小，解凍損失率最小，可以較好地維持凍品養(yǎng)殖暗紋東方鲀的持水性與質構特性。