譚鳳嬌，肖鵬，左俊，金磊，程晨，雷臘梅，謝麗強，楊軍,*

1.中國科學院城市環(huán)境研究所，福建省流域生態(tài)學重點實驗室，城市環(huán)境與健康重點實驗室，水生態(tài)健康研究組，廈門 361021

2.中國科學院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008

3.中國科學院大學，北京 100049

4.暨南大學生命科學技術(shù)學院生態(tài)學系，廣州 510632

近20多年來，在氣候變化和人類活動的多重壓力下，內(nèi)陸水體藍藻水華發(fā)生頻率和強度呈快速增加趨勢，特別是產(chǎn)毒水華藍藻嚴重威脅水生態(tài)系統(tǒng)健康和飲用水安全[1]。除了在淺水湖泊常見的微囊藻水華之外，新型水華藍藻拉氏尖頭藻(Raphidiopsisraciborskii)由于其高毒性、暴發(fā)性和入侵性日益受到關(guān)注[2-3]。拉氏尖頭藻曾被稱為拉氏擬柱胞藻(Cylindrospermopsisraciborskii)，由于其細胞形態(tài)和16S rRNA基因序列與尖頭藻高度相似，因此分類學者目前在藍藻分類系統(tǒng)中將擬柱胞藻屬和尖頭藻屬統(tǒng)一合并為尖頭藻屬[4]。

拉氏尖頭藻隸屬藍藻門、念珠藻目、束絲藻科[5]，包括產(chǎn)毒株和無毒株，兩者在形態(tài)和16S rRNA基因方面難以區(qū)分，但是產(chǎn)擬柱胞藻毒素的藻株含有完整的擬柱胞藻毒素合成基因[6-7]。在同一水體分離到的拉氏尖頭藻細胞和藻絲體長度和寬度可能具有差異[8]，拉氏尖頭藻產(chǎn)毒藻株和無毒藻株可同時共存于相同水體中[9-10]。目前，利用分子標記和產(chǎn)毒基因可以進行拉氏尖頭藻分析，系統(tǒng)發(fā)育分析常用16S rRNA基因、rpoC1基因、16S～23S轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)等序列[11-12]，其中16S rRNA基因測序能夠有效地區(qū)分藍藻屬種間和種內(nèi)的變異[13-14]。此外，基于DNA序列的產(chǎn)毒藍藻PCR檢測方法已被成功應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測，可以通過擴增毒素合成基因來實現(xiàn)，例如微囊藻毒素和擬柱胞藻毒素(CYNs)合成基因檢測[15-16]。其中，cyrJ基因是能夠進行CYNs生物合成的藍藻所特有的[6]。CYNs合成基因簇包括編碼氨基轉(zhuǎn)移酶的cyrA、一個混合聚酮合成酶/非核糖體肽合成酶(PKS/NRPS)模塊(cyrB)、4個PKS(cyrC、cyrD、cyrE和cyrF)模塊和剪切酶等[6]。擬柱胞藻毒素是一種三環(huán)胍類生物堿，已報道5種異構(gòu)體，其中擬柱胞藻毒素(CYN)和脫氧擬柱胞藻毒素(deoxy-CYN)最為常見[17]。

拉氏尖頭藻常見于熱帶深水水體，能夠耐受不利環(huán)境條件如低光照強度和低營養(yǎng)水平，目前CYNs是全球第二常見的藍藻毒素[7,18-20]。有研究者將其廣泛分布歸因于其較高的表型可塑性、產(chǎn)生化感物質(zhì)和氣候變化等[21-24]。從21世紀初開始，越來越多的證據(jù)顯示拉氏尖頭藻呈現(xiàn)出從熱帶逐漸向亞熱帶和溫帶地區(qū)擴散的趨勢[2-3]。在我國，尤其在亞熱帶地區(qū)深水水庫拉氏尖頭藻水華發(fā)生頻率逐漸增加，近年來已逐漸成為我國東南地區(qū)水庫水華藍藻優(yōu)勢種群[25-26]。國內(nèi)學者雖然已經(jīng)成功分離多株拉氏尖頭藻藻株，但是產(chǎn)毒藻株較為稀缺。目前僅在浙江省杭州市湘湖分離3株產(chǎn)CYN藻株，廣東省千燈湖分離1株產(chǎn)deoxy-CYN藻株[27-29]。

本研究從福建省廈門市石兜水庫分離到4株拉氏尖頭藻，通過形態(tài)特征觀察、16S rRNA基因和cyr產(chǎn)毒基因序列分析，結(jié)合ELISA和LC-MS/MS化學檢測確定分離到的藻株均為產(chǎn)毒拉氏尖頭藻，研究結(jié)果有助于深入理解產(chǎn)毒拉氏尖頭藻的地理分布與擴散規(guī)律，可為新型有害藍藻監(jiān)測預(yù)警和水華防控研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 藻種的分離鑒定和培養(yǎng)(Isolation,identification and culture of Raphidiopsis raciborskii)

石兜水庫位于福建省廈門市苧溪上游(圖1)，1959年10月建成。本研究中所用的拉氏尖頭藻均采集、分離自石兜水庫(24°42' N，118°00'E)，拉氏尖頭藻純化培養(yǎng)后，保種培養(yǎng)于中國科學院城市環(huán)境研究所水生態(tài)健康研究組。石兜水庫庫容為6.14×107m3，目前為廈門市主要的飲用水水源之一[30]。廈門市屬于亞熱帶季風性濕潤氣候區(qū)，多年平均氣溫和降水量分別為20.7 ℃和1 335.8 mm。水生態(tài)健康研究組于2010年1月在石兜水庫發(fā)現(xiàn)藻類水華，鑒定水華種類為拉氏尖頭藻(亦稱拉氏擬柱胞藻)，隨后對石兜水庫進行長期連續(xù)定位監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)拉氏尖頭藻水華具有年際演替性[31]，特別是在廈門水庫枯水年份(2009—2010年、2014—2015年、2017—2018年和2020年)拉氏尖頭藻均為絕對優(yōu)勢藻類，并形成不同程度的藍藻水華。

2018年4月，采集石兜水庫表層0.5 m的原水，在培養(yǎng)皿中利用毛細管挑取單藻絲體進行培養(yǎng)(圖1)。首先，在200倍倒置光學顯微鏡下觀察拉氏尖頭藻形態(tài)，用毛細管吸取單藻絲體，在預(yù)先準備的超純水中反復沖洗，至少沖洗5～6次，去除藻細胞表面附帶的雜物異物；其次，將洗滌后的藻絲體轉(zhuǎn)移至含有200 μL BG11培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中，放置于光照培養(yǎng)箱(寧波賽福公司，PG250)進行培養(yǎng)。設(shè)置培養(yǎng)溫度為(27±1) ℃，光照強度為10 μmol·m-2·s-1，光照周期為12 h∶12 h；最后，每2～3 d觀察一次培養(yǎng)的拉氏尖頭藻，2～3周后再次鏡檢進行物種鑒定，將生長良好的藻株轉(zhuǎn)移至50 mL錐形瓶進行擴大培養(yǎng)。本研究中，共分離培養(yǎng)出4株生長良好的拉氏尖頭藻(圖1)，命名為R.raciborskiiXM1～XM4。

用于實驗研究的藻株均同時接種于150 mL BG11培養(yǎng)基中，當藻株處于對數(shù)生長后期時(細胞密度約為108cell·L-1)，同時對4株藻株取樣后進行各項指標測定分析，以確保實驗過程中的一致性。

1.2 擬柱胞藻毒素分析(Cylindrospermopsin analysis)

首先使用Abraxis酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒(美國Abraxis，#522011)測定CYNs總濃度。將培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的4株拉氏尖頭藻培養(yǎng)液分別取出2 mL，置于5 mL離心管中利用超聲波破碎儀裂解藻細胞，將裂解后的藻液離心后收集上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩y定。按照說明書測定CYNs濃度，為防止毒素濃度過高，對上清液10倍稀釋后進行測定，每個樣品測定3次重復。

使用LC-MS/MS(日本島津，AB SCIEX API 3200TM)對拉氏尖頭藻藻液中CYNs進行測定分析。將培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的4株拉氏尖頭藻培養(yǎng)液分別取出5 mL，超聲波細胞粉碎儀進行細胞破碎，使用0.45 μm濾膜(Acrodisc?Syringe Filter)過濾后-20 ℃保存?zhèn)溆?。隨后，使用AB SCIEX API 3200TMLC-MS/MS系統(tǒng)進行毒素測定，離子源為ESI，采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)正離子模式。CYN掃描MRM定量離子對為416.1/194.3，deoxy-CYN為400/194.3。液相色譜采用梯度模式洗脫，流動相為5% (V∶V)乙腈，色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×50 mm,2.7 μm)，柱溫為40 ℃，進樣量為20 μL，流速為0.6 mL·min-1。CYN和deoxy-CYN的定量均根據(jù)CYN的標準曲線進行計算。通過將CYNs濃度(μg·L-1)除以細胞豐度(cell·L-1)，計算CYNs細胞配額，最后將結(jié)果乘以106將μg·cell-1轉(zhuǎn)化為pg·cell-1[32]。

1.3 DNA提取、PCR擴增和測序(DNA extraction,PCR amplification and sequencing)

在拉氏尖頭藻的對數(shù)生長后期分別吸取純培養(yǎng)液15 mL，使用0.22 μm聚碳酸酯濾膜(直徑47 mm)過濾收集藻細胞，使用超純水進行重懸浮和過濾，洗滌5～6次，將濾膜在無菌條件下剪至適當大小，按照說明書使用FastDNA提取試劑盒(MP Biomedicals)進行DNA提取。通過超微量分光光度計(Nanodrop 2.0)檢測DNA的濃度和質(zhì)量。

利用細菌16S rRNA基因通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)[33]，對4株拉氏尖頭藻基因組進行PCR擴增。PCR擴增程序為預(yù)變性95 ℃、2 min；循環(huán)擴增35次：95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、60 s；隨后延伸72 ℃、10 min；最后4 ℃保溫。將PCR擴增產(chǎn)物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，切取純化單一明亮的目標條帶，進行大腸桿菌連接、轉(zhuǎn)化和涂平板，挑取單克隆進行搖菌和DNA測序。測序成功的單克隆DNA序列在BioEdit軟件(美國Borland)中進行人工質(zhì)量確認和16S rDNA序列拼接，在NCBI中進行BLAST相似性分析。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析(Phylogenetic analysis)

從4株拉氏尖頭藻中成功獲得14條16S rRNA基因克隆序列(表1)，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中來自不同國家的166株拉氏尖頭藻和10株外類群藍藻的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將190條16S rRNA基因序列使用MUSCLE軟件進行序列比對[34]，然后利用trimAl軟件[35]進行低質(zhì)量以及高變異度序列的過濾和修剪，最終用于構(gòu)建系統(tǒng)樹的DNA序列長度為1 004 bp。使用IQ-TREE最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)樹[36]，所使用的最優(yōu)模型為HKY+F+R2[37]。為進一步驗證系統(tǒng)進化樹的可靠性，同時使用MEGA X軟件構(gòu)建鄰接關(guān)系(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹[38]。對系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度進行1 000次重復抽樣(Bootstrap)驗證。最后在MEGA X中編輯系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 廈門石兜水庫拉氏尖頭藻藻株16S rRNA基因序列GenBank登錄號Table 1 GenBank accession numbers for 16S rRNA gene sequence of Raphidiopsis raciborskii strains from Shidou Reservoir in Xiamen

1.5 基因組Survey測序(Genome survey sequencing)

將檢測質(zhì)量和濃度合格的R.raciborskiiXM2基因組DNA構(gòu)建小片段文庫，通過Illumina HiSeq平臺進行PE150測序。將序列數(shù)據(jù)使用Trimmomatic軟件進行質(zhì)量過濾[39]，去除低質(zhì)量的序列，再使用SOAPdenovo軟件[40]依次選擇21～81的kmer值進行基因組拼接，最后基于N50值確定最優(yōu)結(jié)果。選擇GenBank中R.raciborskiiAWT205的CYN合成基因簇為參考序列，使用本地BLAST通過序列比較獲取藻株的CYN合成基因簇。R.raciborskiiXM2基因組序列已經(jīng)提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，BioProject為PRJNA796232，登錄號為SRR1757-4388。

2 結(jié)果(Results)

2.1 拉氏尖頭藻形態(tài)與產(chǎn)毒特征(Morphological and toxic characteristics of Raphidiopsis raciborskii)

經(jīng)顯微鏡鑒定，在廈門石兜水庫所分離的4株藻株均為拉氏尖頭藻(圖1)，分別將其命名為R.raciborskiiXM1、XM2、XM3和XM4。對4株拉氏尖頭藻的16S rRNA基因進行克隆分析，共獲得14條序列(表1)，同已知的拉氏尖頭藻16S rRNA基因相比，序列相似性為99.8%～100%，表明本研究分離的4株藻株均為拉氏尖頭藻。

形態(tài)上，4株拉氏尖頭藻藻絲體均為直線型、不彎曲(圖1(b))，無鞘、具有氣囊，藻絲體平均長度分別為(199.22±11.57) μm、(168.31±6.57) μm、(191.90±12.83) μm和(122.23±3.50) μm(n=100)。藻細胞為圓柱形或圓筒形，長大于寬，4個藻株的細胞平均長度為(4.26±0.32) μm、(4.25±0.21) μm、(4.10±0.24) μm和(3.79±0.19) μm(n=20)。分離培養(yǎng)初期，藻絲體頂端生有異形胞，異形胞呈卵形或者水滴形，有時略彎曲，具單孔。在富含氮條件培養(yǎng)過程中隨著藻絲的生長，異形胞消失、頂端變尖細；缺氮培養(yǎng)處理后，藻絲體頂端異形胞會重新出現(xiàn)(圖1(b))。藻絲體細胞橫壁明顯、常收縊，藻絲體末端細胞呈圓錐形，圓錐體頂部較尖，少數(shù)藻絲體較鈍。此外，在培養(yǎng)過程中可觀察到藻絲體的厚壁孢子，為亞端生。

ELISA檢測結(jié)果顯示，XM1、XM2、XM3和XM4擬柱胞藻毒素均為陽性(表2)。LC-MS/MS檢測結(jié)果顯示，4株藻株能夠同時合成CYN和deoxy-CYN(表2)；其中XM1、XM2和XM3主要合成CYN，CYN平均濃度分別為0.87、1.02和0.71 pg·cell-1，deoxy-CYN平均濃度分別為0.15、0.16和0.13 pg·cell-1；XM4主要合成deoxy-CYN，CYN濃度為0.03 pg·cell-1，deoxy-CYN濃度為0.42 pg·cell-1。

表2 ELISA和LC-MS/MS方法測定拉氏尖頭藻藻株的擬柱胞藻毒素(CYNs)Table 2 The cylindrospermopsins (CYNs) in four Raphidiopsis raciborskii strains determined by ELISA and LC-MS/MS

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析(Phylogenetic tree analysis)

16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，180株拉氏尖頭藻形成四大進化枝(圖2)：非洲類群枝(MJ樹Bootstrap值為22%，n=10)、亞洲和歐洲類群枝(MJ樹Bootstrap值為45%，n=106)、大洋洲類群枝(主要為澳大利亞藻株)(MJ樹Bootstrap值為32%，n=28)和美洲類群枝(美國和巴西的藻株)(MJ樹Bootstrap值為18%，n=36)。

有趣的是，廈門分離的4株拉氏尖頭藻分別位于不同的進化枝(圖2)。其中，XM2藻株16S rRNA基因序列與非洲藻株遺傳距離最近；另外3個藻株(XM1、XM3和XM4)位于亞洲/歐洲類群分枝。XM1、XM3和XM4藻株基因序列與已報道中國杭州藻株、泰國藻株、日本藻株和德國藻株遺傳距離較近。

2.3 拉氏尖頭藻cyr基因簇(cyr gene cluster of Raphidiopsis raciborskii)

選取R.raciborskiiXM2進行基因組測序后，對cyr基因簇進行組裝、分析和注釋，其完整長度約為38 kb(圖3和表3)。XM2藻株cyr基因簇包含12個cyr基因?；蛐蛄信c拉氏尖頭藻AWT205、CHAB3438和CHAB358藻株同源性較高(98.97%～99.84%)；而且cyr簇中基因排列比較顯示，不同藻株的cyr基因序列較為保守，但排列模式各不相同。相比而言，XM2藻株的cyrB基因序列被分割成2部分，cyrI基因被分割為3部分；XM2藻株cyr基因簇中缺少cyrL、cyrN和cyrO基因(圖3和表3)。

表3 拉氏尖頭藻XM2藻株cyr基因簇注釋Table 3 The annotation of the genes of the cyr cluster from Raphidiopsis raciborskii XM2

圖3 Raphidiopsis raciborskii AWT205(澳大利亞藻株)[6]、CHAB3438/CHAB358(浙江藻株)[25]與XM2(福建藻株)的cyr基因簇基因結(jié)構(gòu)比較Fig. 3 Comparison of the gene organizations of cyr gene clusters from R. raciborskii AWT205 (Australia) [6],CHAB3438/CHAB358 (Zhejiang Province,China) [25] and XM2 (Fujian Province,China)

3 討論(Discussion)

本研究首次在福建省分離到4株產(chǎn)毒拉氏尖頭藻，通過CYNs合成基因分析和毒素測定證實了其具有產(chǎn)生CYNs的能力。廈門石兜水庫產(chǎn)毒拉氏尖頭藻的細胞形態(tài)基本相同，但是跟其他地區(qū)不同藻株間的藻絲體形態(tài)特征具有一定的差異。廈門藻株平均細胞長度(3.79～4.26 μm)小于澳大利亞分離的拉氏尖頭藻藻株細胞平均長度(5～10 μm)[10]，但廈門藻株藻絲體平均長度(122～199 μm)長于廣東千燈湖藻株(41～78 μm)[28]。

藍藻的同一物種可能包含多種生態(tài)型，它們對環(huán)境變化的多樣化響應(yīng)導致藻株生態(tài)類型的差異[43]。拉氏尖頭藻具有高度的環(huán)境適應(yīng)性，在生理和形態(tài)方面可塑性較高[44]，不同地理位置和不同水體生境可能會造成拉氏尖頭藻生態(tài)類型的變化。福建廈門拉氏尖頭藻藻株具有異形胞，在富含氮的條件下培養(yǎng)一段時間后消失，在澳大利亞藻株和泰國藻株中同樣發(fā)現(xiàn)在氮源充足條件下異形胞消失的概率增加[13,45]。異形胞主要功能為固氮，當水體氮源充足時，異形胞分化基因可能不表達[3,46]。即使在4株廈門藻株藻絲體形態(tài)之間也有輕微的形態(tài)差異，這表明在種群和個體水平上藻株也存在形態(tài)多樣性。

本研究同時使用ELISA試劑盒和LC-MS/MS方法對擬柱胞藻毒素進行定量和定性分析，確定所分離的4株拉氏尖頭藻均為產(chǎn)毒藻株。其中，XM1、XM2和XM3藻株所產(chǎn)毒素以CYN為主，在拉氏尖頭藻對數(shù)生長后期培養(yǎng)液中濃度為0.71～1.02 pg·cell-1；XM4則以deoxy-CYN為主，濃度為0.42 pg·cell-1。目前，我國東南地區(qū)水庫拉氏尖頭藻的檢出率和檢出地區(qū)急劇增加，在研究人員分離的上百株藻株中僅報道4株是產(chǎn)毒株：2012年和2020年浙江省杭州市湘湖分別分離到2株產(chǎn)CYN藻株和1株產(chǎn)CYN藻株，產(chǎn)毒量為1 268～2 637 μg·g-1[27,29]；2017年在廣東省千燈湖分離到1株產(chǎn)deoxy-CYN藻株，產(chǎn)毒量為1 745.19 μg·L-1[28]。遺憾的是，對我國內(nèi)陸水體尖頭藻的多數(shù)研究中并沒有分析檢測CYNs，本研究將我國已知的產(chǎn)毒拉氏尖頭藻純培養(yǎng)藻株擴大到8株。因此，未來的研究中不僅需要關(guān)注拉氏尖頭藻水華，更應(yīng)當重視研究拉氏尖頭藻產(chǎn)毒特性和機理。

早期研究基于16S rRNA基因序列分析可以大致區(qū)分來自不同地理區(qū)域的拉氏尖頭藻藻株[14]，有的研究則將16S rRNA基因與ITS、rpoC1等基因結(jié)合，在更高的分辨率層面評估五大洲拉氏尖頭藻的遺傳變異與種群分化[47]。本研究從16S rRNA基因來看，XM1、XM3和XM4藻株匯聚到亞洲/歐洲進化枝，亞洲和歐洲拉氏尖頭藻藻株之間具有更高的同源性[3,46]，然而大洋洲和美洲的藻株將亞歐進化分枝分為2部分；值得注意的是，XM2藻株與非洲藻株同源性較高。這說明廈門石兜水庫中的拉氏尖頭藻可能存在不同的基因型，遺傳多樣性較高。我們認為可能的解釋有3種：擴散假說、分化假說和擴散分化混合假說。擴散假說可以理解為，石兜水庫不同基因型的拉氏尖頭藻分別來源于不同地方，共存于石兜水庫水體；分化假說可以理解為，石兜水庫不同基因型的拉氏尖頭藻具有同一個來源，是在中國福建當?shù)剡z傳分化的結(jié)果；混合假說可以理解為拉氏尖頭藻物種擴散和遺傳分化同時發(fā)生的結(jié)果，并不能用單一的擴散過程或分化過程解釋。

毫無疑問，拉氏尖頭藻遺傳多樣性是長期演化的產(chǎn)物，較高的遺傳多樣性可能意味著較快的演化速率。在擴散過程中的演化導致了基因型的多樣化，其擴散過程可能是不同環(huán)境需求對其基因型進行選擇的過程[12]。國際上對于拉氏尖頭藻的起源、地理分布和擴散具有不同的解釋，Padisák[44]提出拉氏尖頭藻起源于非洲，隨后擴散到赤道地區(qū)和美洲中部、或者以澳大利亞為中心逐漸向熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)擴散。有研究認為歐洲大陸藻株最有可能起源于亞洲和澳大利亞[3,14]。Gugger等[11]綜合利用16S rRNA基因、ITS、ropC1和nifH基因分析了美洲、歐洲、非洲和澳大利亞的18株尖頭藻，認為更新世冰期時代的干冷氣候?qū)е录忸^藻在美洲和歐洲絕大多數(shù)地區(qū)滅絕，僅有南方少數(shù)溫暖地區(qū)的尖頭藻生存下來，當前美洲和歐洲地區(qū)尖頭藻可能主要來自其南方溫暖區(qū)域株系的擴散。僅僅從16S rRNA基因序列單基因分析，難以判斷廈門拉氏尖頭藻是否來自非洲或者澳大利亞的擴散。從產(chǎn)毒特性方面來看，由于目前在非洲未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)CYNs藻株，因此在廈門發(fā)現(xiàn)的藻株更有可能是由于澳大利亞藻株的擴散所導致的結(jié)果。事實上，候鳥遷徙攜帶拉氏尖頭藻，可能會導致藻株基因型之間的頻繁交換。例如，候鳥在遷徙過程中，其足和喙能夠攜帶拉氏尖頭藻厚壁孢子[48]，在全球候鳥遷飛區(qū)中，中國東部沿海地區(qū)位于東亞-澳大利西亞遷飛區(qū)，在該遷飛區(qū)內(nèi)，每年有數(shù)以千萬計的水鳥在我國東部沿海地區(qū)遷徙過境或中轉(zhuǎn)停歇；涉及到亞洲與非洲的遷飛區(qū)是西亞-東非路線，因此很少有候鳥在非洲和東亞地區(qū)之間遷徙[49]。浙江、福建和廣東均位于東亞-澳大利西亞候鳥遷飛區(qū)，在此遷徙過境和停歇的部分水鳥(特別是數(shù)量眾多的鷸類)在澳大利亞越冬。因此推測近年在浙江和廣東發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)毒藻株可能與候鳥遷徙攜帶藻株的傳播和擴散存在密切關(guān)系。此外，大陸之間往來的運輸、船舶壓載水、熱帶魚的進口和科學樣本的轉(zhuǎn)移等也可能是重要的傳播媒介[50]?？傊＝ㄊ邓畮煨藿ㄓ?0世紀50年代末，至今已有60年的歷史，石兜水庫拉氏尖頭藻的來源十分復雜，可能存在多種途徑，目前的數(shù)據(jù)仍然缺乏對拉氏尖頭藻地理分布、起源擴散的一致性解釋，因此，未來需要全球科學家通力合作，綜合野外觀測、控制實驗和模型模擬等方法進一步深入研究其遺傳多樣性與地理分布之間的關(guān)系，為這一新型水華藍藻防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

廈門拉氏尖頭藻同其他大洲的產(chǎn)毒藻株與無毒藻株聚在一起，進一步說明基于16S rRNA基因難以區(qū)分產(chǎn)毒與無毒藻株，這也暗示CYNs合成基因可能會在藻株之間進行水平轉(zhuǎn)移；或者，在一些拉氏尖頭藻藻株中，由于基因突變和缺失、序列重復和轉(zhuǎn)座子插入等造成CYNs生物合成基因簇中關(guān)鍵基因失活，進而喪失了產(chǎn)毒能力[17,27]。拉氏尖頭藻XM2藻株的cyr基因簇中未發(fā)現(xiàn)cyrN和cyrO基因，這與在浙江杭州分離獲得的CHAB3438/CHAB358藻株cyr基因簇一致[27]。雖然在澳大利亞AWT205藻株cyr基因簇中報道了這2個基因，并推測這2種基因可能在毒素合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有一定的作用[6]，但是由于這2種基因僅在cyr基因簇末端被發(fā)現(xiàn)，且不與基因簇中的其他基因相鄰，所以可能不屬于cyr基因的核心組分[51-52]。值得注意的是，XM2藻株中cyr基因發(fā)生重新排列，與杭州2個CHAB藻株的cyr基因簇排列最為相似，事實上這3株藻株分離地點最近，均位于中國東南。在XM2藻株cyr基因簇內(nèi)呈現(xiàn)重排，可能是在DNA復制過程中發(fā)生了變異，導致基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，使cyrK、cyrJ和cyrH基因從末端被移除，并插入了cyrB所在的位置。這不僅導致了cyr簇基因序列的重排，還導致了cyrB和cyrI基因的分割。另一種假設(shè)認為這些cyr簇基因在進化過程中是相關(guān)的，但可能存在不同的祖先[51]。

綜上所述，福建省廈門市石兜水庫分離到4株拉氏尖頭藻，從細胞形態(tài)和16S rRNA基因序列方面都鑒定為拉氏尖頭藻，不同藻株之間藻細胞相同、但是藻絲體略有差異，在富含氮源的培養(yǎng)條件下異形胞會消失。CYNs合成基因分析、CYNs化學測定表明4株拉氏尖頭藻均可同時產(chǎn)生CYN和deoxy-CYN。16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明廈門拉氏尖頭藻種群遺傳多樣性較高，推測可能是擴散過程和分化過程同時發(fā)生的結(jié)果。此外，福建廈門產(chǎn)毒藻株CYN合成基因簇與浙江杭州產(chǎn)毒藻株基因簇最為相似、高度同源，推測這些產(chǎn)毒藻株可能來自澳大利亞藻株的擴散，與東亞-澳大利西亞遷飛區(qū)候鳥遷徙密切相關(guān)。未來的工作中，我們將結(jié)合多種標記基因和基因組分析對拉氏尖頭藻地理種群的擴散分化進行深入的探討。

拉氏尖頭藻是一類新型水華藍藻，已經(jīng)在我國東南地區(qū)水庫中廣泛分布，能夠在中營養(yǎng)水庫形成藍藻水華，但是尚未引起管理部門和公眾的足夠重視。在氣候變暖背景下水庫型飲用水水源地拉氏尖頭藻監(jiān)測、預(yù)警及其水華防控值得深入研究，特別應(yīng)該加大投入支持研究中國水庫拉氏尖頭藻傳播擴散的生態(tài)過程、生態(tài)機制與生態(tài)效應(yīng)，進而保障飲用水安全。