李先芝，胡 楊，楊 峰，毛瓊麗，劉 洋，朱 艷，石 豪，嚴(yán) 玲

（1.勁牌有限公司，湖北 黃石 435100；2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435100）

我國(guó)是具有濃厚酒文化的國(guó)度，酒類(lèi)產(chǎn)品已成為人們?nèi)粘Ｉ罱煌胁豢苫蛉钡娘嬈?。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展以及人們生活水平的提高，人們的消費(fèi)觀(guān)念正悄然發(fā)生著變化，對(duì)白酒的品質(zhì)要求越來(lái)越高，同時(shí)逐步趨向于健康飲酒。保健酒作為一種具有某些功能特性的露酒，逐步受到廣大消費(fèi)者的青睞，因此保健酒市場(chǎng)已逐步成為保健食品市場(chǎng)的重要分支[1]。

追風(fēng)八珍酒是以清香型白酒為基酒，佐以黃芪、杜仲、五加皮、枸杞、木瓜、黑桑葚、天麻、黃精、肉桂9味藥材，運(yùn)用中醫(yī)理論精制而成的一款具有增強(qiáng)免疫力功效的保健酒。黃芪作為一種常見(jiàn)的滋補(bǔ)類(lèi)中藥備受?chē)?guó)人的推崇。研究表明，黃芪中含有豐富的皂苷類(lèi)[2]、毛蕊異黃酮以及多糖類(lèi)[3-4]，而毛蕊異黃酮作為黃芪中的主要活性成分之一在抗炎[5]、抗氧化[6]、抗癌[7]等方面具有顯著功效。松脂醇二葡萄糖苷是杜仲中含量最豐富的木脂素類(lèi)化合物之一，是杜仲的特征性成分[8]，在降血壓和緩解骨質(zhì)疏松方面具有顯著效果[9-10]。綠原酸、原兒茶酸是一種廣泛分布于植物中的多酚類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、增強(qiáng)免疫力、降血壓降血糖、抑菌等功效[11-16]，已有研究人員在五加皮、枸杞、木瓜、黑桑椹中鑒別出了綠原酸及原兒茶酸[17-20]。巴利森苷A、巴利森苷B是從天麻中分離鑒定出的質(zhì)量標(biāo)志物[21-22]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，巴利森苷類(lèi)成分在神經(jīng)保護(hù)、鎮(zhèn)痛等方面具有顯著效果[23-24]。黃精、肉桂是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用藥材。其中黃精多糖是黃精的主要成分之一[25]，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種作用[26-27]。而肉桂常作為香料使用，在消炎抗菌、抗氧化方面有顯著成效[28-30]。

隨著人們保健意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)保健酒的需求越來(lái)越大，基于此，越來(lái)越多的研究者對(duì)保健酒進(jìn)行了深入的研究[31-33]，但截至目前，同時(shí)檢測(cè)追風(fēng)八珍酒中7種有效成分的文獻(xiàn)尚未報(bào)道。本研究將原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁作為追風(fēng)八珍酒的標(biāo)志性成分，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)追風(fēng)八珍酒中的標(biāo)志性成分進(jìn)行檢測(cè)，為后期生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控及評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5批追風(fēng)八珍酒：由勁牌有限公司提供。

原兒茶酸（批號(hào)110809-201205，含量99.9%）、綠原酸（批號(hào)110753-202018，含量96.1%）、松脂醇二葡萄糖苷（批號(hào)111537-201706，含量91.7%）、蘆?。ㄅ?hào)100080-201610，含量91.9%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；巴利森苷B（批號(hào)B20912，含量98%）、巴利森苷A（批號(hào)B20932，含量98%）、毛蕊異黃酮苷（批號(hào)B20837，含量100%）標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司。

乙腈、磷酸（均為色譜級(jí)）：美國(guó)Fisher公司；甲醇、乙醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000高效液相色譜儀：美國(guó)賽默飛公司；SQP電子分析天平：德國(guó)賽多利斯公司；SK1200H 數(shù)控超聲波清洗儀：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；RE-2002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司；HLB（SelectCore HLB 200 mg 6 mL）固相萃取柱：納譜分析技術(shù)（蘇州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱(chēng)取原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，加體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇溶解，制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 供試品（樣品）預(yù)處理

取酒樣10 mL至茄形瓶中，于50 ℃減壓蒸干，用5 mL水溶解殘?jiān)?，上HLB固相萃取柱，用10 mL水預(yù)洗，去掉洗脫液，再用10 mL體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，于50 ℃減壓蒸干，殘?jiān)皿w積分?jǐn)?shù)50%的甲醇溶液溶解，定容至5 mL。

1.3.3 追風(fēng)八珍酒中7種有效成分的分析檢測(cè)

采用HPLC法分析7種有效成分含量，其色譜條件：色譜柱為Agilent Sb-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫程序見(jiàn)表1；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 有效成分含量的測(cè)定

根據(jù)原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在色譜圖上的保留時(shí)間對(duì)追風(fēng)八珍酒樣品中的原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁成分進(jìn)行定性分析，同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)品濃度與樣品峰面積的比值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到各物質(zhì)的含量。計(jì)算公式如下：

式中：cx為樣品中各有效成分的含量，mg/L；cr為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，mg/L；Ax為樣品峰面積；Ar為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；2為樣品處理過(guò)程濃縮至50%的換算系數(shù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

利用儀器自帶的軟件Chromeleon7用于查看色譜圖、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，利用Excel 2019軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種有效成分測(cè)定

在“1.3.3”項(xiàng)色譜條件下將7種有效成分混合標(biāo)準(zhǔn)品及酒樣進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，7種有效成分混合標(biāo)準(zhǔn)品及酒樣在相同時(shí)間下均有色譜峰出現(xiàn)，表明追風(fēng)八珍酒中含有原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁這7種有效成分。

圖1 追風(fēng)八珍酒7種有效成分標(biāo)準(zhǔn)品（A）及樣品（B）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 7 active ingredients standard (A) and sample (B) of Zhuifeng Bazhen liquor

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線(xiàn)性關(guān)系試驗(yàn)考察

將“1.3.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成5個(gè)不同質(zhì)量濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，按照“1.3.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以物質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），相對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得出線(xiàn)性關(guān)系及范圍，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，各成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均＞0.999，線(xiàn)性回歸方程、線(xiàn)性范圍、檢測(cè)限和定量限結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 追風(fēng)八珍酒7種有效成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程、線(xiàn)性范圍、檢測(cè)限及定量限Table 2 Standard curve regression equation,linear range,limit of detection and limit of quantification of 7 active ingredients of Zhufeng Bazhen liquor

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取同一酒樣，按照1.3.2的方法制備供試品，按1.3.3項(xiàng)下含量檢測(cè)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，7種有效成分原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁峰面積的RSD分別為0.27%、0.35%、0.92%、0.96%、1.26%、0.90%、1.54%，均＜2%，表明該儀器精密度良好。

表3 7種有效成分分析的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision test results of 7 active ingredients analysis

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，檢測(cè)按1.3.3的條件分別于0 h、6 h、14h、19h、24h、29h進(jìn)樣，記錄峰面積，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，7種有效成分原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁峰面積的RSD分別為0.51%、0.42%、1.97%、0.87%、1.28%、0.73%、0.89%，表明供試品溶液中各成分在室溫條件下放置29 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 7種有效成分分析的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Stability test results of 7 active ingredients analysis

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一酒樣，按照1.3.2的方法制備供試品6份，分別按1.3.3的條件進(jìn)行進(jìn)樣，記錄含量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，7種有效成分原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁含量的RSD值分別為0.35%、0.32%、1.74%、1.31%、0.65%、0.66%、1.90%，均＜2%，表明該方法重復(fù)性良好。

表5 7種有效成分分析的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Repeatability test results of 7 active ingredients analysis

2.2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的同一酒樣5 mL至茄形瓶中，分別按照酒樣中各成分含量的低、中、高三個(gè)水平加入適量標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.2的方法制備供試品9份，按1.3.3的條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各成分加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，7種有效成分原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁平均加標(biāo)回收率分別為94.50%、96.33%、95.68%、97.44%、97.56%、97.37%、98.82%。加標(biāo)回收率的RSD分別為1.99%、1.76%、2.39%、1.90%、1.75%、2.67%、2.85%，均＜5%，表明該方法準(zhǔn)確度高。

表6 7種有效成分分析的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Standard recovery rate test results of 7 active ingredients analysis

2.3 樣品含量測(cè)定

取5批次追風(fēng)八珍酒樣品，按照1.3.2的方法制備供試品，分別按1.3.3的條件進(jìn)行進(jìn)樣，計(jì)算各批次追風(fēng)八珍酒樣品中各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，5批次的追風(fēng)八珍酒中原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁含量的RSD均＜2%，表明追風(fēng)八珍酒的生產(chǎn)工藝較穩(wěn)定。

表7 各批次追風(fēng)八珍酒樣品中7種有效成分含量Table 7 Content of 7 active ingredients in each batch of samples of Zhuifeng Bazhen liquor

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC法測(cè)定追風(fēng)八珍酒中原兒茶酸、綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮苷、巴利森苷A、蘆丁的含量，該方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可為后期追風(fēng)八珍酒生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控及評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。