王春瑩，屈耀寧，喬 煒，劉靜靜，胡穎輝

乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B virus e antigen，HBeAg)陽性的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是全球性公共衛(wèi)生問題[1]。抗病毒治療可有效抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復制，明顯減輕肝組織損害程度，其中恩替卡韋因病毒抑制能力強等優(yōu)點，是目前HBeAg陽性的CHB患者治療的一線用藥[2，3]。但也存在治療早期應答率不滿意和用藥療程長等問題。如何早期精準預測其治療療效是目前研究的重點課題[4]。研究發(fā)現(xiàn)，HBV共價閉合環(huán)狀 DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是HBV前基因組 RNA(progenomic RNA，pgRNA)復制的模板，因可轉(zhuǎn)錄成大小不同的mRNA，并翻譯為蛋白質(zhì)，在HBV復制過程中有重要的臨床意義[5，6]。近期研究指出，HBV cccDNA半衰期長、不易降解，可在肝細胞內(nèi)長期存在，嚴重影響了臨床抗病毒治療的療效且增加了復發(fā)的風險。HBV pgRNA在感染肝細胞時，形成病毒顆粒釋放入血，可反映HBV cccDNA的存在狀態(tài)[7，8]?；谏鲜霰尘?，本研究應用恩替卡韋治療了89例CHB患者，并檢測了血清HBV cccDNA和pgRNA水平變化，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018年1月～2020年1月我院收治的HBeAg陽性CHB患者89例，男性53例，女性36例；年齡為28～42歲，平均年齡為(35.6±6.5)歲。符合相關(guān)指南的診斷標準[9]。納入標準：HBeAg陽性，且持續(xù)時間≥6個月，血清HBV DNA定量大于2×104IU/mL，血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase，ALT)水平持續(xù)/反復增高，肝組織學檢查存在肝炎病變，入組前未接受過抗病毒治療。排除標準：合并其他嗜肝病毒感染、肝癌或失代償期肝病、合并自身免疫性肝炎或酒精性肝炎、藥物性肝損傷、重要器官疾病、脂肪性肝炎。本研究已經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審核通過，患者簽署知情同意書。

1.2 治療方法 給予所有入組患者恩替卡韋分散片【蘇州東瑞制藥有限公司，國藥準字H20100129】0.5 mg口服，1次/d，連續(xù)治療觀察48 w。

1.3 血清ALT、HBsAg和HBeAg水平檢測 使用德國西門子公司提供的ADVIA2400生化分析儀檢測血清ALT；使用美國雅培公司提供的Architect i2000型化學發(fā)光免疫分析儀檢測血清HBsAg和HBeAg水平。

1.4 血清HBV DNA、HBV cccDNA和HBV pgRNA水平檢測 應用核酸提取純化試劑(廣州海力特生物科技有限公司)提取血清總RNA。應用cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Science，Waltham)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用熒光定量PCR法檢測血清HBV DNA(上海科華生物工程有限公司)；使用Roche公司提供的COOBAS TAQMAN和COBAS Amliprep系統(tǒng)和采用熒光定量PCR法檢測血清HBV cccDNA和HBV pgRNA水平(南京建邦錦源醫(yī)療科技有限公司提供)。

1.5 療效評估 根據(jù)指南[9]，病毒學應答：血清HBV DNA 載量較基線下降≥2 lgIU/mL或<500 IU/mL；生化學應答：血清ALT水平降至40 U/L一下水平；血清學應答：血清HBeAg陰轉(zhuǎn)，未伴抗HBeAg出現(xiàn)。同時出現(xiàn)病毒學和生化學應答者為完全應答。

2 結(jié)果

2.1 抗病毒治療臨床結(jié)局 89例HBeAg陽性CHB患者經(jīng)恩替卡韋治療48 w后，獲得病毒學應答85例(95.5%)，生化學應答80例(89.9%)，血清學應答9例(10.1%)；獲得完全應答75例(84.3%)。

2.2 兩組血生化、血清和病毒學指標比較 入組時，完全應答組血清ALT水平顯著高于，而血清HBsAg、HBeAg、HBV cccDNA和HBV pgRNA水平顯著低于非完全應答組(P<0.05，表1)。

表1 兩組血生化、血清和病毒學指標比較

2.3 各指標預測CHB患者抗病毒療效的ROC曲線分析 經(jīng)ROC曲線分析提示血清HBV cccDNA聯(lián)合HBV pgRNA檢測CHB患者抗病毒治療后獲得完全應答的療效價值較高，優(yōu)于血清HBsAg 或HBeAg檢測(表2、圖1)。

表2 兩項聯(lián)合預測患者療效的ROC曲線分析

圖1 各指標預測CHB患者療效的ROC曲線

3 討論

本研究在89例HBeAg陽性CHB患者經(jīng)恩替卡韋治療48 w 后，84.3%獲得完全應答，95.5%獲得病毒學應答，89.9%為生化學應答，10.1%為血清學應答，其中獲得CR者較有關(guān)報道[10,11]高，提示恩替卡韋治療HBeAg陽性CHB患者有較好的療效。以往研究多借助于血清HBV DNA定量及HBeAg水平變化對CHB患者的抗病毒療效進行預估，但這些指標的預測價值受到了挑戰(zhàn)[12]。探尋更為有效的預測標志物以及時調(diào)整HBeAg陽性CHB患者的抗病毒治療方案，對改善患者預后有十分重要的臨床意義。

HBV cccDNA作為HBV復制的初始模板，是HBV感染最早能檢測到的復制中間體。研究證實HBV cccDNA可與細胞內(nèi)核蛋白結(jié)合形成微染色體，穩(wěn)定存在于肝細胞核內(nèi)，可精準地反映HBV的復制狀態(tài)[13]。HBV cccDNA半衰期長且不易降解，是病毒持續(xù)復制的根源，也是CHB患者抗病毒治療失敗的影響因素之一。研究發(fā)現(xiàn)HBV cccDNA可利用RNA轉(zhuǎn)錄酶生成pgRNA，而HBV pgRNA可翻譯為多種病毒蛋白，在病毒DNA序列上含有全部遺傳信息，進入細胞漿內(nèi)的病毒核心顆粒在DNA聚合酶的作用下被反轉(zhuǎn)錄為子代DNA負鏈[14，15]，由此推測HBV cccDNA和HBV pgRNA相互作用，共同參與了HBV發(fā)病進程。

早期有學者研究認為肝組織內(nèi)檢測不到HBV cccDNA可作為CHB患者抗病毒治療的最佳終點[16]，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)應用核苷類抗病毒治療停止后CHB患者出現(xiàn)耐藥和復發(fā)的風險較高[17]。文獻報道指出，當肝組織處于炎癥活動狀態(tài)和肝細胞出現(xiàn)變性壞死時，肝內(nèi)HBV cccDNA被釋放入血液[18]，而PCR熒光探針法等技術(shù)的應用使得CHB患者血清HBV cccDNA和HBV pgRNA精準檢測成為可能，這也是本項研究開展應用血清HBV cccDNA和HBV pgRNA水平預測HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者在恩替卡韋治療后療效預測價值研究的主要依據(jù)。本結(jié)果顯示完全應答組血清HBeAg、HBV cccDNA和HBV pgRNA水平顯著低于非完全應答組，提示恩替卡韋治療前CHB患者血清HBV cccDNA和HBV pgRNA水平低者，可能獲得較好的療效，提示在HBeAg陽性CHB患者抗病毒治療前和治療期間定期監(jiān)測血清HBV cccDNA和HBV pgRNA水平是十分必要的。恩替卡韋等核苷(酸)類似物在治療CHB患者過程中可通過影響 HBV 聚合酶，抑制 HBV pgRNA 逆轉(zhuǎn)錄成 rcDNA，導致新病毒顆粒形成減少，而逐步耗竭HBV cccDNA并減少HBV pgRNA生成，但仍無法阻止新感染的病毒形成HBV cccDNA[19]，這也是長期應用核苷(酸)類似物抗病毒治療易出現(xiàn)耐藥且停藥后易復發(fā)的原因。

此外，本研究結(jié)果顯示血清HBV cccDNA和HBV pgRNA聯(lián)合檢測預測HBeAg陽性CHB患者在接受恩替卡韋抗病毒治療后療效的AUC為0.888，其靈敏性和特異性較單一項目檢測高，提示這一病毒學檢測技術(shù)的應用將具有一定的臨床意義。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)定量檢測血清HBV cccDNA水平可精準地評估CHB患者在接受抗病毒治療后的療效[20，21]。本研究也同時發(fā)現(xiàn)檢測血清HBsAg和HBeAg水平預測HBeAg陽性CHB患者抗病毒治療療效的效能，但兩者單項檢測預測的價值并不高。當然，檢測血清HBsAg和HBeAg水平發(fā)現(xiàn)，在治療前它們的水平太高的患者可能很難獲得理想的血清學應答或完全應答。但病毒學檢測發(fā)現(xiàn)，當血清HBV cccDNA≤2.5 copies/mL或HBV pgRNA≤5.0 copies/mL時，預示患者在恩替卡韋治療后獲得完全應答的幾率較高，這些結(jié)果或可為HBeAg陽性CHB患者在抗病毒前預測療效提供幫助。

綜上所述，本研究采用最新的檢測手段檢測了血清HBV cccDNA和HBV pgRNA水平，并分析了兩者聯(lián)合檢測預測HBeAg陽性CHB患者在恩替卡韋治療后療效的價值，結(jié)果是令人滿意的。兩種病毒學指標的檢測優(yōu)于檢測常規(guī)的血清學指標，或許因為后者的血清變動范圍太大，定量檢測的方法也很難標化等原因。但檢測血清病毒學指標，尤其是這些新指標，同樣存在試劑標準化的挑戰(zhàn)，還可能由于機體排毒的動態(tài)變化，也可造成檢測結(jié)果很難精確的問題。這些都需要在以后的研究中予以闡明。