張雪林，王 松，田曉翠，董 志，劉海林

(1.重慶兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，重慶 401121；2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016 )

腦卒中是導(dǎo)致人類殘疾和死亡的主要原因之一，急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)約占腦卒中的80%[1]。AIS是一種常見且嚴(yán)重的神經(jīng)損傷性疾病，一旦發(fā)生缺血、缺氧可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，血流再灌注后，可進(jìn)一步加劇損傷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及壽命[2]。盡管國內(nèi)外學(xué)者們針對(duì)AIS進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)、臨床研究，但是目前仍無能夠顯著改善該疾病不良預(yù)后的神經(jīng)保護(hù)藥物。因此，尋找新的、安全有效的治療該疾病的藥物非常有必要。

細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞程序性死亡的一種，與氧糖剝奪/再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)損傷密切相關(guān)。有研究表明，OGD/R后興奮性氨基酸釋放、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥、鈣超載等均可通過激活線粒體途徑、死亡受體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑促進(jìn)下游細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白Caspase-3表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡[3]。C-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase，MAPK)家族中的重要成員之一，其較廣泛地參與神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的發(fā)生、發(fā)展，在神經(jīng)元的凋亡、壞死、炎癥等相關(guān)信號(hào)通路中有著非常重要的作用[4]。有研究表明，在全腦缺血再灌注損傷模型中，磷酸化JNK的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的水平明顯增加，而使用JNK的特異性抑制劑能明顯降低病灶部位細(xì)胞凋亡水平[5-6]。這些研究提示，JNK相關(guān)信號(hào)通路激活可能與OGD/R誘發(fā)的凋亡密切相關(guān)。被激活的JNK可磷酸化C-Jun等多種底物[7]，通過調(diào)節(jié)促凋亡因子BCL及凋亡執(zhí)行關(guān)鍵蛋白半胱氨酸蛋白酶Caspase-3的表達(dá)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。

貝沙羅汀是一種被美國FDA批準(zhǔn)用于治療皮膚淋巴瘤的新型化學(xué)藥物，具有分子量較小、脂溶性較高、易透過血腦屏障等優(yōu)點(diǎn)。貝沙羅汀可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。研究顯示，貝沙羅汀有利于阿爾茲海默病模型小鼠神經(jīng)功能障礙的恢復(fù)[8]，可促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷模型小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)[9]。但目前關(guān)于貝沙羅汀對(duì)OGD/R體外模型神經(jīng)元保護(hù)作用的研究較為缺乏。本研究使用小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22構(gòu)建OGD/R模型，觀察貝沙羅汀對(duì)HT22的保護(hù)作用，同時(shí)觀察貝沙羅汀對(duì)凋亡關(guān)鍵蛋白P-JNK、P-C-Jun、Bax、BCL-2及Cleaved-Caspase-3的影響，以探索貝沙羅汀對(duì)OGD/R損傷保護(hù)作用的新靶點(diǎn)、新機(jī)制，為尋找新的、安全有效的治療AIS的藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

HT22由重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM無糖培養(yǎng)基、opti-MEM Ⅰ培養(yǎng)基及胰酶均購自美國Gibco公司，Triton X-100購自北京索萊寶科技有限公司，β-actin兔多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)公司。JNK、P-JNK、P-C-Jun、Cleaved-Caspase-3兔來源單克隆抗體均購自美國CST公司，BCA蛋白定量試劑盒、JNK特異性抑制劑(SP600125)購自北京碧云天科技公司。光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司，恒溫電熱水浴鍋購自上海醫(yī)療器械七廠，超凈工作臺(tái)SW-CJ-ID型購自蘇州凈化公司，倒置顯微鏡DMI3000B型購自德國Leica公司，多功能成像系統(tǒng)購自法國Vilber公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HT22培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、75%N2、含1%雙抗和10%胎牛血清的培養(yǎng)基中。取對(duì)數(shù)生長期的HT22，使用0.25%胰酶消化，按照5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，用于后續(xù)研究。

1.3 OGD/R模型的建立及分組

取對(duì)數(shù)生長期的HT22，待貼壁生長后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)液，使用PBS洗滌細(xì)胞3次后更換為DMEM無糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，將細(xì)胞置于預(yù)先設(shè)置好的厭氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待氧濃度降至1%開始計(jì)時(shí)，2 h后將DMEM無糖培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，并重新置于常氧恒溫培養(yǎng)箱中復(fù)氧再灌注24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分成對(duì)照組(Control組)、模型組(OGD/R組)、藥物干預(yù)組(OGD/R+Bex組)、SP組(OGD/R+SP組)及藥物干預(yù)合并SP組(OGD/R+Bex+SP組)。對(duì)照組不做任何處理，藥物干預(yù)組在OGD/R前后給與9 μmol·L-1的貝沙羅汀干預(yù)，SP組在OGD/R前后給與SP600125(25 μmol·L-1)干預(yù)，藥物干預(yù)合并SP組在OGD/R前后同時(shí)給與貝沙羅汀及SP600125干預(yù)。

1.4 HT22活性測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長期的HT22以5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，加或不加不同濃度(0.1～81 μmol·L-1)的貝沙羅汀干預(yù)，每孔加入預(yù)先配制好的MTT(5 mg·mL-1)溶液20 μL，在正常或OGD/R環(huán)境中處理，倒掉含MTT溶液的培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO溶液，水平搖床放置10 min，充分溶解已形成的結(jié)晶。用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平

OGD/R后，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，以1 000 r/min室溫離心5 min，棄去上清，收集離心管底部的細(xì)胞沉淀。加入PBS，輕輕吹打使其均勻分散，以1 000 r/min室溫離心5 min，重復(fù)上述步驟2次，將細(xì)胞清洗干凈。棄去離心后的上清液，再次加入適量PBS吹散細(xì)胞進(jìn)行重懸，轉(zhuǎn)移至新的EP管送流式細(xì)胞儀中檢測(cè)，定量分析細(xì)胞凋亡水平。

1.6 HT22形態(tài)學(xué)觀察

取出鋪于6孔板中的各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)。

1.7 Western blot測(cè)定相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取出鋪于6孔板中的各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗，使用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解(每孔200 μL)，置于冰面20 min，小心收集于2 mL離心管中并置于冷凍離心機(jī)中，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，將上清液小心移至新的EP管中，提取總蛋白，總蛋白濃度采用BCA法測(cè)定。每孔上樣30 μg后接通電源，濃縮膠恒壓90 V、30 min，分離膠恒壓120 V電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)染料接近分離膠底部時(shí)終止電泳。按照目標(biāo)蛋白分子量切膠，將轉(zhuǎn)膜夾黑面置平，在上面依次墊海綿墊、濾紙、膠、甲醇活化的PVDF膜、濾紙、海綿墊，夾緊后放入含有轉(zhuǎn)膜液的轉(zhuǎn)膜槽中，接通電源，冰浴下恒流210 mA轉(zhuǎn)膜40 min，5%胎牛血清室溫封閉2 h，棄去封閉液，用TBST洗滌5 min，重復(fù)3次，加入稀釋好的一抗：P-JNK(1∶1 000)、P-C-Jun(1∶1 000)、BCL-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Cleaved-Caspase-3(1∶1 000)、β-actin(1∶3 000)，置于4 ℃冰箱中孵育過夜?；厥找豢?，TBST洗滌3次，每次5 min，加入抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min。濾紙吸去PVDF膜上的TBST，滴加適量的ECL工作液，置于Bio-Rad成像分析儀內(nèi)曝光顯影，用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 貝沙羅汀對(duì)HT22生存率的影響

在正常環(huán)境中，不同濃度(0.1～9 μmol·L-1)的貝沙羅汀對(duì)HT22的生長不會(huì)產(chǎn)生抑制作用；當(dāng)濃度為27～81 μmol·L-1時(shí)，HT22的生存率顯著降低(P<0.05)。在OGD/R環(huán)境下，HT22的生存率較正常環(huán)境低：給與不同濃度(0.1～9 μmol·L-1)的貝沙羅汀干預(yù)后，HT22的生存率呈濃度依賴性上升趨勢(shì)；當(dāng)貝沙羅汀濃度為27～81 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞生存率顯著降低(P<0.05)，見圖1。因此，本研究選擇9 μmol·L-1貝沙羅汀用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

*:與正常環(huán)境組27 μmol·L-1相比，P<0.05；#：與OGD/R環(huán)境組27 μmol·L-1相比，P<0.05

2.2 OGD/R損傷促進(jìn)HT22凋亡

Control組的HT22凋亡較少；與Control組相比，OGD/R組的HT22凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD/R組相比，OGD/R+Bex組、OGD/R+Bex+SP組、OGD/R+SP組的細(xì)胞凋亡率降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

*：與Control組相比，P<0.05；#：與OGD/R組相比，P<0.05

2.3 貝沙羅汀對(duì)OGD/R后HT22形態(tài)的影響

Control組HT22貼壁牢固，胞體完整，細(xì)胞緊密連接成網(wǎng)絡(luò)；而HT22經(jīng)OGD/R處理后，可見細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胞體皺縮，細(xì)胞之間連接稀疏。貝沙羅汀干預(yù)后，OGD/R導(dǎo)致的HT22損傷明顯改善(圖3)。

圖3 貝沙羅汀對(duì)OGD/R后HT22形態(tài)的影響(×200)

2.4 貝沙羅汀對(duì)OGD/R后HT22中P-JNK、P-C-Jun蛋白表達(dá)的影響

與Control組相比，OGD/R組P-JNK、P-C-Jun蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與OGD/R組相比，OGD/R+Bex組、OGD/R+Bex+SP組、OGD/R+SP組P-JNK、P-C-Jun蛋白表達(dá)水平顯著下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

*：與Control組相比，P<0.05；#：與OGD/R組相比，P<0.05

2.5 貝沙羅汀對(duì)OGD/R后HT22中Bax、BCL-2及Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與Control組相比，OGD/R組促凋亡蛋白Bax及凋亡關(guān)鍵執(zhí)行蛋白Cleaved-Caspase-3表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，抑制凋亡蛋白BCL-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與OGD/R組相比，OGD/R+Bex組、OGD/R+Bex+SP組、OGD/R+SP組Bax及Cleaved-Caspase-3表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，BCL-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖5。

*：與Control組相比，P<0.05；#：與OGD/R組相比，P<0.05

3 討論

AIS是一種發(fā)病率高、致殘率高、病死率高、復(fù)發(fā)率高以及并發(fā)癥較多的疾病，目前最有效的治療方法是治療窗內(nèi)給予血管再通治療[10]。但血液復(fù)流后，缺血部會(huì)發(fā)生再灌注損傷，不僅不能使組織、器官功能恢復(fù)，反而會(huì)加重組織、器官的功能障礙，該損傷涉及細(xì)胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激等多種病理生理過程，目前臨床上尚無確切的藥物能有效逆轉(zhuǎn)上述損傷[11-12]。

貝沙羅汀是一種新型的合成維甲酸類似物，其可以選擇性地與維甲酸類X受體(RXR)亞單位(RXRa、RXRb、RXRg)結(jié)合從而發(fā)揮多種生理功能：如誘導(dǎo)一些惡性腫瘤細(xì)胞系的程序化死亡；抑制人鱗細(xì)胞腫瘤的異種移植等，已被美國FDA批準(zhǔn)用于治療皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤。貝沙羅汀對(duì)于HT22 OGD/R損傷的保護(hù)作用的研究較少，我們前期的研究表明，貝沙羅汀對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元具有保護(hù)作用，但缺乏體外的機(jī)制研究[13]。因此，我們建立了OGD/R模型，研究貝沙羅汀對(duì)HT22的保護(hù)作用，并探索貝沙羅汀對(duì)OGD/R損傷保護(hù)作用的新靶點(diǎn)、新機(jī)制，為尋找安全有效的治療AIS的藥物提供重要理論依據(jù)。

細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞變圓，與周圍細(xì)胞分離，細(xì)胞質(zhì)皺縮，包膜內(nèi)陷使細(xì)胞分裂成凋亡小體。為了證實(shí)貝沙羅汀可有效減少或逆轉(zhuǎn)AIS引起的病灶部位細(xì)胞凋亡，本研究建立了OGD/R模型，結(jié)果表明，OGD/R組的HT22生存率較正常環(huán)境組明顯降低，說明氧糖剝奪2 h再灌注24 h形成的OGD/R模型是成功的；而經(jīng)過貝沙羅汀治療后，HT22的生存率均有不同程度的升高，且呈劑量依賴性趨勢(shì)；在光學(xué)顯微鏡下可見細(xì)胞損傷程度也有所降低，表明貝沙羅汀對(duì)OGD/R引起的HT22損傷具有一定的保護(hù)作用。因此，深入探討貝沙羅汀對(duì)神經(jīng)元的損傷機(jī)制對(duì)于治療AIS等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有重要意義。

JNK又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶，是MAPK信號(hào)通路的一個(gè)重要分子，在細(xì)胞周期、增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用[14-15]。本研究結(jié)果表明，在OGD/R模型中，使用貝沙羅汀干預(yù)可明顯抑制HT22中JNK信號(hào)通路激活，減少HT22凋亡。BCL-2家族是重要的凋亡調(diào)控因子，AIS后由于缺血等刺激使Bax易位至線粒體并增強(qiáng)線粒體膜通透性，從而釋放細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子，引發(fā)細(xì)胞凋亡，而BCL-2則通過穩(wěn)定線粒體膜電位和阻止細(xì)胞色素C釋放抑制細(xì)胞凋亡?？沟蛲龅鞍譈CL-2和促凋亡蛋白Bax之間的平衡決定細(xì)胞的存活或死亡。本研究結(jié)果顯示，OGD/R后Bax表達(dá)水平顯著升高，BCL-2表達(dá)水平下降，說明OGD/R后細(xì)胞凋亡顯著增加；貝沙羅汀治療后，Bax表達(dá)水平降低，BCL-2表達(dá)水平升高，說明貝沙羅汀可通過增加BCL-2/Bax比值，減少HT22凋亡。Caspase家族對(duì)凋亡有重要的調(diào)控作用，腦出血再灌注后經(jīng)線粒體通路激活Caspase-9，經(jīng)死亡受體通路激活Caspase-8，Caspase-8和Caspase-9均可誘導(dǎo)pro-Caspase-3裂解，產(chǎn)生具有活性的凋亡終末剪切酶Cleaved-Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，OGD/R后Cleaved-Caspase-3表達(dá)水平顯著上升，而貝沙羅汀可通過降低該酶表達(dá)減少HT22凋亡。

本研究在體外觀察到貝沙羅汀能顯著提升OGD/R后HT22的生存率，降低HT22的凋亡水平，減輕HT22的損傷，其機(jī)制可能是通過抑制JNK/Caspase-3相關(guān)信號(hào)通路激活，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但本研究為體外研究，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。