孫玲利，劉一思，浦發(fā)軍，郝振芳，寧俊平，宋艷畫

（1.河南農業(yè)職業(yè)學院，河南鄭州 451450；

2.四川農業(yè)大學動物科技學院，四川雅安 625014；

3.汝州市畜牧局，河南汝州 467599）

腸道內定植著種類繁多的微生物，在宿主生理和免疫中發(fā)揮重要作用，與畜禽健康和生產性能密切相關（Wen等，2019）。隨著16S rRNA測序技術的不斷普及，關于家禽腸道微生物定植的研究不斷取得進展。以往研究認為，禽類胚胎本身沒有微生物定植（Corry等，2001）。但也有研究認為，禽類胚胎期腸道微生物的定植是由于孵化過程的存放或處理不當?shù)仍蛟斐傻耐饨绮≡⑸锏那秩耄↙i等，2013）。但禽類胚胎在吸收卵黃過程中是否已經有腸道微生物的定植，以及是否由外界污染造成的還需進一步研究。

在禽類孵化后期，蛋中剩余的卵黃被腸道吸收，作為胚胎后期和孵化后發(fā)育的營養(yǎng)來源（Ding等，2021）。因此，我們推測，在卵黃吸收的前期和后期，腸道微生物的組成和功能可能會發(fā)生變化。作為水禽，鴨具有在胚胎發(fā)育中期開始由小腸吸收卵黃的特點，且卵黃吸收與胚胎發(fā)育密切相關。但目前對鴨胚胎發(fā)育過程中腸道微生物定植的變化尚未見報道。本研究通過對卵黃吸收過程中不同時期的鴨胚胎的整個腸道進行16S rRNA測序，探究鴨胚胎腸道中是否已有微生物定植及其變化規(guī)律，旨在為鴨胚胎期的腸道微生物定植提供理論參考，同時也為禽類胚胎期的腸道微生物定植及禽類腸道微生物區(qū)系的相關研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集 將20月齡農華麻鴨的種蛋置于孵化機中孵化，在溫度37.2～37.8℃，濕度55%～65%濕度的無菌房間內進行。種蛋重量平均為78.3 g，無顯著性差異。在無菌條件下收集18份樣品，包括孵化至第16天、22天的胚胎和出殼第一天雛鴨的整個腸道，每個階段6個樣品，用于腸道微生物的測定。將采集的樣品裝入EP管中-80℃保存。剛孵出的雛鴨被養(yǎng)在無菌室里。胚胎標本采集、微生物基因組DNA提取、PCR擴增均采用無菌操作。

1.2 DNA提取及16S rRNA測序 將16、22胚齡和出殼第一天鴨胚胎的整個腸道勻漿后，采用常用的SDS方法提取樣本DNA，并采用瓊脂糖凝膠電泳的方式檢測DNA的純度和濃度。同時，將提取的樣本DNA使用無菌水進行稀釋，將樣品DNA的濃度稀釋至1 ng/μL。以稀釋濃度為1 ng/μL樣品DNA為模板，擴增所有微生物16S rRNA序列，進行PCR擴增產物的克隆與篩選，構建16S rRNA基因文庫，對16S rRNA的V3-V4高變區(qū)進行測序和數(shù)據(jù)分析。樣本基因組的建庫、測序工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001）對所有樣品的全部待分析數(shù)據(jù)（Clean Reads）進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單位（OTUs），并基于Mothur方法和SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對物種進行注釋分析（設定閾值為1）。腸道樣品稀釋曲線、腸道微生物的主成分分析（PCA）及腸道微生物的等級豐度（Rank abundance）曲線采用R軟件（Version 2.15.3）進行繪制。提取KEGG數(shù)據(jù)庫原核生物全基因組16S rRNA基因序列，并利用PAUDA和UProC兩種方法注釋的KEGG數(shù)據(jù)庫原核生物全基因組功能信息對應到SILVA數(shù)據(jù)庫中，進而實現(xiàn)SILVA數(shù)據(jù)庫的功能注釋。測序樣品則以SILVA數(shù)據(jù)庫序列作為參考序列聚類出OTU，進而獲取腸道微生物的功能注釋信息。

2 結果

2.1 微生物多樣性分析及物種注釋分析 首先根據(jù)測序OTUs數(shù)量繪制稀疏曲線，結果如圖1 A，當測序深度＞100 reads時，曲線趨于平緩，表明測序深度合理，結果足以反映腸道菌群的物種多樣性。根據(jù)豐度等級曲線分析，在物種豐度和物種均勻度方面，E22組在橫軸上跨越范圍較大，物種豐度最高；D1組曲線更平坦，代表物種分布更均勻，結果如圖1 B所示。運用PCA比較各組微生物組成的相似性，結果如圖1 C，各個階段組間和組內都較為集中，說明各個階段之間腸道微生物組成有一定關聯(lián)。

圖1 腸道微生物多樣性分析

物種注釋結果顯示，在16、22 d的胚胎及出殼第一天雛鴨腸道微生物中共存在23個門、276個屬、200個種。門水平上（圖2 A），最豐富的門是變形菌門，其次是厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門。屬水平上（圖2 B），最豐富的是假單胞菌，其次是羅姆布茨菌，還有少量擬桿菌、乳酸桿菌屬、糞桿菌屬等。

圖2 胚胎期（E16.E22）與出殼后（D1）門、屬水平上腸道菌群結構組成

2.2 微生物的功能注釋分析 由圖3可知，胚胎期及出殼后各階段的腸道微生物基因富集在29個次生代謝通路上，這些信號通路大多與生長和發(fā)育有關。E16階段腸道微生物基因主要富集在以輔酶和維生素代謝、能量代謝、脂質代謝、氨基酸代謝等物質代謝有關的通路上。而E22階段主要富集在遺傳物質復制與修復、轉運、翻譯等信號通路上，和核苷酸代謝、碳水化合物代謝有關的通路上。D1階段主要富集在信號傳導、膜轉運及代謝，主要是代謝和遺傳信息處理。

圖3 腸道微生物功能注釋分析

3 討論

早期研究認為，剛出殼的健康雛雞消化道處于無菌狀態(tài)，之后在外界開放環(huán)境的影響下逐步建立起簡單的腸道微生物區(qū)系（王晶等，2020）。近年來，隨著16S rRNA基因測序技術的應用，發(fā)現(xiàn)最初的腸道微生物定植發(fā)生在雛雞出殼前，認為母雞是雞胚微生物的重要來源（Ding等，2020；Lee等，2019）。因此，本試驗發(fā)現(xiàn)，在鴨胚胎腸道中已有微生物定植是一種正?，F(xiàn)象。本試驗進一步研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期各階段微生物的組成與出殼后第一天的微生物組成具有一定的關聯(lián)性，認為母鴨微生物群是鴨胚微生物群的重要來源，并且存在從母鴨到胚、胚到雛鴨的腸道菌群傳播過程。隨著鴨胚胎的發(fā)育，鴨胚腸道菌群的多樣性增加，出生后雛鴨體內腸道菌群的多樣性呈下降趨勢，腸道微生物區(qū)系由簡單變?yōu)閺碗s，且逐漸趨于穩(wěn)定。由此可見，腸道最初定植的微生物易受發(fā)育階段的環(huán)境因素及宿主遺傳的影響。

Sekelja等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，在門水平上，腸道微生物菌群由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門構成，這與本研究結果一致。先前研究發(fā)現(xiàn)，母雞輸卵管微生物區(qū)系的核心菌屬為假單胞菌、乳酸桿菌、巨單胞菌和擬桿菌，雞胚中核心菌屬為擬桿菌和糞桿菌（Lee等，2019；Gong等，2007）。而本研究表明，在鴨胚期及D1期核心菌屬為假單胞菌、乳酸桿菌、糞桿菌、腸球菌和擬桿菌。由此可見，隨著鴨胚胎發(fā)育，腸道中已開始有微生物定植，且各個分類層次上種類都較為豐富。進一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著胚胎期腸道菌群的進化，它們可能發(fā)展出更復雜的功能通路。在胚胎期，鴨腸道微生物功能主要與腸道組織結構的不斷發(fā)育與功能的不斷完善相適應，與胚胎期相比，D1期除了參與新陳代謝外，腸道微生物更多參與到物質轉運中，提示腸道微生物功能與宿主的生長發(fā)育密切相關。

4 結論

綜上所述，在鴨胚的不同發(fā)育階段，鴨腸道中已開始有微生物定植。鴨胚的腸道微生物主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門組成，其中糞桿菌、擬桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬為核心菌屬，且這些腸道微生物主要是參與營養(yǎng)物質代謝、遺傳信息處理、信號傳導、膜轉運等。說明腸道微生物在鴨胚不同發(fā)育階段均有定植，并隨卵黃吸收和腸道發(fā)育發(fā)生變化，其可為鴨腸道微生物區(qū)系的進一步研究提供參考，并為禽類胚胎的相關研究提供理論依據(jù)。