李望豪，許鈺瀅，謝瑋軒，王墨羽，吳鳳娟，賴思松，葉杰輝，王榮波，魯國東1,，葉文雨1,

(1.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.植物與微生物相互作用福建省高校重點實驗室，福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002；4.福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室，福建 福州 350013)

甘蔗是全球范圍內(nèi)得到廣泛種植的作物，我國在甘蔗產(chǎn)業(yè)方面為世界第三，巴西位列第一[1-4]。以往對甘蔗栽培模式和分離產(chǎn)物研究較多，但對甘蔗根際土壤微生物與非根際土壤微生物的比較在文獻(xiàn)中鮮有報道。通過對甘蔗在大自然中生長的條件的探究和對其根際土壤微生物代謝能力的分析能有效提高我國甘蔗行業(yè)競爭力，為甘蔗的合理種植，提高甘蔗的質(zhì)量、品質(zhì)和產(chǎn)量提供依據(jù)。

土壤是甘蔗生長過程中吸收養(yǎng)分的主要來源，而土壤中的微生物代謝活性是土壤肥力的潛在指標(biāo)，它可以反映出土壤里面的微生物的功能及其多樣性[5]。Biolog-Eco平板包括6類共計31種碳源試驗中它根據(jù)不同孔吸光值計算平均顏色變化率，通過平均顏色變化率來體現(xiàn)對碳源的利用，進(jìn)一步表現(xiàn)出根際微生物群落代謝活性的動態(tài)變化[6]。因此Biolog-Eco技術(shù)對土壤微生物代謝及其功能多樣性進(jìn)行評價和分析在大多數(shù)類似試驗中得到了大家廣泛的應(yīng)用[7-9]。

本研究通過對漳州市龍文區(qū)朝陽鎮(zhèn)甘蔗根際土壤微生物與非根際土壤微生物對不同碳源的利用，揭示了甘蔗根際微生物群落的功能多樣性同時為甘蔗產(chǎn)業(yè)化種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗供試甘蔗根際土與非根際土樣品采自漳州市龍文區(qū)朝陽鎮(zhèn)。

1.2 土壤樣品的采集

采用五點取樣法在每塊地用土鉆采集0-20cm的根際土壤與非根基土壤樣品。將五個樣品混合為一個樣品用無菌袋收集，并將土樣置于4℃冰箱保存，1d內(nèi)進(jìn)行分析。

1.3 試驗方法

采用Biology-ECO技術(shù)對甘蔗根際土壤微生物群落和非根際土壤微生物功能及代謝進(jìn)行多樣性分析，并選取培養(yǎng)168h的土壤稀釋培養(yǎng)液進(jìn)行土壤微生物碳源利用和主成分分析[10-12]。

稱取5g供試土壤加入到100ml無菌生理鹽水中，180rpm震蕩30min混勻。置于冰上冰浴2min，上清液與無菌生理鹽水混合到原來的千分之一。在Biology-ECO板A1、A5、A9三個孔中加入150ul生理鹽水，其余孔采用八通道移液器依次加入150ul處理液。25℃恒溫避光培養(yǎng)，每24h使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定590nm時的吸光度，共記錄8d。

該試驗中土壤微生物的代謝活性是通過AWCD值來定量反映的[13-14]。其中，測得的Ci的值為第i個碳源孔的吸光值，R的值為對照孔的吸光值，Ci- R小于0的孔記為0，在本試驗中n為生態(tài)板底物數(shù)量為31。

多樣性指數(shù)，用H來表示，可以得出物種的豐富度。

H=-∑Pi×lnPi

優(yōu)勢度指數(shù)，用D來表示，用于評估某一物種的優(yōu)勢度。

均勻度指數(shù)，用U來表示，用于代表物種群落均勻度，其中ni為第i孔的相對吸光值。

上式中，Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率，Ci- R小于0的孔記為0。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 處理原始數(shù)據(jù)，主成分分析采用Origin 2021、SPSS 20.0進(jìn)行分析和繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 土壤微生物群落代謝活性的變化

AWCD可用來反應(yīng)根際與非根際微生物的代謝活性，AWCD與土壤微生物的密度以及微生物的活性成正相關(guān)。甘蔗根際土壤與非根際土壤(甘蔗對照組)的AWCD值在培養(yǎng)24-168h快速增加，均在168h后趨于穩(wěn)定(圖1)，因此選擇168h的吸光值作為計算微生物群落多樣性的指標(biāo)。甘蔗根際土壤AWCD值顯著高于非根際土壤，從圖1可以得出根際土壤微生物對碳源利用顯著高于非根際土壤。

圖1 甘蔗土壤微生物AWCD值隨時間的變化

2.2 土壤微生物對C源的利用

甘蔗根際土與非根際土壤微生物對6種碳源的利用能力存在差異，且利用能力隨培養(yǎng)時間增長而呈現(xiàn)上升趨勢(圖2)。與非根際土壤微生物相比，甘蔗根際土壤微生物對氨基酸類、胺類、多聚物類、酚酸類、羧酸類、糖類的代謝能力在168h分別顯著提高了112.37%、93.45%、160.47%、68.68%、145.26%、130.76%。72h前，非根際微生物對酚酸類的利用顯著大于甘蔗根際微生物，而72h后則呈相反趨勢。

圖2 甘蔗根際與非根際土壤(對照)微生物對碳源的代謝能力

2.3 土壤微生物代謝多樣性

通過培養(yǎng)一周后所得到的平均顏色變化率對甘蔗根際和非根際土壤微生物對碳源的利用進(jìn)行主成分分析。其中符合特征值大于1的主成分一共有五個。第一、二主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為57.7%和17.4%，本文取前兩個主成分進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)的探究并得出下面的結(jié)果。

從主成分的系數(shù)矩陣結(jié)果可以看出，集中在第1主成分上有25種決定PC1變異的碳源(相關(guān)系數(shù)的絕對值>0.50)。其中氨基酸類占20%：L-精氨酸(C1)、L-天門冬酰胺(C2)、L-苯丙氨酸(C3)、L-絲氨酸(C4)、L-蘇氨酸(C5)；胺類占8%：苯乙胺(C7)、腐胺(C8)；多聚物類占8%：吐溫40(C9)、吐溫80(C10)；酚酸類占4%：4-羥基苯甲酸(C14)；羧酸類占28%：丙酮酸甲酯(C15)、D-葡糖胺酸(C16)、D-半乳糖醛酸(C17)、γ-羥丁酸(C18)、衣康酸(C19)、α-丁酮酸(C20)、D-蘋果酸(C21)；糖類占32%：D-纖維二糖(C22)、β-甲基-D-葡萄糖苷(C24)、i-赤蘚糖醇(C26)、D-甘露醇(C27)、N-乙酰-D-葡萄糖氨(C28)、1-磷酸葡萄糖(C29)、D,L-α-磷酸甘油(C30)、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯(C31)?？梢娪绊慞C1主要為糖類。決定PC2變異的主要碳源有7種包括：氨基酸類2種：L-苯丙氨酸(C3)、甘氨酰-L-谷氨酸(C6)；多聚物類2種：α-環(huán)式糊精(C11)、肝糖(C12)；酚酸類1種：2-羥基苯甲酸(C13)；羧酸類1種：α-丁酮酸(C20)；糖類1種：D,L-α-磷酸甘油(C30)。 L-苯丙氨酸(C3)、α-丁酮酸(C20)、D,L-α-磷酸甘油(C30)對PC1和PC2貢獻(xiàn)系數(shù)都大于0.5。

2.4 土壤微生物多樣性比較分析

根據(jù)第7天的AWCD值(詳細(xì)數(shù)據(jù)見第一幅圖)，計算出甘蔗根際土與非根際土的三個相關(guān)指數(shù)(表1)。表中數(shù)據(jù)顯示，甘蔗根際土壤三項指標(biāo)均略高于非根際土壤，表明甘蔗根際土壤微生物群落多樣性程度較高[9]。

圖3 31種碳源對PC1和PC2貢獻(xiàn)的特征向量系數(shù)

表1 土壤微生物功能多樣性指數(shù)

3 結(jié)論與討論

本試驗主要以甘蔗根際土壤與非根際土壤為研究，通過Biology-ECO技術(shù)對甘蔗根際土壤微生物群落進(jìn)行了相關(guān)分析，得到如下結(jié)論：(1)AWCD值變化表明，甘蔗土壤微生物群落的碳源代謝能力和代謝功能都明顯強于非根際土壤。(2)甘蔗根際土壤微生物對6種碳源的利用強度均顯著高于非根際土壤。(3)PCA結(jié)果表明，甘氨酰-L-谷氨酸、α-環(huán)式糊精、肝糖、2-羥基苯甲酸等碳源甘蔗根際土壤微生物不能利用。在通過培養(yǎng)基培養(yǎng)法研究甘蔗根際土壤微生群落時，應(yīng)優(yōu)先考慮其不能利用的其它碳源。(4)Shannon 多樣性指數(shù)、Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)、Mclntosh 均勻度指數(shù)的大小變化順序均為甘蔗根際土大于非根際土。

甘蔗具有很大的經(jīng)濟價值且其根際微生物群落代謝功能會對其產(chǎn)量產(chǎn)生影響。本文通過比較甘蔗根際與非根際土壤的微生物群落多樣性，研究根際對土壤中的微生物可能產(chǎn)生的影響。運用Biolog-Eco生態(tài)板技術(shù)研究土壤微生物區(qū)系代謝活性時，較高的AWCD值代表著土壤微生物代謝活性較高，反之則表明土壤微生物區(qū)系代謝活性較低[15-18]。根據(jù)試驗結(jié)果易知，甘蔗的根際土壤微生物各時段AWCD值很大一部分大于非根際土壤，說明了根際土壤微生物的代謝活性和對各類碳源的利用都優(yōu)于非根際土壤微生物。

多樣性指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)和均勻度指數(shù)等三個常用指數(shù)通常被用來反應(yīng)土壤微生物群落的多樣性，可以揭示土壤微生物種群構(gòu)造和能力的差別[19-20]。根據(jù)研究表明根際土壤微生物群落的各項指數(shù)均優(yōu)于非根際土壤。尤其是Mclntosh 均勻度指數(shù)明顯的高于非根際土壤，從以上數(shù)據(jù)可以得出甘蔗能促進(jìn)土壤微生物群落產(chǎn)生多種多樣的功能。

在進(jìn)行主成分對比分析時可以得出，根際土壤微生物可以利用氨基酸、胺類、多聚物類等作為碳源，且其對碳源的利用優(yōu)于非根際土壤，這可能是因為甘蔗植株殘體為土壤微生物群落提供了豐富的養(yǎng)分，進(jìn)而造成了對碳源利用的不同，應(yīng)進(jìn)一步用培養(yǎng)試驗基培養(yǎng)法分離微生物來對猜想進(jìn)行驗證。

在現(xiàn)有條件下，用Biolog-Eco生態(tài)板技術(shù)從碳源代謝的角度來討論根際微生物對土壤微生物的影響存在一定的局限性。在今后的試驗中，應(yīng)進(jìn)一步深入分析。