閆統(tǒng)帥，周世水*，秦澤鑫，朱泳沖，郭 波

（1.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東石灣酒廠集團(tuán)股份有限公司，廣東 佛山 528031）

葡萄酒是歷史悠久、種類繁多且酒文化豐厚的高檔餐飲酒之一，富含氨基酸、維生素、有機(jī)酸、酚類和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素[1]，具有延緩衰老、預(yù)防動(dòng)脈硬化和心腦血管疾病等功能[2]。高級(jí)醇是形成葡萄酒醇厚度的重要因素，但也是形成異雜味并導(dǎo)致“上頭”的主要原因[3]，正丙醇、異丁醇和異戊醇是其中主要關(guān)注的雜醇[4]。有研究表明，異丁醇和異戊醇含量過高會(huì)顯著增加酒的苦味和醉度，而正丙醇的苦味閾值較高且醉度不顯著[5-6]，葡萄酒中適度增加正丙醇還會(huì)使酒體醇厚感明顯增強(qiáng)[7]。可見，大幅降低異丁醇、異戊醇含量，提高正丙醇含量，是釀造低苦味、低醉度葡萄酒的可行技術(shù)路線。

發(fā)酵酒中的高級(jí)醇主要來自主發(fā)酵前期酵母的生長(zhǎng)代謝，主要由氨基酸分解[8]和丙酮酸合成[9]兩條代謝途徑生成，BAT2基因編碼的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶控制著氨基酸到高級(jí)醇的轉(zhuǎn)化[10]，多數(shù)研究表明，敲除釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BAT2基因可以有效降低發(fā)酵酒中的異丁醇和異戊醇含量[11-13]。葡萄酒酵母比普通釀酒酵母更適合葡萄酒釀造，而敲掉葡萄酒酵母兩個(gè)BAT2等位基因后，葡萄酒中含量最高的異戊醇并未下降[14]。雙倍體酵母進(jìn)行連續(xù)敲除涉及多次轉(zhuǎn)化比較繁瑣[15]，特別是針對(duì)轉(zhuǎn)化率較低的遺傳操作更為困難，關(guān)于利用雜合單等位基因敲除菌進(jìn)行產(chǎn)孢，分離出不同配型的單倍體敲除菌進(jìn)行融合獲取純合雙等位基因敲除菌的育種方法的研究鮮見報(bào)道。

本研究從一株高產(chǎn)正丙醇的工業(yè)葡萄酒酵母BV-0出發(fā)，通過同源重組并結(jié)合酵母有性生殖的方式構(gòu)建BAT2單、雙等位基因缺失的兩株葡萄酒酵母，并將兩株酵母應(yīng)用于葡萄酒發(fā)酵，通過調(diào)控高級(jí)醇間的比例來降低葡萄酒的苦味和醉度，從菌種選育方面為釀造低醉度、低苦味葡萄酒提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用的菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

ApexHF HS脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶預(yù)混液、DNA凝膠回收試劑盒、GL DNA Marker 5 000：湖南艾科瑞生物科技有限公司；遺傳霉素（G418）、博來霉素、蝸牛酶：北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司；酵母提取粉、蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖、半乳糖、乙酸鉀（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙酸丁酯、丙酮（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；22種白酒標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）：滕州中科普儀器有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基[16]

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母提取粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，固體培養(yǎng)基則需外加2%瓊脂粉。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基：乙酸鉀1%，瓊脂粉2%。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴(kuò)增儀：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司；Tanon EPS 300電泳儀：上海天能科技有限公司；Gel Doc2000凝膠成像分析系統(tǒng)、411BR電轉(zhuǎn)化儀：美國(guó)Bio-Rad公司；5804R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；GC8100氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：滕州中科普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）中釀酒酵母S288C（序列號(hào)：NC_001144.5）的BAT2基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)BAT2-F1/R1、BAT2-F2/R2擴(kuò)增BAT2基因的上下游同源臂用于同源重組，根據(jù)pUG6質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)引物對(duì)loxP-F/R擴(kuò)增KanMX基因作為篩選標(biāo)記，其中l(wèi)oxP-F/R引物兩端引入上下游同源臂部分重疊堿基用于融合PCR獲取敲除組件，同時(shí)設(shè)計(jì)兩端驗(yàn)證引物BAT2-A/D及上下游驗(yàn)證引物B-M和M-B用于轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定，引物序列見表2，交由上海生工有限公司進(jìn)行引物合成。

表2 本研究所用引物序列Table 2 Primer sequences used in the study

1.3.2BAT2基因敲除組件的構(gòu)建

以葡萄酒酵母BV-0基因組和pUG6質(zhì)粒為模板，按表2所列引物分別擴(kuò)增BAT2基因的左、右同源臂和KanMX篩選標(biāo)記，PCR擴(kuò)增體系：無菌水17 μL，模板4 μL，引物對(duì)各2 μL，DNA聚合酶預(yù)混液25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸3 min。根據(jù)擴(kuò)增出的KanMX基因片段兩端與兩同源臂之間重疊的部分堿基，利用融合PCR[17]將三個(gè)片段進(jìn)行連接，并稀釋作為模板，大量擴(kuò)增敲除組件。

1.3.3 電轉(zhuǎn)化

采用電轉(zhuǎn)化[18]將敲除組件導(dǎo)入葡萄酒酵母BV-0中，吸取轉(zhuǎn)化后的菌液200 μL涂布于含有150 μg/mL G418抗生素的YPD平板中，30 ℃條件下倒置培養(yǎng)2 d。

1.3.4BAT2單等位基因敲除菌的驗(yàn)證

挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的轉(zhuǎn)化子于10 μL無菌水的離心管中混勻，95 ℃加熱2 min，立即放入-20 ℃冰箱冷凍10 min，吸取解凍后的菌液1 μL作為模板，采用兩端驗(yàn)證引物和上下游驗(yàn)證引物進(jìn)行PCR（PCR擴(kuò)增體系：無菌水3 μL，模板1 μL，引物對(duì)各0.5 μL，DNA聚合酶預(yù)混液5 μL；PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸3 min。下同），篩選陽(yáng)性克隆，將敲掉一個(gè)BAT2等位基因的葡萄酒酵母命名為BV-bk。

1.3.5 不同配型BAT2單等位基因敲除菌的構(gòu)建

將菌株BV-bk點(diǎn)涂于產(chǎn)孢培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)1～3 d，刮取少量產(chǎn)孢的菌體用2%蝸牛酶進(jìn)行破壁，重懸孢子[16]，并涂布于含有150 μg/mL G418抗生素的YPD平板上，30 ℃條件下倒置培養(yǎng)2 d。按照1.3.4的方法制備PCR的模板，利用配型驗(yàn)證引物確定長(zhǎng)出酵母的配型[19]，并用兩端驗(yàn)證引物進(jìn)一步驗(yàn)證BAT2基因的缺失，獲得BAT2基因缺失的單倍體酵母菌BVa1-bk和BVα2-bk。

1.3.6BAT2雙等位基因敲除菌的融合獲得

取兩種不同配型的BAT2單等位基因敲除菌液各1 mL混合于滅菌的試管中，30 ℃、100 r/min條件下振蕩培養(yǎng)8 h，取10 μL菌液在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合形態(tài)，將觀察到有啞鈴型的酵母融合菌液稀釋10 000倍涂布于YPD平板，30 ℃條件下倒置培養(yǎng)2 d，挑取稍大的單菌落在顯微鏡下觀察，將具有雙倍體形態(tài)的酵母菌落點(diǎn)涂于產(chǎn)孢培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)1～3 d，若能產(chǎn)生孢子則為融合成功的雙倍體酵母，將其命名為BV-BK[20]。

1.3.7KanMX抗性基因的去除

同樣利用電轉(zhuǎn)化將帶有Cre重組酶基因的pSH65質(zhì)粒導(dǎo)入含有抗性標(biāo)記的雙倍體葡萄酒酵母BV-bk和BV-BK中，利用半乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)生Cre重組酶以切除掉兩個(gè)loxP位點(diǎn)間的KanMX抗性基因，再通過影印平板和傳代培養(yǎng)獲得去除抗性標(biāo)記的酵母菌株BV-b和BV-B[21]。

1.3.8 生長(zhǎng)曲線的繪制

取一環(huán)斜面菌種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min條件下活化培養(yǎng)24 h，再將菌液按3%（V/V）的接種量接種到100 mL YPD液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1 h取樣2 mL測(cè)定菌體密度（OD600nm值），以O(shè)D600nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.9 敲除菌在葡萄酒發(fā)酵中的應(yīng)用

將市售玫瑰葡萄用榨汁機(jī)打碎成漿液，取一環(huán)斜面菌種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16 h，再將菌液按1%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接到50 mL YPD液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，最后按3%（V/V）的接種量接種于100 mL葡萄漿液中，18 ℃低溫發(fā)酵7 d，發(fā)酵結(jié)束后用滅菌紗布過濾除去皮渣，將酒液靜置澄清24 h，取上清測(cè)定其理化指標(biāo)和高級(jí)醇含量。

1.3.10 測(cè)定方法

pH值：使用pH計(jì)測(cè)定；殘?zhí)呛浚翰捎?,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定[22]；酸度：采用電位滴定法測(cè)定[23]；酒精度和高級(jí)醇[24-25]：采用氣相色譜法測(cè)定。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad8.02對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理繪圖、SPSS28.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 BAT2基因敲除組件的構(gòu)建

BAT2基因的左、右同源臂、KanMX抗性基因的PCR擴(kuò)增及敲除組件的構(gòu)建結(jié)果見圖1。由圖1可知，從葡萄酒酵母BV-0基因組中成功擴(kuò)增得到BAT2基因的左同源臂（320 bp）和右同源臂（415 bp），從pUG6質(zhì)粒上成功擴(kuò)增得到KanMX抗性基因（1 736 bp），通過融合PCR的方式將三個(gè)片段連接，成功獲得BAT2基因的敲除組件（2 471 bp）。

圖1 BAT2基因的左、右同源臂、KanMX抗性基因的PCR擴(kuò)增及敲除組件的構(gòu)建結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification of left and right homologous arms of BAT2 gene and KanMX resistance gene and construction of knockout components

2.2 BAT2單等位基因敲除菌的驗(yàn)證

兩端驗(yàn)證及上下游驗(yàn)證結(jié)果見圖2。由圖2a可知，所挑選的轉(zhuǎn)化子均只擴(kuò)增出未重組染色體上的BAT2基因（1 870 bp），而經(jīng)過同源重組被敲除組件替換的基因2 600 bp并未被擴(kuò)增，推測(cè)可能是因?yàn)楫?dāng)兩條基因都能PCR擴(kuò)增且長(zhǎng)度差異較大時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅有短的基因，故必須對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行上下游驗(yàn)證。由圖2b可知，經(jīng)過同源重組被敲除組件替換的基因的上游（1 082 bp）和下游（1 551 bp）的分子片段都能被擴(kuò)增，說明葡萄酒酵母BV-0基因組內(nèi)一條染色體的BAT2基因被敲除替換。

圖2 BAT2單等位基因敲除菌BV-bk的兩端驗(yàn)證（a）及上、下游驗(yàn)證（b）結(jié)果Fig.2 Results of two-end verification (a) and upstream and downstream verification (b) of BAT2 monoallelic knockout strain BV-bk

2.3 不同配型BAT2單等位基因敲除菌的分離鑒定

挑取能在G418平板上生長(zhǎng)的BAT2單等位基因敲除菌進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖3a。由圖3a可知，成功分離出了兩種配型的BAT2單等位基因敲除菌，即a型酵母BVa1-bk（544 bp）和α型酵母BVα2-bk（404 bp）。對(duì)分離出的BAT2單等位基因敲除菌進(jìn)行兩端驗(yàn)證，結(jié)果見圖3b。由圖3b可知，成功驗(yàn)證出重組后的基因片段，堿基長(zhǎng)度為2 600 bp，表明兩種不同配型的BAT2單等位基因敲除菌構(gòu)建成功。

圖3 單倍體BAT2基因敲除菌的配型驗(yàn)證（a）及敲除驗(yàn)證（b）結(jié)果Fig.3 Results of match verification (a) and knockout verification (b)of haploid BAT2 gene knockout strain

2.4 BAT2雙等位基因敲除菌的融合獲得

將兩種配型的BAT2單等位基因敲除菌進(jìn)行融合，觀察BAT2單等位基因敲除菌的融合形態(tài)，結(jié)果見圖4a。由圖4a可知，有許多啞鈴型細(xì)胞，表明BAT2單等位基因敲除菌正在融合。挑取融合后重新涂布平板的單菌落，觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果見圖4b。由圖4b可知，酵母細(xì)胞呈圓形或橢圓形、細(xì)胞大而不發(fā)生集聚，具有明顯的雙倍體酵母特征。將具有雙倍體形態(tài)的酵母菌落點(diǎn)涂于產(chǎn)孢培養(yǎng)基，觀察產(chǎn)孢子情況，結(jié)果見圖4c。由圖4c可知，明顯觀察到有孢子產(chǎn)生，證實(shí)等位基因同時(shí)缺失的雙倍體酵母菌株構(gòu)建成功。

圖4 BAT2雙等位基因敲除菌株的融合及驗(yàn)證Fig.4 Fusion and validation of BAT2 biallelic knockout strains

2.5 KanMX抗性基因的去除

采用引物對(duì)BAT2-A/BAT2-D對(duì)影印平板法篩選得到的酵母菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖5。由圖5可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度為1 093 bp，證實(shí)了KanMX抗性基因已成功被誘導(dǎo)表達(dá)出的Cre酶切除。

圖5 KanMX抗性基因去除PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 PCR verification results of KanMX resistance gene removing

2.6 菌株的生長(zhǎng)曲線

出發(fā)菌株BV-0、BAT2單等位基因敲除菌株BV-b和BAT2雙等位基因敲除菌株BV-B的生長(zhǎng)曲線見圖6。由圖6可知，菌株BV-b的生長(zhǎng)速度略微低于出發(fā)菌BV-0，尤其是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較為明顯，但最終都能達(dá)到相同的菌體密度，這可能是BAT2基因的缺失影響了菌株對(duì)支鏈氨基酸的吸收能力[26]，延遲了酵母達(dá)到最大菌密度的時(shí)間。

圖6 出發(fā)菌BV-0和BAT2基因敲除菌株BV-b和BV-B的生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curves of starting strain BV-0 and BAT2 gene knockout strain BV-b and BV-B

2.7 BAT2基因敲除葡萄酒酵母對(duì)葡萄酒的影響

2.7.1BAT2基因敲除葡萄酒酵母對(duì)葡萄酒基本理化指標(biāo)的影響

葡萄酒的基本理化指標(biāo)見表3。由表3可知，除BAT2雙等位基因敲除葡萄酒酵母BV-B發(fā)酵的葡萄酒酒精度略微下降外（P＜0.05），菌種改造并不會(huì)顯著影響葡萄酒的其他各項(xiàng)指標(biāo)（P＞0.05），表明BAT2基因敲除的葡萄酒酵母可以在葡萄酒發(fā)酵中得到應(yīng)用。

表3 葡萄酒基本理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of basic physicochemical indexes of wines

2.7.2BAT2基因敲除葡萄酒酵母對(duì)葡萄酒中高級(jí)醇含量的影響

利用氣相色譜法測(cè)定葡萄酒中的高級(jí)醇，結(jié)果見圖7。

圖7 不同菌種發(fā)酵葡萄酒中高級(jí)醇含量的測(cè)定結(jié)果Fig.7 Determination results of higher alcohols contents in wines fermented by different strains

由圖7可知，與出發(fā)菌株BV-0發(fā)酵的葡萄酒相比，2株BAT2基因敲除菌發(fā)酵的葡萄酒中異丁醇和異戊醇含量都有所下降（P＜0.05），其中菌株BV-b發(fā)酵的葡萄酒中異丁醇含量下降14.9%，異戊醇含量下降17.87%，分別為17.65 mg/L和83.20 mg/L；菌株BV-B發(fā)酵的葡萄酒中異丁醇含量下降67.0%，異戊醇含量下降31.1%，分別為6.85 mg/L和77.80 mg/L。菌株BV-b發(fā)酵的葡萄酒中正丙醇含量變化不顯著（P＞0.05），而菌株BV-B發(fā)酵的葡萄酒中正丙醇含量上升36.55%，為203.15 mg/L（P＜0.05）。此外，兩株BAT2基因敲除菌的總高級(jí)醇含量波動(dòng)幅度較小，均接近適宜的范圍（300 mg/L左右）[4]。

結(jié)果表明，BAT2單等位基因敲除菌株可以小幅度降低葡萄酒中異丁醇和異戊醇的含量（P＜0.05），而正丙醇含量變化不顯著（P＞0.05），這與徐佳等[15]的研究結(jié)果相似，分析原因可能是BAT2基因缺失影響細(xì)胞質(zhì)中支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，從而阻斷纈氨酸和亮氨酸到異丁醇和異戊醇的轉(zhuǎn)化，但由于等位基因的存在導(dǎo)致降低幅度較小。BAT2雙等位基因敲除菌株發(fā)酵使葡萄酒中的異丁醇和異戊醇含量降低幅度較大（P＜0.05），且正丙醇也有大幅增加（P＜0.05），與張艷英等[21]的研究結(jié)果相似，這可能是因?yàn)榘被岱纸馔緩绞茏韬笤鰪?qiáng)了丙酮酸合成途徑對(duì)高級(jí)醇的貢獻(xiàn)，但由于蘇氨酸到正丙醇間的轉(zhuǎn)氨酶不由BAT2基因控制，因此導(dǎo)致了代謝流到正丙醇的增加[4，27]。

本研究所用的葡萄酒酵母BV-0在發(fā)酵中會(huì)產(chǎn)生較高的正丙醇，這可能與酵母的特性有關(guān)，不同的葡萄酒酵母產(chǎn)生的高級(jí)醇有較大差異[28-29]，這種差異可能與轉(zhuǎn)氨酶活性有關(guān)[30]。有研究表明，正丙醇的苦味和醉度遠(yuǎn)小于異丁醇和異戊醇[5-6]，但目前發(fā)酵的葡萄酒正丙醇含量普遍低，異丁醇和異戊醇含量高[31]，本研究構(gòu)建的BAT2雙等位基因敲除葡萄酒酵母可以有效調(diào)節(jié)高級(jí)醇間的比例，能在不影響葡萄酒醇厚度的同時(shí)降低其苦味和醉度。

3 結(jié)論

本研究通過融合PCR構(gòu)建敲除組件，電轉(zhuǎn)化到葡萄酒酵母BV-0中構(gòu)建BAT2單等位基因敲除菌BV-b，然后利用雙倍體酵母產(chǎn)孢到融合的有性生殖特性構(gòu)建了BAT2雙等位基因敲除菌BV-B。將兩株敲除菌應(yīng)用于葡萄酒發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與出發(fā)菌株BV-0釀造的葡萄酒相比，菌株BV-b、BV-B所釀造葡萄酒的基本理化指標(biāo)基本一致，而異丁醇含量分別下降14.9%、67.0%，異戊醇含量分別下降17.87%、31.1%。此外，菌株BV-B不僅對(duì)異丁醇和異戊醇的降低幅度較大，而且使正丙醇含量也提升了36.55%，從而在不影響葡萄酒醇厚度的同時(shí)降低其苦味和醉度，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。