周 蓉 趙肖華 楊 歡 吳 俐 曹趙云

（中國(guó)水稻研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，杭州 311401）

我國(guó)是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國(guó)，農(nóng)藥的使用為農(nóng)產(chǎn)品增產(chǎn)和農(nóng)民增收起到重要保障作用，但與此同時(shí)也給人類(lèi)健康、生態(tài)環(huán)境等造成威脅[1～2]。近年來(lái)，我國(guó)農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)發(fā)展極為迅速，如今已逐漸形成了以質(zhì)譜技術(shù)為主的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)[3～4]。其中，氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（GC－MS/MS）技術(shù)是測(cè)定有機(jī)磷、有機(jī)氯、菊酯類(lèi)等農(nóng)藥殘留的最為有效的手段之一，其與液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，構(gòu)成當(dāng)前農(nóng)藥殘留檢測(cè)的兩大技術(shù)體系[5～7]。然而，GC－MS/MS也存在一些較為明顯的技術(shù)缺陷。首先，最為常用的電子轟擊（EI）電離模式，會(huì)導(dǎo)致部分菊酯類(lèi)農(nóng)藥（如氯氰菊酯、溴氰菊酯等）靈敏度略顯不足。其次，數(shù)據(jù)質(zhì)量受基質(zhì)干擾嚴(yán)重，需頻繁對(duì)進(jìn)樣口、色譜柱、離子源等進(jìn)行維護(hù)，特別在面對(duì)如今以QuECh-ERS為主的樣品處理技術(shù)時(shí)尤為明顯，如檢測(cè)茶葉等基質(zhì)中乙酰甲胺磷時(shí)，在數(shù)十次進(jìn)樣后，其靈敏度下降一半以上，色譜峰拖尾情況也隨之發(fā)生，嚴(yán)重影響定量結(jié)果。

程序升溫－大體積進(jìn)樣是提高GC－MS/MS分析靈敏度的重要手段[8～9]。首先樣品被注入低溫進(jìn)樣口，在氣體吹掃下大量溶劑被排出系統(tǒng)，隨后的瞬時(shí)高溫再將汽化目標(biāo)物引入色譜分離系統(tǒng)。這種進(jìn)樣方式可允許更大的進(jìn)樣體積，使得分析靈敏度顯著提高，伴隨溶劑效應(yīng)的大幅降低，低沸點(diǎn)化合物的重現(xiàn)性也將得到明顯改善。目前大體積進(jìn)樣技術(shù)主要應(yīng)用在水質(zhì)、空氣檢測(cè)領(lǐng)域[10～11]，針對(duì)復(fù)雜農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)的檢測(cè)應(yīng)用較少。QuEChERS樣品處理技術(shù)因操作簡(jiǎn)便、通量高等優(yōu)點(diǎn)被日益廣泛應(yīng)用，但其凈化能力有限，需要附加更多的凈化材料或凈化步驟才能更好地運(yùn)用到GC－MS/MS分析中，如GB 23200.113－2018標(biāo)準(zhǔn)方法中就額外增加了溶劑轉(zhuǎn)換步驟，以增強(qiáng)基質(zhì)凈化能力。因此，在開(kāi)發(fā)適合于大體積進(jìn)樣的GC－MS/MS方法時(shí)，提高樣品凈化能力是關(guān)鍵。

本研究基于QuEChERS技術(shù)，通過(guò)在分散萃取劑中加入石墨化碳黑（GCB）以及加入甲苯進(jìn)行二次凈化，建立了我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測(cè)頻次較高的53種農(nóng)藥殘留（包括有機(jī)磷、有機(jī)氯和菊酯類(lèi)）的大體積進(jìn)樣GC－MS/MS檢測(cè)方法。該方法有效解決了現(xiàn)有GC－MS/MS技術(shù)靈敏度低、耐受性差的問(wèn)題，且方法操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

一、材料與方法

（一）儀器與試劑Agilent 7890A－7000A氣相色譜－三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有多模式進(jìn)樣裝置（G3510A），配有EI源（美國(guó)Aglient公司）；高速分散機(jī)（德國(guó)IKA公司）；旋渦振蕩儀（德國(guó)IKA公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

乙腈、丙酮和正己烷（色譜純，美國(guó)Tedia公司）；甲苯 （農(nóng)殘級(jí)，美國(guó)Tedia公司）；硫酸鎂（純度＞97%，比利時(shí)ACROS公司）；氯化鈉（農(nóng)殘級(jí)，德國(guó)CNW公司）；QuEChERS凈化劑由無(wú)水硫酸鎂（MgSO4）、GCB、弗羅里硅土、乙二胺－N－丙基硅烷化硅膠（PSA）和十八烷基鍵合硅膠（C18）組成，均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司。標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量濃度為100 mg/L的53種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（天津阿爾塔科技有限公司）。9種固體內(nèi)標(biāo)物：D3－乙酰甲胺磷、13C6－γ－六六六、D6－甲基對(duì)硫磷、13C4，15N2－氟蟲(chóng)腈、D5－異菌脲、D6－苯醚甲環(huán)唑、D5－甲氰菊酯、D10－毒死蜱和D5－氰戊菊酯（純度≥98%，美國(guó)Sigma公司）。實(shí)驗(yàn)用水為Milli－Q高純水。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.樣品前處理。稱(chēng)取10.0 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈，在高速分散機(jī)中高速勻漿2 min，加入4.0 g無(wú)水MgSO4和1.0 g氯化鈉，勻漿1 min，以4 200 r/min離心3 min，使乙腈和水相分層。移取上層乙腈相1.5 mL于15 mL刻度離心管中（預(yù)先加入40 mg PSA、40 mg C18、40 mg GCB和0.5 g無(wú)水MgSO4），加 入0.5 mL甲苯溶液。渦旋混合1 min后，以8 000 r/min離心5 min。取上清液1.0 mL，加入5 mg/L內(nèi)標(biāo)混合物20 μL，混勻待測(cè)。

2.色譜－質(zhì)譜條件。（1）多模式進(jìn)樣口條件：進(jìn)樣口初始溫度為50℃；進(jìn)樣量為3 μL；程序升溫進(jìn)樣口（PTV）的溫度程序設(shè)置為50℃保持0.2 min，以720℃/min升溫至300℃保持5 min，再以720℃/min降溫至50℃；壓力為51.7 kPa；吹掃流量為60 mL/min；吹掃時(shí)間為2.5 min；放空流速為100 mL/min，放空壓力為34.5 kPa，放空時(shí)間為0.2 min。（2）氣相色譜條件：色譜柱HP－5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）；柱箱升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃，以25℃/min升溫至280℃保持10 min；后運(yùn)行條件為300℃，3 min。（3）質(zhì)譜條件：EI源溫度為230℃；傳輸線溫度為280℃：碰撞氣流速為2.25 mL/min；猝滅氣流速為1.5 mL/min；電子能量為70 eV；四極桿溫度為150℃。53種農(nóng)藥及9種內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 53種農(nóng)藥（0.1 mg/L）和9種同位素內(nèi)標(biāo)（0.1 mg/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖

表1 53種農(nóng)藥和9種同位素內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間及特征離子

續(xù)表1

二、 結(jié)果與討論

（一）程序升溫-大體積進(jìn)樣模式參數(shù)的優(yōu)化本研究對(duì)在使用程序升溫－大體積進(jìn)樣模式進(jìn)樣時(shí)所涉及的主要參數(shù)（吹掃流量、吹掃時(shí)間、放空流速、放空時(shí)間以及進(jìn)樣體積等）進(jìn)行考察，具體參數(shù)設(shè)置見(jiàn)上文“色譜－質(zhì)譜條件”部分。由研究結(jié)果可見(jiàn)，進(jìn)樣量大容易使襯管變臟，引起峰拖尾，本研究采用720℃/min的升溫條件快速?gòu)?0℃升溫至300℃，使分析物瞬間汽化，減少分解。通過(guò)調(diào)節(jié)吹掃流量和放空流速能夠有效去除基質(zhì)干擾，在靈敏度得到有效提高的同時(shí)，還避免了色譜峰拖尾、重復(fù)性變差等現(xiàn)象。結(jié)果顯示，在采集時(shí)間8.5～15 min區(qū)域，通過(guò)調(diào)節(jié)吹掃流量，能很好地除去一些雜峰的干擾，同時(shí)乙酰甲胺磷、六六六等農(nóng)藥的檢測(cè)靈敏度也得到提高；通過(guò)優(yōu)化放空流速，乙酰甲胺磷、異菌脲等農(nóng)藥色譜峰的拖尾現(xiàn)象得到很好的改善。

在其他色譜－質(zhì)譜條件相同的情況下，采用大體積進(jìn)樣模式進(jìn)樣3 μL和常規(guī)不分流進(jìn)樣1 μL兩種進(jìn)樣方式對(duì)53種農(nóng)藥進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，采用大體積進(jìn)樣模式進(jìn)樣時(shí)，氟蟲(chóng)腈、p，p′－滴滴涕、o，p′－滴滴涕、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯和苯醚甲環(huán)唑這7種農(nóng)藥的響應(yīng)值是常規(guī)不分流進(jìn)樣的2.0～2.5倍，剩余46種農(nóng)藥的響應(yīng)值是常規(guī)不分流進(jìn)樣的3.1～4.0倍，可見(jiàn)采用大體積進(jìn)樣模式顯著提高了檢測(cè)靈敏度。

（二）基于QuEChERS技術(shù)的二次凈化方法建立

1.吸附劑的用量。根據(jù)文獻(xiàn)[12～13]，乙腈對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥均有較好的溶解度，具有極性大、穿透力強(qiáng)、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，且油脂和色素等雜質(zhì)在乙腈中的溶解度較小，因此本研究在綜合以上情況和參考GB 23200.113標(biāo)準(zhǔn)后，采用乙腈作為提取溶劑。

據(jù)有關(guān)研究證明[14～15]，復(fù)合凈化劑比單一凈化劑對(duì)雜質(zhì)的凈化效果要好。因此，本研究選擇無(wú)水MgSO4、PSA、C18和GCB混合物作為分散固相萃取吸附劑，以韭菜為試驗(yàn)對(duì)象，在其他3種凈化材料用量不變的前提下，分別對(duì)4種凈化材料的添加量進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)無(wú)水MgSO4添加量為0.5 g時(shí)，能很好地去除提取液中的水分，且農(nóng)藥回收率基本在70%～120%之間。當(dāng)PSA添加量為40 mg時(shí)，農(nóng)藥回收率基本在70%～120%之間，但當(dāng)添加量達(dá)到80 mg時(shí)，乙酰甲胺磷、對(duì)硫磷、水胺硫磷等有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥回收率低于65%。如圖2所示，當(dāng)C18添加量為40 mg時(shí)，農(nóng)藥的回收率最高；當(dāng)C18添加量低于或高于40 mg時(shí)，回收率較低。當(dāng)GCB添加量達(dá)到40 mg時(shí)，提取液顏色接近無(wú)色透明，同時(shí)農(nóng)藥回收率也在70%～120%之間；當(dāng)GCB添加量增加為50 mg時(shí)，蟲(chóng)螨腈以及氯氰菊酯、溴氰菊酯等菊酯類(lèi)農(nóng)藥的回收率低于70%。綜合考慮，選擇0.5 g無(wú)水MgSO4+40 mg PSA+40 mg C18+40 mg GCB作為分散固相萃取吸附劑，此條件下凈化效果最好，98%以上的農(nóng)藥回收率在70%～120%范圍內(nèi)。

圖2 無(wú)水MgSO4(A)、PSA(B)、C18(C)和GCB(D)不同添加量對(duì)53種農(nóng)藥回收率的影響

2.甲苯的加入對(duì)凈化效果的影響。在農(nóng)藥殘留檢測(cè)樣品前處理過(guò)程中，甲苯是固相萃取中常用的洗脫劑[3～4]，不僅可以調(diào)節(jié)洗脫能力，還能有效去除共提物中的干擾物。本研究利用甲苯此特點(diǎn)將其應(yīng)用于分散固相萃取法中，將提取液－甲苯（3∶1，體積比）加入分散固相萃取柱中凈化，在實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步凈化樣品、去除雜質(zhì)的同時(shí)也省去了溶劑轉(zhuǎn)換這一步驟。本研究考察了甲苯加入與否對(duì)凈化效果和萃取效率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)連續(xù)進(jìn)樣10次后，靈敏度急劇下降，乙酰甲胺磷、氟蟲(chóng)腈、異菌脲以及菊酯類(lèi)等農(nóng)藥幾乎沒(méi)有響應(yīng)，襯管內(nèi)壁富集大量雜質(zhì)。而在加入甲苯后，上述現(xiàn)象得到了很好的改善，第80次進(jìn)樣后各類(lèi)農(nóng)藥響應(yīng)強(qiáng)度僅下降10%以?xún)?nèi)，襯管內(nèi)壁沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的雜質(zhì)。故在凈化過(guò)程中加入甲苯，可使前處理操作過(guò)程更簡(jiǎn)化，同時(shí)也達(dá)到了顯著凈化效果，降低了GC系統(tǒng)中進(jìn)樣口和色譜柱的維護(hù)頻率。

（三）同位素內(nèi)標(biāo)校正在GC－MS/MS分析中，為獲得更為準(zhǔn)確的定量結(jié)果，經(jīng)常會(huì)用到同位素內(nèi)標(biāo)校正[16～18]，本研究選擇9種具有代表性的同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)。根據(jù)53種農(nóng)藥和9種內(nèi)標(biāo)物的出峰時(shí)間以及化學(xué)基團(tuán)類(lèi)似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)內(nèi)標(biāo)物的選擇經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)比較，最終確定53種農(nóng)藥所對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物情況見(jiàn)表1。

在低（0.01 mg/kg）、中（0.02 mg/kg）、高（0.10 mg/kg）3個(gè)加標(biāo)濃度水平下，分別比較芹菜、香菇、橙子3種基質(zhì)有內(nèi)標(biāo)和無(wú)內(nèi)標(biāo)定量下的加標(biāo)回收率情況。通過(guò)比較可知，無(wú)內(nèi)標(biāo)校正的情況下很多農(nóng)藥 （如水胺硫磷、o，p′－滴滴涕、p，p′－滴滴涕、五氯硝基苯、氟蟲(chóng)腈、異菌脲、菊酯類(lèi)農(nóng)藥等）在3種基質(zhì)中的回收率無(wú)法滿足測(cè)試要求，回收率在63%～145%，而采用相應(yīng)內(nèi)標(biāo)則能將回收率校正至70%～120%的合理范圍內(nèi)。因此，本研究采用9種同位素內(nèi)標(biāo)物定量法，進(jìn)一步解決基質(zhì)效應(yīng)所產(chǎn)生的影響。

（四）方法學(xué)考察

1.線性范圍、檢出限和定量限。準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為10～1 000 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化后的條件進(jìn)行測(cè)定，并以分析物的峰面積（y）對(duì)應(yīng)各農(nóng)藥的含量（x，μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程及相關(guān)系數(shù)（r2），結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，53種農(nóng)藥在10～1 000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.995）。以信噪比（S/N）＝3確定檢出限（LOD），以S/N＝10確定定量限（LOQ），得到本方法中53種農(nóng)藥的LOD為0.1～1.6 μg/kg，LOQ為0.3～5.3 μg/kg，均符合國(guó)內(nèi)相關(guān)殘留限量要求。

表2 53種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

續(xù)表2

2.回收率與精密度。在西藍(lán)花、辣椒、大蔥、香菇和橙子5種不同空白果蔬樣品中分別進(jìn)行3個(gè)水平0.01、0.02、0.10 mg/kg的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，53種農(nóng)藥的回收率為80.3%～119.6%，RSD≤12.0%，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，可滿足上述果蔬中53種農(nóng)藥的檢測(cè)要求。

表3 53種農(nóng)藥在5種果蔬中的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （n＝6）

（五）實(shí)際樣品檢測(cè)應(yīng)用所建方法對(duì)市售的15種果蔬（大白菜、芹菜、西藍(lán)花、辣椒、蘿卜、大蔥、絲瓜、生姜、番薯、刀豆、香菇、平菇、蘋(píng)果、草莓、葡萄）共100個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，53種農(nóng)藥的整體檢出率達(dá)11%，其中芹菜和草莓樣品中農(nóng)藥的檢出率較高，檢出頻率較高的農(nóng)藥為腐霉利、蟲(chóng)螨腈、氯氟氰菊酯、異菌脲、聯(lián)苯菊酯、苯醚甲環(huán)唑，但均未超過(guò)最大殘留限量。

續(xù)表3

續(xù)表3

續(xù)表3

三、 結(jié)論

本研究建立了氣相色譜－三重四極桿質(zhì)譜結(jié)合程序升溫－大體積進(jìn)樣模式測(cè)定果蔬中53種農(nóng)藥殘留的分析方法。該方法樣品前處理耗時(shí)短，基質(zhì)凈化效果顯著，在利用氣相色譜－三重四極桿質(zhì)譜結(jié)合程序升溫－大體積進(jìn)樣作為檢測(cè)手段后，靈敏度得到顯著提高。同時(shí)，該方法采用9種同位素內(nèi)標(biāo)法定量，進(jìn)一步消除了果蔬基質(zhì)效應(yīng)所產(chǎn)生的影響，降低了背景干擾，提高了分析準(zhǔn)確性，為果蔬中農(nóng)藥殘留的快速篩查提供了高效的前處理方法和分析檢測(cè)技術(shù)。