嚴嘉耕，宋新輝，呂培茹，李志鵬，尹 珊，崔奎青，王彥濤，劉紅波*，劉慶友

（1.廣西大學 亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530004；2.佛山科學技術學院 廣東省動物分子設計與精細育種重點實驗室，廣東佛山 528225；3.河南創(chuàng)源生物技術有限公司，河南鄭州 451100）

馬是一種重要的經濟牲畜，不僅為人類健康提供營養(yǎng)優(yōu)勢，還可用于豐富休閑生活。在現(xiàn)代馬業(yè)中，馬匹主要用于賽馬、馬術、體育娛樂等，具有巨大的社會效益和經濟效益。與其他哺乳動物相比，馬的生殖生理具有特殊性，如單胎，季節(jié)性多次發(fā)情，卵巢有排卵窩，沒有真正的排卵前LH峰及馬卵母細胞的細胞質中含有豐富的脂滴，但缺乏顆粒狀內質網、高爾基體和馬卵母細胞復合體，且與卵泡壁緊密相連（Metcalf等，2020）。到目前為止，仍沒有獲得馬不同發(fā)育階段卵母細胞的轉錄譜，導致馬卵母細胞的許多關鍵轉錄事件尚未確定。本研究擬應用Smart-seq2技術探討馬GV期和IVM MII期卵母細胞基因表達模式，揭示影響馬卵母細胞成熟的候選基因及其調控機制。

1 材料與方法

1.1 卵母細胞體外成熟 從當?shù)赝涝讏鍪占R新鮮卵巢，置于含25℃生理鹽水（含青霉素/鏈霉素）的保溫壺中，在2 h內運送至實驗室，按照Hinrichs K等（1993）的方法回收卵丘-卵母細胞復合體（COCs）。在體式顯微鏡下挑選具有3層以上顆粒細胞且胞質均勻的COCs，轉移到每孔含1 mL成熟培養(yǎng)基的四孔板中，在38.5℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)34 h。

1.2 GV與MII期卵母細胞收集與測序 將未成熟和體外成熟的馬卵母細胞分為“GV”和“MII”兩組，每組3個重復，每個重復10個卵母細胞，轉移到裂解緩沖液中。采用Smart-seq2方法建立測序文庫，并使用Illumina NovaSeq 6000對文庫進行測序，該文庫產生具有150 bp（PE150）讀取長度的成對末端文庫。

1.3 差異表達基因的鑒定 Clean data上傳到NCBI Sequence Read Archive（登 錄 號 PRJNA769150）。Clean Reads比 對 到 馬 基 因 組（EquCab2）。 用DESeq和P值評價GV和MII期卵母細胞基因表達的差異。然后用Cufflinks軟件根據(jù)FPKM估算該基因的表達水平。以FDR＜0.05且|（Fold Change）| ≥ 1.5作為篩選差異表達基因（DEGs）的標準，并對其進行GO和KEGG分析。

1.4 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)值以平均值（Mean）±標準誤（SEM）表示，采用SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進行單因素分析和t檢驗，P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結果

2.1 馬卵母細胞的體外成熟 由表1可知，1461個COCs進行體外成熟后，獲得了537個MII卵母細胞。MII卵母細胞的發(fā)生率顯著高于MI卵母細胞（P＜0.05）。

表1 體外培養(yǎng)后不同階段卵母細胞百分比

2.2 scRNA-seq數(shù)據(jù)概述 獲得細胞質均勻的馬GV和IVM MII卵母細胞（圖1 A），主成分分析（PCA）顯示，GV和MII卵母細胞中mRNA的不同表達模式取決于發(fā)育階段（圖1 B）。在本研究中，分別在GV和MII卵母細胞中特異性表達了2275和726個基因（圖1 C）。共鑒定有9969個基因差異表達，其中5279個基因在GV卵母細胞中高表達，而4690個基因在MII卵母細胞中高表達（圖1 D）。

圖1 馬GV和MII期卵母細胞的轉錄組分析

2.3 卵母細胞發(fā)育過程中的差異表達基因 GV組和MII組前10個注釋到的差異表達基因見表2，LGALS3、RAB13等基因在卵母細胞從GV期到MII期的轉變過程中異常表達，這些顯著差異表達的基因可能參與卵母細胞成熟的分子調控。

表2 Fold Change最高和最低的前10個基因

2.4 GO和KEGG分析 由圖2可知，DEGs在線粒體、RNA、NADH脫氫酶（泛醌）活性等GO terms上得到顯著富集，這說明卵母細胞成熟的過程伴隨著線粒體活性的變化。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要富集在核糖體、細胞周期、氧化磷酸化等相關通路（圖3）。

圖2 差異表達基因（DEGs）GO富集分析

圖3 差異表達基因（DEGs）KEGG富集分析

2.5 qRT-PCR驗證 由圖4可知，母源基因GDF9和BMP15的表達顯著下調（P＜0.05），證明了RNA-seq測序結果的準確性和重復性。

圖4 母源基因的相對表達量

3 討論

卵母細胞成熟受卵母細胞中母源mRNA分子網絡等多個生物事件調控（Appeltant等，2016），已在豬、黃牛和水牛等哺乳動物中得到廣泛研究（Yang等，2017）。與其他哺乳動物一樣，在馬卵母細胞體外成熟過程中，隨著母源基因表達量的下調，如 GDF9和 BMP15（Rong等，2019）。

在上調基因中，LGALS3最顯著，可介導人精子-透明帶結合，并影響體外受精過程（Mei等，2019）。故我們推測LGALS3對體外受精預備很重要。HERC6屬于泛素連接酶HERC家族，在第16天妊娠期比環(huán)子宮內膜表達增加。CyclinD2（CCND2）負責卵巢細胞增殖，最突出的作用是調節(jié)細胞周期中的G1/S相變，也在卵泡形成過程中對卵丘細胞的增殖起關鍵作用。TBL3在斑馬魚發(fā)育過程中調節(jié)細胞周期長度（Hutchinson等，2020）。CDK1（細胞周期蛋白依賴性激酶1）通過調節(jié)中心體周期和有絲分裂的開始來調節(jié)真核細胞周期。ERK1/2和CDK1的合作和正反饋激活導致小鼠CDK1成熟過程中mRNA翻譯和細胞周期進程的微調（Cao等，2020）。但其他基因如RAB13、STC1和PLS3在哺乳動物卵母細胞中研究較少。

4 結論

本研究鑒定了多個影響卵母細胞成熟的候選DEGs，這些候選基因主要與氧化磷酸化、線粒體活性相關。本研究為全面理解卵母細胞成熟過程中mRNAs的表達水平提供了基礎，為理解馬卵母細胞成熟的分子調控機制，尤其是其中關鍵基因的潛在調節(jié)作用提供了新的線索。