方 芳 嚴(yán)彩霞 方成志 張丙宏

全球新生兒病死率最主要原因是早產(chǎn)兒并發(fā)癥，而早產(chǎn)兒腦損傷(brain injury in premature infants，BIPI)是新生兒危重并發(fā)癥之一，是影響早產(chǎn)兒早期存活及遠(yuǎn)期預(yù)后的重要因素。BIPI多發(fā)生于胎齡小于34周或體重小于2000g的早產(chǎn)兒，其中最常見(jiàn)病變是腦室周?chē)踪|(zhì)軟化(periventricular leukomalacia，PVL)和腦室周?chē)?腦室內(nèi)出血(periventricular hemorrhage-intraventricular hemorrhage，PVH-IVH)，分別為19.8%～34.1%和10.0%～20.0%，這些患兒隨著月齡的增長(zhǎng)，腦損傷所致神經(jīng)發(fā)育后遺癥改變愈發(fā)突出，包括腦癱、認(rèn)知障礙、癲癇等?，F(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外主要通過(guò)影像學(xué)手段診斷新生兒腦損傷，但其存在一定的局限性，因而迫切需要尋找能夠反映顱內(nèi)組織損傷的特異性標(biāo)志物以便能夠早期識(shí)別嚴(yán)重的BIPI，進(jìn)行早期及個(gè)性化干預(yù)治療來(lái)減少早產(chǎn)兒遠(yuǎn)期不良神經(jīng)發(fā)育結(jié)局。親環(huán)素A(cyclophilin A，CyPA)是具有肽基脯氨酰異構(gòu)酶活性的高度保守和普遍存在的蛋白質(zhì)，CyPA在神經(jīng)元的表達(dá)最高，與免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)作用相關(guān)。CD147又稱(chēng)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)，是一種高度糖基化的跨膜糖蛋白，維護(hù)血腦屏障完整性，CD147表達(dá)增加與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、癌癥等密切相關(guān)。研究證實(shí)，CD147是細(xì)胞外CyPA的細(xì)胞表面信號(hào)受體，CyPA/CD147相互作用參與炎癥、趨化、基質(zhì)降解、細(xì)胞增殖與遷移、細(xì)胞凋亡等，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過(guò)檢測(cè)早產(chǎn)兒生后不同時(shí)間點(diǎn)CyPA、CD147水平，探討CyPA、CD147及其相互作用與BIPI及其嚴(yán)重程度的關(guān)系，旨在為BIPI的病情評(píng)估及干預(yù)提供良好的思路。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：選取2019年11月～2021年7月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院出生并入住新生兒重癥監(jiān)護(hù)室(NICU)的早產(chǎn)兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胎齡≤34周早產(chǎn)兒;②出生0.5h內(nèi)入院且住院時(shí)間>7天;③臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天性遺傳代謝性疾病;②母體產(chǎn)前存在惡性腫瘤等疾病;③神經(jīng)系統(tǒng)畸形或嚴(yán)重合并癥;④自身免疫病;⑤因生后早期死亡或放棄治療無(wú)法進(jìn)行顱腦檢查及拒絕做顱腦檢查者。本研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：WDRY2022-K133)，研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。

2.標(biāo)本收集及檢測(cè)：所有患兒生后第1、3、7天采集靜脈血2ml，3000r/min離心15min，分離血清，收集上清液置于-80℃深低溫冰箱保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清CyPA、CD147含量(試劑盒購(gòu)自武漢華美生物公司)，操作過(guò)程均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3.PVH-IVH、PVL診斷及分度：所有對(duì)象出生3天內(nèi)行首次頭顱超聲檢測(cè)，并每周復(fù)查1次，直至出院；出院前或糾正胎齡滿40周完成頭顱MRI檢測(cè)。(1)PVH-IVH診斷及分度：頭顱超聲中表現(xiàn)為室管膜下區(qū)和(或)腦室內(nèi)強(qiáng)回聲。根據(jù)Papile分級(jí)法將PVH-IVH分為4級(jí)：Ⅰ級(jí)，室管膜下出血未突破室管膜；Ⅱ級(jí)，室管膜下出血突破室管膜致腦室出血，但腦室無(wú)增大；Ⅲ級(jí)，腦室出血伴腦室增大；Ⅳ級(jí)腦室出血并伴周?chē)M織出血性梗死。其中Ⅰ～Ⅱ級(jí)為輕度PVH-IVH組，Ⅲ～Ⅳ級(jí)為重度PVH-IVH組。(2)PVL診斷及分度：頭顱超聲中表現(xiàn)為白質(zhì)回聲增強(qiáng)。輕度PVL組，頭顱B超早期提示白質(zhì)回升增強(qiáng)，持續(xù)7天以上，數(shù)周后(最早在生后2周)白質(zhì)回聲恢復(fù)正常；重度PVL組，頭顱B超早期發(fā)現(xiàn)雙側(cè)腦室周?chē)植炕驈V泛強(qiáng)回聲，持續(xù)7天以上，數(shù)周后(最早在生后2周)腦室周?chē)?或)皮質(zhì)下出現(xiàn)局部或廣泛囊腔改變，或者頭顱MRI提示腦白質(zhì)異常信號(hào)。合并PVH-IVH者亦納入PVL組。

結(jié) 果

1.一般資料比較：研究期間符合入組條件的早產(chǎn)兒共65例，男性38例，女性27例。3組早產(chǎn)兒性別比、胎齡、出生體重、生產(chǎn)方式、1min、5min Apgar評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均>0.05，表1)。

2.無(wú)腦損傷組、PVH-IVH組、PVL組早產(chǎn)兒血清CyPA、CD147水平比較：生后第1、3、7天，PVL組、PVH-IVH組、無(wú)腦損傷組早產(chǎn)兒血清CyPA、CD147水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均<0.05)，各時(shí)間點(diǎn)PVL組均最高，無(wú)腦損傷組最低，PVH-IVH組居中。PVH-IVH及無(wú)腦損傷組生后第1、3、7天，CyPA、CD147水平呈下降趨勢(shì)(<0.05)，PVL組CyPA、CD147水平生后第1天最高，第3天開(kāi)始下降(<0.05)，第7天與第3天比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05，表2)。

3.輕度PVH-IVH組和重度PVH-IVH組早產(chǎn)兒血清CyPA、CD147水平比較：生后第1、3、7天，重度PVH-IVH組血清CyPA、CD147水平均明顯高于輕度PVH-IVH組(均<0.05，表3)。

4.輕度PVL組和重度PVL組早產(chǎn)兒血清CyPA、CD147水平比較：生后第1、3、7天，重度PVL組血清CyPA、CD147水平均明顯高于輕度PVL組(均<0.05，表4)。

5.血清CyPA與CD147相關(guān)性分析：CyPA與CD147呈正相關(guān)(表5)。

討 論

早產(chǎn)兒腦損傷是指由于產(chǎn)前、產(chǎn)時(shí)和(或)出生后的各種病理因素導(dǎo)致早產(chǎn)兒不同程度的腦缺血和(或)出血性損害。早產(chǎn)兒由于各器官發(fā)育不成熟，機(jī)體調(diào)節(jié)能力弱，對(duì)缺血、缺氧、感染等不良因素的敏感度高，極易引發(fā)一系列的多器官功能障礙，甚至導(dǎo)致神經(jīng)功能的永久性損傷。顱腦超聲是目前診斷BIPI的首選檢查，但漏診率較高，并且患兒早期行MRI檢查存在一定的風(fēng)險(xiǎn)和困難。事實(shí)上，在腦損傷出現(xiàn)影像學(xué)改變之前，神經(jīng)細(xì)胞的急性損傷已經(jīng)發(fā)生，因此尋找特異性血清標(biāo)志物檢測(cè)將有助于BIPI的早期診斷及病情評(píng)估。

CyPA是親環(huán)素家族中含量最多、細(xì)胞內(nèi)分布最廣的蛋白質(zhì)，在免疫反應(yīng)、炎癥、神經(jīng)元功能調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮重要功能，CyPA水平的增加會(huì)損害幼齡小鼠的認(rèn)知能力。CD147作為免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)。Kyng等利用新生豬仔制備缺氧缺血性腦損傷模型，發(fā)現(xiàn)腦損傷后CyPA在血漿和腦脊液中均升高，可作為有希望的候選生物學(xué)標(biāo)志物。腦卒中患者24h后的高水平血清CD147提示預(yù)后不良，并可作為缺血性腦卒中新的臨床靶點(diǎn)。但目前尚未有CyPA、CD147與BIPI相關(guān)的深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，PVL組早產(chǎn)兒血清CyPA、CD147水平在出生后1、3、7天明顯高于無(wú)腦損傷組和PVH-IVH組，PVH-IVH組高于無(wú)腦損傷組，表明CyPA、CD147與BIPI的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。BIPI機(jī)制尚未完全闡明，目前多認(rèn)為與早產(chǎn)兒腦發(fā)育成熟度、缺氧、缺血、炎癥等相關(guān)，急性腦損傷后血-腦脊液屏障通透性升高，CyPA、CD147從損傷組織中釋放入血。CyPA、CD147參與BIPI病理過(guò)程考慮為：①CyPA/CD147通路激活，可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生，破壞血-腦脊液屏障間的緊密連接;②CyPA、CD147參與免疫介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥;③CyPA與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)結(jié)合致線粒體功能障礙，CyPA/CD147還參與并激活多種神經(jīng)元細(xì)胞凋亡途徑。表明檢測(cè)血清CyPA、CD147能在一定程度上反映早產(chǎn)兒腦損傷。

本研究還發(fā)現(xiàn)PVH-IVH組和無(wú)腦損傷組CyPA、CD147水平在生后第1、3、7天呈下降趨勢(shì)，PVL組CyPA、CD147水平生后第1天最高，第3天開(kāi)始下降，第7天與第3天比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示血清CyPA、CD147在生后第1天達(dá)到峰值，第3天開(kāi)始下降，而發(fā)生PVL的患兒在生后7天仍處于一定的高水平。本研究還顯示，PVL組CyPA、CD147水平在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于無(wú)腦損傷組和PVH-IVH組，提示CyPA、CD147水平與腦損傷類(lèi)型有關(guān)。少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells，OPC)受損和髓鞘形成不足是PVL標(biāo)志性特征。ROS可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活致神經(jīng)細(xì)胞死亡，若OPC沒(méi)能進(jìn)行增殖或遷移補(bǔ)充，使成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞缺乏和腦髓鞘形成不足，最終導(dǎo)致腦白質(zhì)損傷。研究表明，CyPA是分泌性ROS主要誘導(dǎo)因子，抑制CD147可促進(jìn)OPCs增殖，增加成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞生成，促進(jìn)白質(zhì)修復(fù)。表明CyPA、CD147參與PVL的病理機(jī)制，可作為BIPI的生物學(xué)標(biāo)志物，并對(duì)區(qū)分PVL與其他腦損傷提供一定參考價(jià)值。

既往研究表明，CyPA在急性腦損傷后表達(dá)升高，與嚴(yán)重程度和預(yù)后高度相關(guān)，急性腦梗死患者血漿CD147升高水平與神經(jīng)功能缺損程度呈正相關(guān)。本研究顯示，重度腦損傷患兒生后1、3、7天表達(dá)水平均高于輕度腦損傷組，提示CyPA、CD147能反映腦損傷嚴(yán)重程度，CyPA、CD147可作為判斷BIPI病情的潛在標(biāo)志物。CyPA與CD147呈顯著正相關(guān)，CyPA/CD147或可成為BIPI干預(yù)治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，BIPI發(fā)生后導(dǎo)致血清CyPA、CD147水平升高，可作為早期預(yù)測(cè)BIPI及評(píng)估病情嚴(yán)重程度的生物學(xué)標(biāo)志物。CyPA生物學(xué)作用遠(yuǎn)多于CD147，CyPA與CD147的下游信號(hào)通路及在新生兒腦損傷中的作用機(jī)制仍需開(kāi)展進(jìn)一步研究予以證實(shí)。