肝癌的發(fā)病誘因與遺傳、飲酒、飲食、寄生蟲和病毒性肝炎有關(guān)，早期無特異性癥狀，當(dāng)出現(xiàn)明顯肝區(qū)疼痛、發(fā)熱等臨床癥狀時(shí)，大部分患者已確診為肝癌中晚期

。肝癌的治療主要涉及手術(shù)切除、血管介入、射頻消融和中藥治療等，雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在肝癌治療方面表現(xiàn)較好的控制效果，但依舊存在術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后較差情況

。中藥對(duì)惡性腫瘤的治療作用日益凸顯，蛇床子是具有祛風(fēng)燥濕、溫腎壯陽的傳統(tǒng)中藥，蛇床子素是蛇床子活性成分之一，有研究表明蛇床子素具有抗炎、抗心率失常、抗腫瘤和改善缺血再灌注損傷功效

，但其相關(guān)作用機(jī)制仍未完全闡明。本研究觀察蛇床子素對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的抑制作用并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人肝癌HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)上海細(xì)胞研究所，將肝癌HepG2細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)、37℃、5% CO

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行隔天換液，取第3代細(xì)胞用于研究。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3～4周齡雌性BALB/c裸鼠，60只，體重12～15 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)SCXK(粵)2016-0041，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房，溫度26～28℃，濕度40%～60%，人工光照12 h/晝、12 h/夜，自由飲水進(jìn)食。嚴(yán)格遵守3R原則。

1.2 主要試劑 蛇床子素購自上海源葉生物科技有限公司；MTT試劑盒購自中國上海易匯生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；結(jié)晶紫染液購自美國Sigma公司；RNAprep pure細(xì)胞試劑盒、Reverse Transcriptase Kit購自中國天根生化科技北京有限公司；2×HSYBR qPCR Mix購自中國北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Matrigel膠購于美國Clontrch公司；Cyclin D1、Cyclin B、CDK1、Bcl-2、Bax、cleaved PARP、E-cadhein、N-cadherin、vimentin、p-JAK和p-STAT3抗體購自武漢益普生物科技有限公司；cleaved caspase-3抗體購自愛必信(上海)生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 實(shí)時(shí)定量PCR儀(LightCycler? 96)購自中國羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司；熒光顯微鏡(DFM-60D)購自中國上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；冷凍離心機(jī)(Selectspin

17R)購自美國Select BioProducts公司；Transwell小室購自北京索萊寶科技有限公司；CO

培養(yǎng)箱購自日本SanYo公司；多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax iD3)購自美國Molecular Devices公司；流式細(xì)胞儀(Aurora 3L-5L)購自美國Cytek Biosciences公司。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 將人肝癌HepG2細(xì)胞以每孔3×10

個(gè)接種于96孔板，孵育12 h后，給予不同濃度蛇床子素(0、10、20、40、80、160、320 μmol/L)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μl DMSO作用30 min，在570 nm波長測(cè)量光密度值，細(xì)胞活力計(jì)算公式=(實(shí)驗(yàn)組光密度值/對(duì)照組光密度值)×100%。不同處理組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

當(dāng)代陶藝是指藝術(shù)家運(yùn)用陶瓷材料，突破原有的傳統(tǒng)陶瓷精致的古典審美情趣，來表達(dá)現(xiàn)代人理想、個(gè)性、情感、心理、意識(shí)和審美價(jià)值的作品形式。

1.5 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn) 將人肝癌HepG2細(xì)胞以每孔1 000個(gè)接種于6孔板，孵育12 h后，加入蛇床子素使其最終濃度分別為0、40、80、160 μmol/L，每組5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)2周，多聚甲醛固定15 min，使用結(jié)晶紫染色30 min，沖洗，統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞的克隆形成數(shù)目，克隆形成率計(jì)算公式=(實(shí)驗(yàn)組克隆形成數(shù)目/對(duì)照組克隆形成數(shù)目)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 同1.4方式處理人肝癌HepG2細(xì)胞，收集不同濃度(0、40、80、160 μmol/L)蛇床子素處理48 h細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞沉淀，300 μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V/FITC和10 μl PI混合均勻，室溫避光孵育15 min，上樣流式細(xì)胞儀，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。不同處理組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.黨的全體黨員。黨員是黨的機(jī)體的組成部分，每一個(gè)黨員要強(qiáng)化角色意識(shí)，始終牢記黨員身份，自覺踐行入黨誓詞，用黨員標(biāo)準(zhǔn)和條件要求自己，忠實(shí)履行黨員義務(wù)，增強(qiáng)黨性修養(yǎng)，主動(dòng)接受組織生活的檢驗(yàn)，清除思想上的灰塵，保持黨員的先進(jìn)性。同時(shí)，要把在黨言黨、在黨憂黨、在黨為黨、在黨愛黨落實(shí)到日常工作生活之中，自覺維護(hù)黨和人民的利益，敢于同違反黨內(nèi)政治生活的現(xiàn)象作斗爭(zhēng)。習(xí)近平同志指出：“嚴(yán)肅黨內(nèi)政治生活是每個(gè)黨員、干部的事?！盵1]

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠涂Transwell上室，收集同1.4方式處理人肝癌HepG2細(xì)胞[蛇床子素(0、40、80、160 μmol/L)處理48 h]，給予細(xì)胞蛋白酶消化，將細(xì)胞懸液加入無血清培養(yǎng)基的Transwell小室(1×10

個(gè))，下室加入500 μl完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，37℃、5% CO

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使用4%多聚甲醛固定附著在膜下表面細(xì)胞20 min，結(jié)晶紫染色5 min，隨機(jī)5個(gè)不重疊視野，統(tǒng)計(jì)單個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)目并以均值作為該組的單個(gè)視野細(xì)胞侵襲數(shù)目。

2.4 4組HepG2細(xì)胞凋亡及幾種蛋白表達(dá)量 見圖5、圖6。

——6月24日，江西宣傳部副部長、史學(xué)博士陳東有，以《金瓶梅的社會(huì)文化現(xiàn)象》為主題開了一場(chǎng)講演。陳東有認(rèn)為。

2.3 4組HepG2細(xì)胞Cyclin D1、Cyclin B和CDK1的mRNA水平及蛋白表達(dá)量檢測(cè)情況 見圖3、圖4。

2.2 4組HepG2細(xì)克隆情況 見圖2。

1.10 蛇床子素干預(yù)體內(nèi)移植瘤 將60只BALB/c雌性裸鼠均左前肢腋下皮下注射100 μl肝癌HepG2細(xì)胞(1×10

/ml)，注射5 d后，隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組和蛇床子素組，每組30只。蛇床子素組裸鼠腹腔注射蛇床子素30 mg/kg

，每2天注射1次；對(duì)照組裸鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。從HepG2細(xì)胞皮下注射日開始計(jì)算，統(tǒng)計(jì)30 d后移植瘤重量和體積，并取生長30 d的移植瘤組織用于western blot檢測(cè)p-JAK/JAK和p-STAT3/STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量，操作方法同1.8。

2.5 4組HepG2細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)結(jié)果 見圖7、圖8。蛇床子素(40、80、160 μmol/L)處理肝癌HepG2細(xì)胞侵襲數(shù)目均顯著低于對(duì)照組(

<0.05)，而N-cadherin和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(

<0.05)，E-cadhein蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(

<0.05)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，使用

-

(

-

)對(duì)定量數(shù)據(jù)的正態(tài)分布進(jìn)行檢驗(yàn)，兩組間比較使用

檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05(雙尾)，作圖軟件為GraphPad Prism 5.0。

1.9 qRT-PCR檢測(cè) 使用RNAprep pure細(xì)胞試劑盒提取細(xì)胞總RNA、Reverse Transcriptase Kit逆轉(zhuǎn)錄生成第一條鏈cDNA，2×HSYBR qPCR Mix用于qRT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)Cyclin D1、Cyclin B、CDK1 mRNA水平，以β-actin作為內(nèi)參基因，mRNA水平以熒光閾值循環(huán)數(shù)(Ct)值輸出，然后Livak與Schmittgen的2

公式計(jì)算待測(cè)基因mRNA水平。qRT-PCR擴(kuò)增參數(shù)為95℃預(yù)變形3 min，95℃變形10 s，59℃退火30 s，72℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。引物，：β-actin，前引物5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′、后引物5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′；Cyclin D1，前引物5′-CCCTCGGTGTCCTACTTCA-3′、后引物5′-CTCCTCGCACTTCTGTTCCT-3′； Cyclin B，前引物5′-GCCAATAAGGAGGGAGCAGT-3′、后引物5′-ACCTACACCCAGCAGAAACC-3′；CDK1，前引物5′-TAGCGCGG ATCTACCATACC-3′、后引物5′-CATGGCTACCACTTGACCTGT-3′。所用引物均由生工生物工程上海股份有限公司設(shè)計(jì)合成。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度蛇床子素作用不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響 見圖1。

(2)改革工藝，減少產(chǎn)塵量。選煤廠適當(dāng)提高入選上限，減少煤的破碎量，或適當(dāng)調(diào)整破碎機(jī)的工藝參數(shù)，盡量減少過粉碎，均可大大減少煤塵數(shù)量。

當(dāng)然，由于爵位高、加官多，霸府行臺(tái)首長至少有兩個(gè)以上的開府，宇文泰任霸府行臺(tái)時(shí)以周惠達(dá)為大行臺(tái)尚書和大將軍府司馬就是明證。其中霸府行臺(tái)就是行臺(tái)首長的行臺(tái)開府，主要幫助首長處理軍政事務(wù)，在霸府行臺(tái)首長的開府中最能體現(xiàn)“霸府”性質(zhì)。

1.8 western blot檢測(cè) 蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度，使用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，然后SDS-PAGE分離，將30 μg蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜、室溫密封2 h，洗膜并加一抗(Cyclin D1、Cyclin B、CDK1、Bcl-2、Bax、cleaved PARP、cleaved caspase-3、E-cadhein、N-cadherin、vimentin、p-JAK、JAK、p-STAT3、STAT3、GAPDH，1∶500)4℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗40 min，然后加入HRP標(biāo)記二抗(1∶500)，37℃孵育2 h，ECL顯色，收集條帶影像。

從分析結(jié)果(見圖4)來看：側(cè)壁厚度越接近主壁厚，翹曲變形量越小。整體厚度趨近一致，收縮相對(duì)均勻，因此翹曲變形量相對(duì)較小。

2.6 4組HepG2細(xì)胞P-JAK和P-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)情況 見圖9。

2.7 兩組HepG2細(xì)胞移植瘤生長情況 見圖10。

2.8 兩組HepG2細(xì)胞p-JAK/JAK和p-STA3/STAT3蛋白表達(dá)情況 見圖11。

3 討論

肝癌是發(fā)病率位居第7、死亡率位居第4的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國每年原發(fā)性肝癌新增46.6萬人，占全世界肝癌新增病例一半以上，我國死于肝癌的患者約44.4萬人/年，接近全世界因肝癌病逝人數(shù)的一半

。蛇床子素為蛇床子中的烴基香豆素，具有多種生物藥用活性，可抑制乳腺癌進(jìn)展、抗角膜新生血管生成、預(yù)防神經(jīng)退行性疾病以及改善肺動(dòng)脈高壓等功效

。

本研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度蛇床子素可降低肝癌HepG2細(xì)胞的克隆形成率，說明蛇床子素可抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，而細(xì)胞增殖在腫瘤組織擴(kuò)大過程中發(fā)揮重要作用，其中調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜，主要有細(xì)胞周期相關(guān)基因、蛋白參與調(diào)控。本研究結(jié)果顯示適當(dāng)濃度蛇床子素可降低肝癌HepG2細(xì)胞中Cyclin D1、Cyclin B和CDK1 mRNA水平和蛋白表達(dá)。Cyclin D1是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期運(yùn)行的重要蛋白，對(duì)G1期細(xì)胞調(diào)控發(fā)揮關(guān)鍵性作用，可與細(xì)胞周期依賴蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)過程

。Cyclin D1水平異常升高會(huì)引起細(xì)胞增殖異常，誘發(fā)細(xì)胞惡性病變

。Cyclin B可與CDK1蛋白結(jié)合產(chǎn)生促有絲分裂因子調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程，抑制其水平升高可阻礙細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)

。有研究表明蛇床子素可降低鼻咽癌CNE2細(xì)胞中的Cyclin D1和vimentin水平發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖和侵襲作用

。本研究結(jié)果也具有相似趨勢(shì)，說明蛇床子可能是通過降低Cyclin D1、Cyclin B和CDK1表達(dá)抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖。

1）現(xiàn)代職業(yè)教育制度的初步試驗(yàn)。20世紀(jì)90年代中期，我國蘇南地區(qū)的職業(yè)教育改革亮點(diǎn)頻出，在產(chǎn)教融合和制度建設(shè)方面率先突破。當(dāng)時(shí)的國家教委專門為此召開研討會(huì)，研究和推廣蘇南地區(qū)的職業(yè)教育改革經(jīng)驗(yàn)。1996年，國家教委的工作要點(diǎn)提出要“認(rèn)真抓好蘇南地區(qū)建設(shè)現(xiàn)代職業(yè)教育制度的改革試驗(yàn)工作”。

腫瘤細(xì)胞因其細(xì)胞增殖異常且細(xì)胞凋亡減弱導(dǎo)致細(xì)胞生長不受控制，惡性細(xì)胞生物學(xué)行為明顯，本研究結(jié)果表明適當(dāng)濃度蛇床子素處理可降低肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞中Bax/Bcl-2、cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量。細(xì)胞凋亡有多個(gè)途徑介導(dǎo)，其中包括Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)和線粒體介導(dǎo)途徑，Caspases家族成員參與細(xì)胞生長、分化和凋亡等生理過程，Caspases一般生理活動(dòng)狀態(tài)下是以非活性酶原形式分布于細(xì)胞，接受凋亡信號(hào)刺激后形成催化活性。Caspases-3位于Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)最下游，發(fā)揮執(zhí)行者作用

。Bcl-2能夠抑制DNA損傷引起細(xì)胞凋亡信號(hào)激活和改變線粒體膜電位，抑制自由基和過氧物產(chǎn)生，負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡

。Bax對(duì)提高細(xì)胞膜通透性具有促進(jìn)作用，可誘導(dǎo)Caspases活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bax/Bcl-2比值變化可反映細(xì)胞凋亡情況

。PARP為DNA損傷的感受器，能夠通過線粒體途徑啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，然后反饋激活Caspases-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

。已有研究表明蛇床子素可通過調(diào)節(jié)人急性B淋巴細(xì)胞Bax和Bcl-2水平促進(jìn)細(xì)胞凋亡

。本研究結(jié)果與其趨勢(shì)一致，說明蛇床子素可能通過激活細(xì)胞凋亡途徑活化促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。

惡性腫瘤患者經(jīng)臨床治療后病情仍舊存在復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，這與腫瘤細(xì)胞侵襲能力具有密切關(guān)系，本研究結(jié)果顯示經(jīng)適當(dāng)濃度蛇床子素處理能抑制肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲能力，同時(shí)還可降低肝癌HepG2細(xì)胞中的N-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)量，增加E-cadhein蛋白表達(dá)水平。正常器官上皮組織由單層細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞間通過黏附蛋白黏附防止細(xì)胞移動(dòng)，惡性腫瘤細(xì)胞易發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低細(xì)胞間的黏附能力，易向腫瘤周圍組織轉(zhuǎn)移

。E-Cadherin在腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)呈低表達(dá)，N-Cadherin蛋白和vimentin蛋白表達(dá)升高

。已有研究表明蛇床子素可抑制肺癌A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，本研究結(jié)果表現(xiàn)出相似趨勢(shì)，說明蛇床子素可降低肝癌HepG2細(xì)胞侵襲能力。

JAK/STAT3信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡、炎性反應(yīng)等多種進(jìn)程，有研究表明抑制該信號(hào)通路可抑制某些惡性腫瘤細(xì)胞惡性細(xì)胞生物學(xué)行為

。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)適當(dāng)濃度蛇床子素處理可降低肝癌HepG2細(xì)胞p-JAK/JAK和p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)量，并且裸鼠移植瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也呈現(xiàn)出相同趨勢(shì)，腫瘤組織重量和體積也明顯降低。有研究表明西黃丸可通過降低肝癌HepG2細(xì)胞p-STAT3蛋白表達(dá)量來抑制細(xì)胞增殖和侵襲

。本研究結(jié)果也表現(xiàn)出相似趨勢(shì)，說明蛇床子素對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用、對(duì)細(xì)胞凋亡的 促進(jìn)作用可能與抑制JAK/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

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