石 馨，惠 明，*，田 青，黃繼紅

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.工業(yè)微生物菌種保藏與選育河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001）

異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）是Wickerhamomyces屬的微生物，有研究表明該酵母對白酒釀造過程中的酯類合成有促進(jìn)作用，尤其是己酸乙酯、乙酸乙酯等白酒中重要的酯類物質(zhì)[1-2]。濃香型白酒以高粱為主要原料，使用高溫曲或中溫曲作為糖化發(fā)酵劑，采用混蒸工藝釀造[3-4]，其酒體香氣以酯香為主，各酯類物質(zhì)的含量及比例對白酒酒體的風(fēng)格形成起著至關(guān)重要的作用[5-6]。

己酸乙酯作為濃香型白酒的主體香，其在酒體中的含量、閾值，決定了濃香型白酒的品質(zhì)[7-8]，其獨(dú)特的香氣與大量微生物的自發(fā)固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)和微生物間復(fù)雜的相互作用密切相關(guān)[9]。目前，已有不少學(xué)者利用有特殊功能的菌株人工強(qiáng)化接種于白酒的固態(tài)發(fā)酵，使白酒的品質(zhì)得到改善。王松等[10]將產(chǎn)香酵母長孢洛德酵母（Lodderomyces elongis porus）Z9Y-91人工強(qiáng)化接種于復(fù)糟酒生產(chǎn)，結(jié)果表明，該酵母可以提高復(fù)糟酒產(chǎn)量，改善復(fù)糟酒品質(zhì)；劉小改等[11]將一株產(chǎn)酯酵母應(yīng)用于白酒的固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)添加產(chǎn)酯酵母生產(chǎn)的原酒中酯類含量是對照組的1.5倍，同時(shí)原酒口感品質(zhì)得到明顯改善。

本研究選用前期從大曲中分離的一株具有產(chǎn)酯能力的異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y-1為實(shí)驗(yàn)菌株，將其應(yīng)用于模擬濃香型白酒的固態(tài)發(fā)酵，考察其對酒醅理化性質(zhì)、微生物結(jié)構(gòu)及發(fā)酵結(jié)束時(shí)風(fēng)味成分的影響，為其在濃香型白酒的應(yīng)用中提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及大曲

異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y-1：由工業(yè)微生物菌種保藏與選育河南省工程實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏；生香活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；中高溫大曲：宋河酒業(yè)股份有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

2-辛醇（色譜純）、玉米淀粉（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；酵母膏、蛋白胨（均為分析純）：北京奧博星生物技術(shù)公司；KH2PO4、（NH4）2SO4、MgSO4、CaCl2（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

產(chǎn)酯培養(yǎng)基[12]：酵母膏10 g/L、NH4Cl 0.210 g/L、玉米淀粉2.9 g/L、蛋白胨20 g/L、（NH4）2SO40.1 g/L、KH2PO40.1 g/L、MgSO410 g/L、CaCl20.1 g/L。121 ℃滅菌200 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：上海瑞楚生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace 1300-ISQ 7000氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀：賽默飛世爾科技公司；固相微萃取裝置（固相微萃取手柄、Supelco 57328-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭）：江蘇默克儀器有限公司；ZHJH-C1112C超凈工作臺、ZQZY-CS全溫恒溫培養(yǎng)搖床、ZXSD-A1160恒溫培養(yǎng)箱：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

高粱→粉碎→浸泡→蒸糧→加水揚(yáng)冷→酵母＋大曲→入壇發(fā)酵→蒸餾→白酒

操作要點(diǎn)：以濃香型白酒釀造工藝為基礎(chǔ)釀造白酒[13]。稱取高粱45 kg，用粉碎機(jī)粉碎成2～3瓣，加入原料糧總質(zhì)量70%的熱水進(jìn)行浸泡，每隔6 h翻拌一次，浸泡24 h。浸泡結(jié)束后平鋪上鍋蒸煮80 min，將蒸好的高粱攤平晾涼，并加入原料糧總質(zhì)量30%的涼水，拌勻后平均分成三等份，分別向原料中添加大曲和活化的微生物。發(fā)酵采用壇子發(fā)酵：1號壇中添加1.8 kg的中高溫大曲＋原料糧總質(zhì)量2%的蒸餾水（空白組）；2號壇中添加1.8 kg的中高溫大曲＋原料糧總質(zhì)量2%的安琪酵母種子液（活菌數(shù)為1×106CFU/mL）（安琪酵母組）；3號壇中添加1.8 kg的中高溫大曲+原料糧總質(zhì)量2%的Wickerhamomyces anomalusY-1種子液（活菌數(shù)為1×106CFU/mL）（異常威克漢姆酵母Y-1組），拌勻后將壇子密封自然發(fā)酵30 d，經(jīng)蒸餾得到白酒。

1.3.2 酒醅理化指標(biāo)及微生物動態(tài)監(jiān)測

每隔5 d分別從壇子的上層、中層及下層取酒醅，將其混合均勻后參考標(biāo)準(zhǔn)DB34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》對酒醅進(jìn)行前處理，參考文獻(xiàn)[14]測定酒醅的pH值、水分、還原糖、淀粉和酸度；參考文獻(xiàn)[15]對微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定酒醅中的揮發(fā)性風(fēng)味成分。

頂空固相微萃取條件：稱取酒醅樣品2 g于150 mL的三角瓶內(nèi)，向瓶內(nèi)加入30 mL飽和食鹽水，用移液槍準(zhǔn)確加入5 μL 2-辛醇（內(nèi)標(biāo)液，0.072 g/L），放入一顆磁力攪拌轉(zhuǎn)子，用保鮮膜將瓶口密封。插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭，纖維頭置于三角瓶上部空間，50 ℃平衡10 min，平衡結(jié)束后120 r/min萃取50 min，萃取結(jié)束后取出手柄，直接進(jìn)行GC-MS分析。

氣相色譜及質(zhì)譜條件：參考文獻(xiàn)[16]。

定性定量方法：將檢測到的物質(zhì)與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）11譜庫進(jìn)行比對定性，采用內(nèi)標(biāo)法半定量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有理化指標(biāo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，使用NIST11質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)比對，使用SPSS Statistics 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅理化指標(biāo)的動態(tài)變化

發(fā)酵過程中酒醅理化指標(biāo)的檢測結(jié)果見圖1。

酒醅中酵母繁殖需要水分，糖化、發(fā)酵都以水分為媒介[17]。在發(fā)酵過程中，如果水分不斷增加，則說明酒醅發(fā)酵越正常，越徹底[18]。由圖1a可知，接種異常威克漢姆酵母Y-1組的酒醅在發(fā)酵結(jié)束時(shí)水分含量最高，達(dá)到75%，明顯高于其他兩組。分析主要原因可能是在發(fā)酵中后期酒醅內(nèi)生成大量水，菌株Y-1能夠充分利用酒醅中的營養(yǎng)物質(zhì)，提高了酒醅微生物整體的代謝能力。在乙醇發(fā)酵階段，代謝產(chǎn)生醇、酸、酯等化合物的時(shí)候，水也會伴隨生成，間接說明菌株Y-1可以使酒醅產(chǎn)生更多化合物。酒醅的pH值對原酒的品質(zhì)有著重要影響，酸是形成白酒諸多風(fēng)味物質(zhì)的前體物[19]。由圖1b可知，接種異常威克漢姆酵母Y-1酒醅的pH值呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，其他兩組的pH值在臨近發(fā)酵結(jié)束時(shí)緩慢上升，由圖1c可知，發(fā)酵結(jié)束時(shí)添加異常威克漢姆酵母Y-1組的酒醅酸度最高，一定程度上反映了異常威克漢姆酵母Y-1對有機(jī)酸的生成有一定促進(jìn)作用。

圖1 酒醅發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of physicochemical indexes during fermented grains fermentation

淀粉是白酒發(fā)酵的基礎(chǔ)，由于酒醅生酸、雜菌繁殖等原因，使酒醅中淀粉含量逐漸下降[20]。酒醅發(fā)酵過程中，還原糖的變化能夠微妙反映發(fā)酵過程中的協(xié)調(diào)程度[21]。由圖1d和圖1e可知，發(fā)酵過程中，酒醅中的淀粉和還原糖含量整體都呈下降趨勢，分析原因可能是還原糖作為整個(gè)發(fā)酵過程中的主要碳源，隨著微生物的生長代謝，最終被消耗完全，淀粉也持續(xù)降解。空白組酒醅還原糖含量下降1.5%，淀粉含量下降2.1%，安琪酵母組酒醅還原糖含量下降1.5%、淀粉含量下降1.9%，異常威克漢姆酵母Y-1組酒醅還原糖含量下降1.9%，淀粉含量下降2.3%，最終還原糖含量僅為1.8%，淀粉含量僅為5.2%，與安琪酵母相比，異常威克漢姆酵母Y-1可以提高發(fā)酵過程中淀粉及還原糖的轉(zhuǎn)化率。在發(fā)酵過程中，異常威克漢姆酵母Y-1組的還原糖和淀粉的含量都處在酵母可以利用的低水平狀態(tài)，酵母菌首先充分利用酒醅中殘留的還原糖進(jìn)行發(fā)酵，然后再利用淀粉，淀粉糖化形成的糖能夠被酵母利用并轉(zhuǎn)化成乙醇，不會累積在酒醅中。由此可見，接種Wickerhamomyces anomalusY-1可以促進(jìn)微生物菌群對酒醅整體的代謝利用水平提升，改善酒醅的內(nèi)部環(huán)境。

2.2 酒醅微生物群落的動態(tài)變化

微生物是白酒發(fā)酵過程中最重要的生物因子，也是白酒風(fēng)味形成的關(guān)鍵，發(fā)酵過程中菌落演替和結(jié)構(gòu)變化會使酒醅中的風(fēng)味物質(zhì)組成發(fā)生改變，引起乙醇到乙酸再到酯類等一系列的變化，最終使白酒風(fēng)味也發(fā)生變化[22]。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，酒醅中各個(gè)成分的改變，微生物的生存環(huán)境也隨之變化，各類菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量也會有相應(yīng)改變，最終具有生長優(yōu)勢的菌群將會穩(wěn)定存在于酒醅中繼續(xù)發(fā)酵，進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)的代謝和積累[23]。發(fā)酵過程中，酒醅中的酵母菌、霉菌和細(xì)菌的動態(tài)變化見圖2。

圖2 酒醅發(fā)酵過程中微生物群落的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of microbial community during fermented grains fermentation

酵母菌作為酒精代謝的核心功能菌群之一，對白酒釀造過程中的產(chǎn)香產(chǎn)酯也發(fā)揮著特有貢獻(xiàn)[24]。由圖2a可知，3組酒醅中的酵母菌落數(shù)均呈先快速升高后緩慢下降的趨勢，且均在發(fā)酵第10天時(shí)達(dá)到最高值。發(fā)酵過程中，異常威克漢姆酵母Y-1組酒醅的酵母數(shù)量最高，大量酵母存活，說明異常威克漢姆酵母Y-1組酒醅中乙醇在持續(xù)生成，接種異常威克漢姆酵母Y-1后可適當(dāng)通過延長發(fā)酵時(shí)間來提高出酒率。霉菌和細(xì)菌對白酒的品質(zhì)也至關(guān)重要[25]。由圖2b和2c可知，3組酒醅中的霉菌和細(xì)菌菌落數(shù)均呈先升高后下降的趨勢，且均在發(fā)酵第10天時(shí)達(dá)到最高值。其中接種異常威克漢姆酵母Y-1組的霉菌和細(xì)菌數(shù)量最低，分析原因可能是，發(fā)酵初期大曲中存在的霉菌、細(xì)菌開始緩慢增長，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酵母菌的數(shù)量增多，霉菌和細(xì)菌的生長受到抑制。說明異常威克漢姆酵母的添加對霉菌、細(xì)菌的生長有一定抑制作用，酵母生長的越旺盛，對霉菌和細(xì)菌的抑制越明顯。這也表明菌株異常威克漢姆酵母Y-1的接種量并不是越大越好，過大的接種量可能對酒醅菌群生態(tài)產(chǎn)生較大影響。

2.3 酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析的GC-MS總離子流色譜圖見圖3，分析結(jié)果見表1。

由圖3及表1可知，從3組酒醅中共檢測出52種揮發(fā)性物質(zhì)，包括23種酯類、10種醇類、6種揮發(fā)性酸類、6種酚類、7種其他化合物。3組酒醅中所檢測到的主要物質(zhì)有丁酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、異戊醇、異辛醇、異丁醇、丙醇、乙酸、己酸、辛酸，異常威克漢姆酵母Y-1組中特有的風(fēng)味物質(zhì)為愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚等，這些風(fēng)味物質(zhì)對濃香型白酒的風(fēng)味有著重要的影響[26]。

圖3 不同組酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatograms of flavor components in fermented grains of different groups analyzed by GC-MS

由表1亦可知，空白組、安琪酵母組和異常威克漢姆酵母Y-1組酒醅中酯類物質(zhì)的含量分別為1 143.45 mg/kg、1 587.35 mg/kg、3 066.99 mg/kg。己酸乙酯為濃香型白酒的主要香味成分，具有菠蘿香、味甜[27]。優(yōu)質(zhì)濃香型白酒中己酸乙酯的含量要求占總酯含量的40%以上，空白組酒醅中己酸乙酯含量只占總酯含量的32.2%，而接種異常威克漢姆酵母Y-1組酒醅中己酸乙酯含量占總酯含量的54.8%，達(dá)到了優(yōu)質(zhì)濃香型白酒的要求。相較于其他兩組，異常威克漢姆酵母Y-1組酒醅中的己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯等酯類物質(zhì)顯著提升（P＜0.05），這些酯類物質(zhì)都具有獨(dú)特的氣味，會使白酒風(fēng)味更加突出、協(xié)調(diào)，具有層次感。

表1 不同組酒醅揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 1 Results of flavor substances in fermented grains of different groups analyzed by GC-MS

續(xù)表

空白組、安琪酵母組和異常威克漢姆酵母Y-1組酒醅中醇類物質(zhì)的含量分別為706.64 mg/kg、1 350.49 mg/kg、1 731.61 mg/kg。醇類物質(zhì)使白酒的香氣與味道緊密相連，普遍沸點(diǎn)較低，易揮發(fā)，在白酒中起著助香劑的作用，醇也構(gòu)成了白酒一部分味覺的骨架，在白酒中呈甜味，醇類含量過低會缺乏白酒傳統(tǒng)風(fēng)味，含量過高則會導(dǎo)致酒的澀味增大，還會引起頭疼、易醉等現(xiàn)象[28]。安琪酵母組和異常威克漢姆酵母Y-1組中的異戊醇含量明顯高于空白組（P＜0.05），說明生香酵母對異戊醇的提高較為明顯。異常威克漢姆酵母Y-1組中苯乙醇含量是空白組的3.37倍，是安琪酵母組的1.86倍，安琪酵母雖對苯乙醇含量也有一定的提升作用，但是異常威克漢姆酵母Y-1菌株相較安琪酵母更加突出。研究表明[29]，異常威克漢姆酵母具有較強(qiáng)的產(chǎn)苯乙醇能力，苯乙醇的存在可使白酒香氣具有清甜玫瑰氣味，使成品酒余味甘甜、清香。

空白組、安琪酵母組和異常威克漢姆酵母Y-1組酒醅中揮發(fā)性酸類物質(zhì)的含量分別為111.97 mg/kg、36.45 mg/kg、54.37 mg/kg，3組酒醅間相差較小，說明接種異常威克漢姆酵母Y-1并不會直接造成揮發(fā)性酸類物質(zhì)含量的明顯改變，影響白酒口感。白酒中酸的含量因等級、批次不同而各異，但是白酒中的酸度過高或過低都會影響白酒品質(zhì)，酸味過大會導(dǎo)致酒味粗糙，入口尖酸，酸味過小會使合成風(fēng)味物質(zhì)的前體較少，導(dǎo)致風(fēng)味較差，適量的酸可以使白酒風(fēng)味協(xié)調(diào)，并且起到一定的緩沖作用[30]。

除酯、醇、酸三類白酒中的主要物質(zhì)之外，在異常威克漢姆酵母Y-1組中還檢測到愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚3種有益風(fēng)味因子，愈創(chuàng)木酚具有抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)人體免疫力的作用[31]，這幾種化合物的感官特征具有類似藥草及煙熏風(fēng)味，雖然含量甚微，但在一定程度上也豐富了酒體的口感，使成品酒風(fēng)味更加飽滿[32]，除此之外，還檢測出烷類、吡嗪類等化合物。

3 結(jié)論

本研究以自然發(fā)酵和添加安琪酵母發(fā)酵為對照組，以前期篩選出的一株異常威克漢姆酵母Y-1為出發(fā)菌株，將其應(yīng)用于濃香型白酒的模擬固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，添加Wickerhamomyces anomalusY-1可以明顯提升微生物菌群對酒醅整體的代謝利用水平，改善酒醅內(nèi)部環(huán)境。同時(shí)，酒醅中主要風(fēng)味成分含量明顯增加。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，與其他兩組相比，異常威克漢姆酵母Y-1組酒醅水分及酸度更高，淀粉和還原糖的利用更加徹底；酵母數(shù)量最多，霉菌和細(xì)菌數(shù)量最少；酯類（3 066.99 mg/kg）及醇類物質(zhì)的含量（1 731.61 mg/kg）顯著提高（P＜0.05），尤其是己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、L-乳酸乙酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、苯乙醇、異戊醇、2,3,5,6-四甲基吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)，此外，在異常威克漢姆酵母Y-1組還檢測到愈創(chuàng)木酚等有益因子。本研究初步證實(shí)了Wickerhamomyces anomalusY-1可以明顯提高濃香型白酒酒醅產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的水平，具備提升固態(tài)濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的潛力，但尚需要在后續(xù)中試生產(chǎn)中作進(jìn)一步的驗(yàn)證研究。