徐鴻雁

(青海大學農林科學院，青海 西寧 810016)

鎘[Cd(II)]是一種常見的環(huán)境污染物，主要來自于采礦、燃煤、焚化垃圾、電子鍍鎘等人為因素[1]，它侵入土壤后經生物循環(huán)進一步進入生態(tài)系統(tǒng)，破壞生物多樣性，對人體健康有害[2-3]。長期受Cd污染的環(huán)境中，生存著一定數(shù)量對其具有較強耐受能力的微生物類群。而此類生物本身也會發(fā)生基因突變或自我調整代謝以適應長時間的Cd脅迫環(huán)境。

羊肚菌(Morchella)，不僅具有較高的營養(yǎng)及藥用價值[4]，對重金屬也有潛在的富集能力[5-8]，有研究發(fā)現(xiàn)野生羊肚菌Cd元素含量超出國家限定標準[9]。目前對于羊肚菌如何富集、耐受Cd的機理研究才剛剛起步，主要集中在子實體Cd含量測定[9]、Cd富集能力[10]、基因敲除[11]等方面，關于Cd脅迫下羊肚菌蛋白表達情況和響應機制等研究鮮有報道。同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術可對不同樣本同時進行定量分析，已成為定量蛋白組學中的支撐技術之一，且越來越多被應用到生物中，如水稻[12-13]、植物乳桿菌[14]和細菌[15]等抵抗重金屬脅迫機制的研究中。

本研究利用iTRAQ技術平臺定量分析Cd脅迫下羊肚菌蛋白質差異表達變化，初步探究羊肚菌在Cd環(huán)境下的響應機制，為探究真菌耐鎘機理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

供試小海綿羊肚菌(M.spongiola)M12-10菌株由青海大學極端環(huán)境微生物研究室提供。菌株培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 小海綿羊肚菌Cd處理菌絲的培養(yǎng)

以PDA培養(yǎng)基為基礎，配制最終濃度為0mg/L、0.15mg/L、0.9mg/L、1.5mg/L的CdCl2培養(yǎng)基，對照(CK)組為無其它元素添加的PDA培養(yǎng)基。滅菌后于培養(yǎng)基中央接種一塊小海綿羊肚菌菌餅，在離接種塊附近斜插3塊無菌蓋玻片，放置于(20±1)℃黑暗恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。

1.2.2 掃描電鏡觀察

Cd處理試驗結束后，用2.5%戊二醛固定不同濃度Cd處理的羊肚菌菌絲，經乙醇梯度脫水、置換、預冷、凍干、鍍金，采用掃描電子顯微鏡-X射線光譜儀觀察菌絲經不同處理后形態(tài)變化。每處理做3個重復。

1.2.3iTRAQ蛋白定量實驗

收集菌體樣品送至華大基因進行iTRAQ蛋白定量分析，按步驟進行菌絲粗蛋白提取、酶解、iTRAQ標記、質譜分析等流程[16]。

1.2.4 蛋白質的鑒定和生物信息學分析

原始數(shù)據(jù)上傳至數(shù)據(jù)存儲平臺ProteomeXchange。定義差異倍數(shù)1.2倍及以上(即上調≥1.2和下調≤0.83)，且經過顯著性統(tǒng)計檢驗其Q-value值≤0.05的蛋白為顯著差異蛋白(DEPs)[17]。利用Gene Ontology、KEGG、STRING數(shù)據(jù)庫對鑒定的蛋白進行功能注釋、生物通路信息分析，同時在WoLF PSORT軟件中對差異蛋白進行亞細胞定位預測。

1.2.5 蛋白表達的RT-qPCR驗證

根據(jù)iTRAQ蛋白定量結果，篩選部分差異表達蛋白，對其編碼基因進行實時熒光定量，以驗證iTRAQ蛋白定量結果的準確性。在線設計引物(表1)，18S rRNA為內參。Cd處理第5天收集菌絲，真菌快速抽提總RNA、經反轉錄后在20μl反應體系進行qRT-PCR反應：引物(10μmol/L)0.4μl，cDNA (1μg/ml) 0.8μl，2×SG Fast qPCR Master Mix 10μl。反應條件：95℃ 180s；95℃ 3s，各引物Tm值30s，40個循環(huán)[9]。數(shù)據(jù)使用2-△△Ct進行相對表達量計算，每待測基因重復3次。

表1 qRT-PCR驗證所選蛋白及對應引物信息

2 結果與分析

2.1 Cd對羊肚菌菌絲形態(tài)的研究

Cd脅迫處理的羊肚菌菌絲形態(tài)如圖1所示：對照CK無Cd添加時，菌絲表面光滑，菌絲扁平且直徑較寬；濃度在0.15mg/L時菌絲開始出現(xiàn)褶皺且直徑變窄；濃度在0.9mg/L時菌絲出現(xiàn)扭曲且表面變的粗糙；濃度在1.5mg/L時菌絲出現(xiàn)明顯扭結、彎曲、折疊，菌絲表面褶皺凹陷情況增多。結果表明，Cd會破壞菌絲結構和形態(tài)，從而抑制羊肚菌的生長。

圖1 Cd(II)處理下小海綿羊肚菌掃描電鏡圖像

2.2 Cd對羊肚菌蛋白表達水平的研究

2.2.1 蛋白鑒定及定量分析

M12-10菌絲蛋白SDS-PAGE電泳結果如圖2所示，蛋白條帶清晰無降解，符合質控標準；菌體蛋白濃度及總量符合iTRAQ實驗標準(表2)。在不同濃度Cd脅迫下，共檢測鑒定到3629個DEPs，其中144個蛋白對Cd處理呈現(xiàn)顯著差異性表達(圖3)。0.15mg/L Cd組中有17個DEPs表達上調，18個DEPs表達下調；0.90mg/L Cd處理組有29個DEPs表達上調，38個DEPs表達下調；1.50mg/L Cd處理組有25個DEPs上調表達，17個DEPs下調表達。值得注意的是，在三個Cd處理組的144個DEPs中，共有6個DEPs上下調趨勢一致。

圖2 總蛋白質定量標準曲線(左)及其SDS-PAGE電泳圖(右)注：泳道M為Marker；泳道1-4分別為樣品CK，Cd0.15，Cd0.9，Cd1.5。

表2 不同Cd環(huán)境下羊肚菌樣品中蛋白含量

圖3 鎘脅迫下羊肚菌菌絲差異表達蛋白

2.2.2 差異蛋白的GO功能富集

表3列出了小海綿羊肚菌在不同Cd濃度處理下DEPs含量最高的6個GO富集功能。0.15mg/L Cd處理組，DEPs顯著富集到碳水化合物分解代謝過程，涉及核糖體細胞組件、rRNA結合相關功能的蛋白變化最為顯著；0.9mg/L Cd處理下，DEPs顯著富集涉及小分子生物合成過程、硫化物代謝過程、硫胺素代謝及生物合成過程等，碳-氮鍵水解酶活性功能蛋白差異最顯著；1.5mg/L Cd處理下，DEPs主要作用于前體代謝物和能量的產生、藥物代謝過程、能量耦合質子輸運、ATP合成耦合質子傳輸、細胞呼吸和ATP生物合成過程等。涉及ATP合酶、線粒體或其它相關的膜結構、黃素腺嘌呤二核苷酸結合功能蛋白差異最顯著。

2.2.3 差異蛋白的Pathway富集分析

0.15mg/L Cd處理組中DEPs主要參與果糖和甘露糖代謝、核糖體、甲烷代謝、磷酸戊糖途徑，其中參與甲烷代謝途徑的蛋白質均上調表達；0.9mg/L Cd處理下DEPs主要參與代謝途徑、抗生素的合成、硫胺素代謝、氨基酸代謝等通路，參與硫胺素代謝和聚糖降解蛋白質均上調表達；1.5mg/L Cd處理下DEPs主要參與代謝途徑，能量代謝、次生代謝產物的合成等通路，參與能量代謝如TCA循環(huán)、碳代謝等的蛋白質均上調表達(圖4)。

圖4 差異表達蛋白Pathway注釋富集統(tǒng)計圖

2.2.4 差異蛋白亞細胞定位分析

不同Cd處理小海綿羊肚菌DEPs亞細胞定位分布如圖5所示：差異蛋白主要集中在胞質溶膠、線粒體、細胞核和細胞外區(qū)域。具體來說，0.15mg/L處理組中差異蛋白質主要定位在細胞核中，0.90mg/L處理組中定位于胞質溶膠、線粒體和細胞核的差異表達蛋白較多，1.5mg/L處理組差異蛋白在胞質溶膠、線粒體和細胞外基質中大量表達。

圖5 差異表達蛋白亞細胞定位統(tǒng)計圖注：extr-胞外基質，plas-質膜，cysk-細胞骨架，cyto-細胞溶質，mito-線粒體，ER-內質網(wǎng)，nucl-細胞核，cytonucl-胞質及核。

2.2.5 qRT-PCR驗證

使用2-△△Ct法計算3種濃度鎘脅迫下亞硝酸還原酶、甘油醛 3 磷酸鹽脫氫酶、核糖蛋白、NADH依賴黃素氧化物酶、含TBP域蛋白等5個基因的表達水平(圖6)，其與蛋白組數(shù)據(jù)庫豐度變化表現(xiàn)一致，說明蛋白組數(shù)據(jù)可信。

圖6 qRT-PCR相對定量分析結果注：nitrite reductase:亞硝酸還原酶；gapd:甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶；robo:核糖蛋白；NADP-fr：NADH依賴黃素氧化物酶；tbp:含TBP域蛋白

3 討論與結論

3.1 小海綿羊肚菌應對Cd環(huán)境的關鍵蛋白

不同濃度Cd脅迫下小海綿羊肚菌有6種蛋白均表現(xiàn)出顯著差異，其中β-半乳糖苷酶、延伸因子1-α和細胞色素c氧化酶裝配蛋白樣蛋白cox15表現(xiàn)為持續(xù)上調表達，醛酮還原酶和兩個NAD(P)-結合蛋白則表現(xiàn)為持續(xù)下調表達。細胞色素c氧化酶被認為是線粒體呼吸的限速步驟，其上調表達可能是一種補償機制，可以恢復線粒體活性的下降，從而限制Cd對細胞的損傷[18]。ROS是導致細胞損傷的原因之一，外源刺激會阻止胞內正常的電子傳遞，進一步導致線粒體ROS的形成，而細胞色素c氧化酶作為電子傳遞鏈末端的酶復合體的重要組成部分，很容易被ROS攻擊導致電子傳遞中斷[19]。由此我們認為，鎘脅迫下小海綿羊肚菌細胞色素c氧化酶蛋白的上調表達，有助于中和胞內過量的ROS，減少線粒體內呼吸鏈上的電子泄漏，防止鎘促進的氧化應激。類似由鎘脅迫引起的細胞色素c氧化酶I上調表達的情況在雙殼類和鯽魚腎臟細胞中也被發(fā)現(xiàn)[20-21]。延伸因子1-α可促進多肽鏈延伸，參與蛋白翻譯、信號傳導、細胞凋亡等重要的細胞過程[22]。文獻指出，水稻延伸因子1-α基因的轉錄可被多種外源環(huán)境因子所誘導，而外源鎘和銅脅迫則容易誘導表達黃孢原毛平革菌菌絲體中的延伸因子1-α亞基[23-24]。本研究中，鎘脅迫下小海綿羊肚菌延伸因子1-α被三種濃度鎘持續(xù)性誘導上調表達，表明延伸因子1-α在小海綿羊肚菌應對外源鎘引起的蛋白轉錄中起到關鍵作用。β-半乳糖苷酶在很多生物中都有分布，且在生物體內起著重要作用，是大腸桿菌在葡萄糖饑餓條件下乳糖代謝所必需的，也與細胞衰老相關[25-26]。衰老會使生物體β-半乳糖苷酶活性升高，而自由基積累及DNA損傷是細胞衰老最常見的誘因[27-28]。文獻指出，外源刺激導致胞內積累過量的ROS，擾亂內質網(wǎng)的正常氧化還原動態(tài)平衡，誘導內質網(wǎng)應激，導致細胞自噬、凋亡或衰老[29]。有研究表明，外源氯化鎘促進了裂殖酵母中β-半乳糖苷酶的合成[30]。一定濃度氯化鎘培養(yǎng)真養(yǎng)產堿桿菌，發(fā)現(xiàn)在兩個突變菌株中都誘導了β-半乳糖苷酶的表達[31]。小海綿羊肚菌在鎘脅迫下，β-半乳糖苷酶持續(xù)性的上調表達，可能重點參與應對鎘引起的胞內自由基及ROS積累所導致的細胞損傷甚至凋亡、衰老。醛酮還原酶是多元醇代謝通路途徑中限速酶之一，參與葡萄糖生成山梨醇的過程，此催化過程需要消耗NADPH，而GR催化生成GSH時也需消耗NADPH，AKR會與GR競爭NADPH，導致減少GSH生成量，影響GSH清除自由基，進一步加劇氧化應激[32-34]。

本研究中，鎘脅迫下小海綿羊肚菌醛酮還原酶持續(xù)性下調表達，這不僅有利于降低與GST的NADPH競爭，也可能通過限制多元醇代謝通路，進一步減少葡萄糖的消耗，維持細胞正常代謝來應對鎘的毒害。此外，多元醇代謝通路第二步是山梨醇脫氫酶將山梨醇氧化成對應的果糖，這會致使氧化應激的出現(xiàn)，因為此過程會消耗NAD+，生成NADH，而NADH是生成ROS的重要底物[35]。在鎘脅迫下，小海綿羊肚菌菌絲體中的NAD(P)-結合蛋白持續(xù)下調，正是為減少ROS的生成，防止氧化損傷。

3.2 鎘脅迫下小海綿羊肚菌菌絲體蛋白調控機制

不同初始濃度Cd脅迫下小海綿羊肚菌菌絲比較蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)，某些蛋白以及代謝通路的調控呈現(xiàn)出特殊的濃度依賴性，不同濃度處理組差異蛋白數(shù)量、代謝通路以及差異蛋白在細胞內的定位都有所不同。首先，膜組分、氮利用以及果糖和甘露糖代謝等生物學過程相關的蛋白主要在0.15mg/L處理組差異上調表達，如肌動蛋白A3b，微管蛋β鏈，抗增殖蛋白等；通過對0.15mg/L處理組的DEPs進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)該組大多數(shù)顯著差異蛋白定位到細胞核(圖5)，表明在0.15mg/L低濃度Cd處理時細胞表面主要利用細胞膜來隔離環(huán)境中的Cd，同時也通過加速胞內代謝等方式來保證細胞自身的生長發(fā)育。這一階段細胞對外源Cd調控應答可總結為“胞膜防御應答模式”。其次，抗氧化活性、刺激應答、信號轉導等功能的蛋白在0.90mg/L處理組被顯著上調表達，其中包括硫氧還原蛋白、HMP合成酶以及glycoside hydrolase/deacetylase，F(xiàn)ructose-bisphosphate aldolase，Methyltransf_25等；亞細胞定位也表示0.90mg/L Cd脅迫下細胞內溶膠、線粒體等的蛋白被差異表達(圖5)，這表明0.90mg/L Cd已經超出了小海綿羊肚菌細胞膜對環(huán)境中Cd的清除能力，部分Cd已穿越細胞膜進入胞內，細胞通過產能合成刺激應答、信號轉導以及抗氧化相關蛋白，應對胞內Cd導致的ROS積累以及脂質過氧化等，同時細胞也能產生硫氧還蛋白與胞內游離的Cd結合，改變其毒性價態(tài)，以達到緩解胞內氧化損傷的目的。因此，這一階段細胞對外源Cd調控應答可總結為“胞質代謝應答模式”。最后，1.5mg/L Cd脅迫處理組小海綿羊肚菌菌絲細胞內參與能量代謝、次生代謝產物合成、損傷修復等生物學過程的蛋白被上調表達，與細胞成分及生物發(fā)生相關的蛋白均被下調表達，這表明1.5mg/L Cd脅迫環(huán)境下，大量Cd進入細胞，導致細胞內積累了大量ROS，誘導細胞產能(TCA循環(huán)、氧化磷酸化、葉綠素代謝等)促進各類氧化還原反應，并通過加速次生代謝產物如胞外多糖等的分泌，轉移胞內過量的游離Cd。亞細胞定位也驗證了次生代謝產物在1.5mg/L處理組的重要作用(圖5)。因此這一階段細胞對外源Cd調控應答可總結為“外排修復應答模式”。