劉寧利，桑 潔

(1.西北大學(xué)附屬西安市第三醫(yī)院普外科，陜西 西安 710016；2.西安市第五醫(yī)院普外科，陜西 西安 710082)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是來源于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的分化型甲狀腺癌，是甲狀腺惡性腫瘤中最常見的病理類型，占甲狀腺惡性腫瘤總發(fā)生率的70%～90%，其惡性度較低，生長緩慢，患者預(yù)后良好，但仍有約10%的患者術(shù)后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[1-3]。近年來，基于分子靶標(biāo)機(jī)制的探究為人類腫瘤的研究及攻克提供了方向及思路，已成為目前癌癥研究的熱點(diǎn)。因此，積極探尋更多與PTC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物分子標(biāo)志物對其臨床診治具有重要意義。叉頭框蛋白Q1(forkhead box O1，F(xiàn)OXQ1)是FOX家族成員，其作為核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、代謝及細(xì)胞周期等生物學(xué)過程，參與腫瘤的侵襲和遷移，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)是蛋白質(zhì)激酶家族成員，其通過與細(xì)胞周期蛋白的結(jié)合來發(fā)揮作用，是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵酶，其過表達(dá)或抑制因子缺失可引起細(xì)胞周期紊亂、細(xì)胞增殖失控，是惡性腫瘤的重要特征之一[7-9]。研究證實(shí)，F(xiàn)OXQ1與CDK4在人類多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后密切相關(guān)[6,9]，因此，本研究通過檢測FOXQ1與CDK4在PTC組織中的表達(dá)，進(jìn)一步探討FOXQ1和CDK4表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為PTC的臨床診治及患者預(yù)后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性選擇2017年5月至2021年1月在西北大學(xué)附屬西安市第三醫(yī)院普外科行手術(shù)切除的110例PTC患者，收集PTC組織及癌旁組織(距PTC組織邊緣1.5～2.0 cm)，患者均有明確的病理學(xué)診斷結(jié)果，術(shù)前未接受相關(guān)放化療及新輔助治療，無惡性腫瘤病史，未合并其他惡性腫瘤，病歷資料及隨訪資料完整。收集入組患者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及包膜侵犯情況等。本研究獲得西北大學(xué)附屬西安市第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(審批號2017-036)。

1.2 主要試劑

兔抗人CDK4和鼠抗人FOXQ1單克隆抗體購自英國Abcam公司；BCA試劑盒、蛋白裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色劑、抗原修復(fù)液及磷酸鹽緩沖液均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化染色法檢測FOXQ1和CDK4蛋白表達(dá)

取新鮮PTC組織進(jìn)行研磨、勻漿處理，10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，以3 μm厚度連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%過氧化氫溶液孵育15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；pH 6.0枸櫞酸緩沖液高壓鍋抗原修復(fù)，室溫冷卻，加入1 mol/L 緩沖鹽溶液清除抗原修復(fù)液，5%山羊血清室溫封閉30 min；滴加一抗FOXQ1單克隆抗體(稀釋比例為1∶150)、CDK4單克隆抗體(稀釋比例為1∶200)覆蓋組織，37 ℃孵育過夜；次日滴加山羊抗IgG二抗(稀釋比例為1∶2 000)，室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次；每張切片滴加DAB溶液200 μL行DAB顯色，蘇木素復(fù)染3 min，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片，鏡下觀察拍照。

1.4 結(jié)果判讀

每張切片隨機(jī)取6個(gè)400倍鏡下視野，結(jié)果取平均值。通過陽性染色細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度值進(jìn)行計(jì)分，陽性染色細(xì)胞百分比：≤5%，6%～25%，26%～50%，51%～75%，>75%，依次記為0～4分；染色強(qiáng)度：無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色，依次記為0～3分。兩項(xiàng)計(jì)分相乘所得總分為免疫組化評分，>3分記為陽性，≤3分記為陰性。

1.5 隨訪

采用門診復(fù)查或電話等方式進(jìn)行隨訪，觀察并統(tǒng)計(jì)患者術(shù)后復(fù)發(fā)、生存情況，以隨訪截止時(shí)間2021年5月或死亡作為觀察終點(diǎn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，F(xiàn)OXQ1和CDK4蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)；K-M生存曲線分析患者術(shù)后生存率，采用Log-rank檢驗(yàn)；Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)分析PTC組織中FOXQ1和CDK4蛋白表達(dá)的相關(guān)性；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織中FOXQ1和CDK4蛋白表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，F(xiàn)OXQ1和CDK4蛋白表達(dá)陽性染色主要定位在細(xì)胞核或細(xì)胞漿，見圖1。PTC組織中FOXQ1蛋白的陽性表達(dá)率為64.5%(71/110)，高于癌旁組織中FOXQ1蛋白的陽性表達(dá)率33.6%(37/110)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.025，P=0.000)；PTC組織中CDK4蛋白的陽性表達(dá)率為54.5%(60/110)，高于癌旁組織中CDK4蛋白的陽性表達(dá)率7.3%(8/110)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=57.554，P=0.000)。

a：FOXQ1蛋白表達(dá)；b：CDK4蛋白表達(dá)

2.2 FOXQ1和CDK4蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

FOXQ1和CDK4蛋白在PTC組織中的表達(dá)與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P<0.05)；而與患者年齡、性別、腫瘤直徑及包膜侵犯情況等無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 FOXQ1和CDK4蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 FOXQ1和CDK4蛋白表達(dá)與PTC預(yù)后的關(guān)系

截止2021年5月，隨訪時(shí)間4～49個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為31個(gè)月，其中3例(2.7%)失訪。K-M生存曲線顯示，F(xiàn)OXQ1陽性表達(dá)患者的無進(jìn)展生存率為80.3%(57/71)，與FOXQ1陰性表達(dá)患者的無進(jìn)展生存率89.7%(35/39)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=1.702，P=0.192)；CDK4陽性表達(dá)患者的無進(jìn)展生存率為78.3%(47/60)，與CDK4陰性表達(dá)患者的無進(jìn)展生存率88.0%(44/50)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=1.939，P=0.164)，見圖2。

a：FOXQ1的表達(dá)與PTC患者預(yù)后的生存曲線；b：CDK4的表達(dá)與PTC患者預(yù)后的生存曲線

2.4 PTC組織中FOXQ1和CDK4蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)顯示，F(xiàn)OXQ1和CDK4蛋白在PTC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.545，P=0.000)，見表2。

表2 相關(guān)性分析

3 討論

PTC是最常見的內(nèi)分泌癌，總體預(yù)后良好，但少數(shù)低分化、間變性或某些特殊組織類型的PTC患者預(yù)后較差，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，易對放射性碘治療產(chǎn)生抵抗性[10]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OX轉(zhuǎn)錄家族可參與胚胎發(fā)育、調(diào)控細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤的發(fā)生，通過與DNA結(jié)合能夠激活或抑制目的基因轉(zhuǎn)錄，參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控和新陳代謝，在成熟的組織器官及生物體發(fā)育中具有重要作用[11]。FOXQ1是FOX轉(zhuǎn)錄家族的一員，位于人類第6號染色體6p25.3[12]。FOXQ1與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。崔曉海等[13]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中FOXQ1表達(dá)與腫瘤TNM分期、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，其高表達(dá)患者預(yù)后更差；劉湘鄂等[14]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXQ1在前列腺組織中陽性表達(dá)率較高，與疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。Weng等[15]研究顯示，敲低FOXQ1可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，可作為評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)可賦予腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力，有研究表明，F(xiàn)OXQ1可通過介導(dǎo)EMT從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[16]。沉默F(xiàn)OXQ1可通過調(diào)控TGF-β1信號通路逆轉(zhuǎn)PTC細(xì)胞的EMT，從而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[17]。本研究結(jié)果顯示，PTC組織中FOXQ1蛋白陽性表達(dá)率較高，尤其是腫瘤TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，提示FOXQ1高表達(dá)能夠促進(jìn)PTC的發(fā)生發(fā)展及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移，可能通過介導(dǎo)細(xì)胞EMT進(jìn)而發(fā)揮作用；預(yù)后隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXQ1陽性表達(dá)患者術(shù)后無進(jìn)展生存率低于陰性表達(dá)患者，但組間差異未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與張中超等[18]的研究報(bào)道中FOXQ1表達(dá)與PTC患者預(yù)后關(guān)系密切不一致，可能是因?yàn)椴糠只颊唠S訪時(shí)間較短，到隨訪截止仍未出現(xiàn)疾病進(jìn)展，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)不完全，導(dǎo)致研究結(jié)果偏倚，故FOXQ1表達(dá)對PTC患者預(yù)后生存的影響還需繼續(xù)探究。結(jié)合既往研究分析可知，F(xiàn)OXQ1是重要的腫瘤分子生物標(biāo)志物，可將其作為預(yù)測PTC疾病進(jìn)展及治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

CDK4蛋白屬于細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)家族中的一員，其與細(xì)胞周期蛋白D1結(jié)合形成復(fù)合體，可介導(dǎo)驅(qū)動細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究證實(shí)，CDK4與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，抑制其表達(dá)能夠使細(xì)胞周期阻滯在G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[19]。且有研究發(fā)現(xiàn)，CDK4表達(dá)與腫瘤臨床特征及患者預(yù)后顯著相關(guān)，如王彩瑩等[20]研究報(bào)道，直腸癌組織中CDK4蛋白高表達(dá)與組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。非小細(xì)胞肺癌中CDK4蛋白表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，表明CDK4蛋白與非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移、侵襲有關(guān)[21]。CDK4蛋白過表達(dá)是影響骨肉瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素[22]，表明CDK4是一個(gè)重要的腫瘤基因。近年腫瘤分子靶標(biāo)治療的研究發(fā)現(xiàn)，靶向CDK4/6是治療惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)[23]。CDK4/6抑制劑palbociclib可能在甲狀腺癌的治療中起到重要作用[24]。CDK4/6抑制劑ribociclib可降低甲狀腺癌中CDK4蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在間期，抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖[25]，CDK4可能是PTC的研究靶標(biāo)。而本研究發(fā)現(xiàn)PTC組織中CDK4蛋白顯著陽性高表達(dá)亦與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤TNM分期有關(guān)，與邱麗湞等[26]的研究報(bào)道一致，提示CDK4可能參與了PTC的浸潤轉(zhuǎn)移及惡性進(jìn)展，也可將CDK4作為PTC發(fā)生及治療的靶標(biāo)；術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)，CDK4陽性表達(dá)患者無進(jìn)展生存率低于陰性表達(dá)患者，但組間亦無明顯差異，故CDK4表達(dá)對PTC患者預(yù)后生存的影響仍需繼續(xù)探究。

另外本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXQ1和CDK4蛋白在PTC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示二者在PTC的發(fā)生發(fā)展中可能起到協(xié)同作用，推測FOXQ1可能通過正向調(diào)控CDK4表達(dá)來影響細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，進(jìn)而參與PTC的發(fā)生發(fā)展，然其更具體的調(diào)控作用還需通過細(xì)胞分子學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，PTC組織中FOXQ1和CDK4蛋白呈正相關(guān)性陽性高表達(dá)，與PTC患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，可能參與PTC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。