唐遠(yuǎn)江， 張 濤， 周思旋， 盧昱希， 楊茂生， 陶小艷， 趙 宇

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽(yáng) 550005)

杠板歸為蓼科蓼屬植物杠板歸(L.)全草，具有清熱解毒、止咳作用，用于肺熱咳嗽、水腫尿少、濕熱瀉痢等。杠板歸的主要化合物是黃酮類、有機(jī)酸類、萜類等，但《中國(guó)藥典(2020版)》規(guī)定該藥材的主要檢測(cè)物質(zhì)為槲皮素。杠板歸的煎煮劑、乙酸乙酯、正丁醇提取物對(duì)多種細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制作用，75%乙醇提取物具有廣譜抑菌活性，其中對(duì)耐藥性大腸桿菌的抑制作用明顯。

氟苯尼考抑菌能力強(qiáng)、吸收快，常作為仔豬腹瀉的預(yù)防保健藥，但長(zhǎng)期濫用使得耐藥性日益嚴(yán)重，導(dǎo)致其藥效不佳，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重影響，對(duì)人類健康也有嚴(yán)重危害。嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)狀及物理、化學(xué)方法消除細(xì)菌耐藥性時(shí)對(duì)人類及動(dòng)物的危害與日俱增，但中藥能有效消除細(xì)菌的耐藥性，同時(shí)這方面的研究能有效減少抗生素殘留，利于生產(chǎn)綠色動(dòng)物產(chǎn)品。

貴州杠板歸藥材資源豐富，前期研究表明杠板歸59.92%乙醇提取物對(duì)耐藥性大腸桿菌具有較強(qiáng)抑菌作用，因此，本研究對(duì)杠板歸提取物耐藥基因表達(dá)量的影響進(jìn)行探討，不僅可了解該基因畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的耐藥現(xiàn)狀，還可為杠板歸在中獸藥的開(kāi)發(fā)利用方面提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

大腸桿菌耐氟苯尼考菌株DF2、BY22、GL26、HS40、GP46分別從大方、白云、關(guān)嶺、惠水、高坡等豬場(chǎng)分離，大腸桿菌耐頭孢類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類菌株，均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑和藥品

LB培養(yǎng)基，批號(hào)100224；DNA Maker；細(xì)菌總DNA、RNA提取試劑盒；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)110957-20180；氟苯尼考，批號(hào)73231-34-2；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。杠板歸59.92%乙醇提取物，由筆者所在項(xiàng)目組前期試驗(yàn)研制。

1.3 主要儀器

Eppendorf AG熒光定量PCR儀，Veriti快速梯度PCR儀，廣州儀濤科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 藥品對(duì)大腸桿菌最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 本試驗(yàn)于2020年11月至2021年6月在貴州省畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室完成。試驗(yàn)時(shí)利用LB培養(yǎng)基將培養(yǎng)24 h菌液稀釋500～1 000倍，將菌液濁度調(diào)節(jié)至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬幤繁侗认♂尦?個(gè)梯度，接種稀釋后的菌液1 mL至藥液(陰性對(duì)照)、菌液(陽(yáng)性對(duì)照)、肉湯(空白對(duì)照)和試驗(yàn)組，搖勻后在37 ℃下培養(yǎng)16～18 h。每個(gè)藥物作雙樣品測(cè)定，每組試驗(yàn)中沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物濃度為MIC。

1.4.2 氟苯尼考對(duì)亞抑菌濃度藥物處理后大腸桿菌MIC值的測(cè)定 將耐藥大腸桿菌培養(yǎng)過(guò)夜，將1%菌液接種于LB液體培養(yǎng)基中，試驗(yàn)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組(培養(yǎng)基中加入提取物和槲皮素，使終濃度為亞抑菌濃度)，放置于37 ℃下培養(yǎng)5 h，測(cè)定方法同“1.4.1”節(jié)。

1.4.3 引物合成 參考文獻(xiàn)[16]的上游引物：5′-G C T C A A C G T G A G T T G G A T C A T A-3′，下游引物：5′-C A C T G C T G C T G A T G G C T C C T T T C-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。

1.4.4 DNA提取及質(zhì)粒構(gòu)建 將培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌菌液提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序并合成質(zhì)粒。

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建 根據(jù)重組質(zhì)粒的濃度和純度計(jì)算DNA拷貝數(shù)，倍比稀釋成1.0×10、100×10、1.0×10、1.0×10和1.0×10拷貝數(shù)質(zhì)粒，分別不同質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量RCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)拷貝數(shù)質(zhì)粒重復(fù)擴(kuò)增3次，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 34 s，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

表1 QPCR反應(yīng)體系

1.4.6 熔解曲線分析 在反應(yīng)完成后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，檢驗(yàn)是否存在引物二聚體或非特異性擴(kuò)增。

1.4.7 敏感性試驗(yàn) 將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍倍比稀釋，反應(yīng)完成后檢驗(yàn)檢測(cè)方法的敏感性，每個(gè)稀釋倍數(shù)作3個(gè)重復(fù)。

1.4.8 重復(fù)性和特異性試驗(yàn) 分別以大腸桿菌氟苯尼考、頭孢類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類耐藥菌株的DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)菌株重復(fù)檢測(cè)3次，檢驗(yàn)反應(yīng)方法的特異性。

1.4.9 樣品基因的表達(dá)量變化檢測(cè) 將大腸桿菌分別用1/2(高)、1/4(中)、1/8(低)MIC的杠板歸提取物和槲皮素處理，按照試劑盒說(shuō)明步驟提取供試大腸桿菌總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成CDNA。擴(kuò)增試驗(yàn)設(shè)計(jì)為組內(nèi)3次試驗(yàn)，考察樣品基因的含量變化。

2 結(jié)果

2.1 杠板歸提取物對(duì)大腸桿菌的MIC值

由表2可知，杠板歸提取物和槲皮素對(duì)5株大腸桿菌均有抑制作用，但提取物對(duì)DF2、BY22不如槲皮素，對(duì)GL26、GP46的抑菌活性強(qiáng)于槲皮素，2種藥品對(duì)HS40的抑菌活性相差不大。

表2 杠板歸提取物和槲皮素對(duì)大腸桿菌的MIC值

2.2 氟苯尼考對(duì)亞抑菌濃度藥物處理后大腸桿菌MIC值的影響

由表3可知菌株經(jīng)杠板歸提取物和槲皮素處理后氟苯尼考對(duì)菌液MIC值的變化。與對(duì)照組相比，DF2、HS40的MIC值分別下降51.38%、52.82%，BY22分別下降47.86%、73.57%，GL26的MIC值沒(méi)有變化，HS40的MIC值分別下降48.65%、52.70%，GP46分別下降76.76%、50.70%，試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明氟苯尼考對(duì)提取物處和槲皮素理后大腸桿菌的MIC值有不同影響，MIC值最高下降76.76%。

表3 氟苯尼考對(duì)大腸桿菌的MIC值變化

2.3 floR基因檢測(cè)及質(zhì)粒構(gòu)建

由圖1可知，通過(guò)基因檢測(cè)得出145 bp目的片段，無(wú)非特異性擴(kuò)增。產(chǎn)物測(cè)序后結(jié)果與GenBank中的基因序列比對(duì)，相似度為98.7%～100.0%。PCR產(chǎn)物測(cè)序并合成質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度為50.05 ng/μL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可知，熒光定量的線性回歸方程為=-3.02×lg拷貝數(shù)+28.77，=0.999 2。

2.5 熔解曲線分析

由圖3可知，熔解曲線分析結(jié)果的熔解溫度為85.1～88.6 ℃，無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。

2.6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

分別對(duì)1.0×10～1.0×10拷貝數(shù)含量的7種質(zhì)粒進(jìn)行基因熒光定量PCR反應(yīng)，由圖4可知，其靈敏度為1.0×10。

2.7 重復(fù)性和特異性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)建立的熒光定量方法檢測(cè)不同的大腸桿菌耐藥菌株，由圖5可知，大腸桿菌耐氟苯尼考菌株為陽(yáng)性，且重復(fù)性較好，大腸桿菌耐頭孢類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類菌株均為陰性，提示該檢測(cè)方法的特異性強(qiáng)、重復(fù)性好。

2.8 floR基因表達(dá)量變化分析

由表4可知，不同劑量藥物處理大腸桿菌耐藥菌株后，與對(duì)照組相比，低劑量處理組中5株菌的值無(wú)變化，中、高劑量組值下降，其中，高劑量組變化明顯。選取對(duì)照組和高劑量(1/2MIC)處理組的值，采用2-ΔΔ法計(jì)算藥物處理前后基因表達(dá)量變化，利用GraphPad Prism7軟件作圖，相對(duì)表達(dá)量數(shù)值高表示基因表達(dá)量變化小，數(shù)值低表示基因表達(dá)量變化大。由圖5可知，通過(guò)提取物和槲皮素處理后，5株耐藥菌株的基因表達(dá)量均下降，其中對(duì)于菌株DF2、GL26，提取物的基因表達(dá)量分別是對(duì)照組的0.869 8、0.847 9倍，低于槲皮素試驗(yàn)組的0.923 1、0.965 3倍，菌株BY22和GP46中提取物試驗(yàn)組表達(dá)量為對(duì)照組的0.900 0、0.911 6倍，高于槲皮素試驗(yàn)組的0.831 5、0.859 4倍，菌株HS40中2個(gè)試驗(yàn)組的基因表達(dá)量變化不大，分別為0.897 5、0.897 9倍，提取物對(duì)5株耐藥菌的基因表達(dá)量分別下降13.02%、10.00%、15.21%、10.25%和8.84%。試驗(yàn)結(jié)果提示杠板歸提取物和槲皮素可使豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因表達(dá)量下降，其表達(dá)量變化大小因菌株而異。

表4 藥物處理前后floR基因CT值

3 討論

中藥活性提取液與抗生素混合使用后，可明顯改善細(xì)菌的耐藥性消除作用。張秀英等將大腸桿菌耐恩諾沙星菌株接種于十大功勞木醇提取物的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，傳代培養(yǎng)3～5代后，藥物對(duì)試驗(yàn)菌株的MIC最高可降低32倍。采用1/2MIC的鐵冬青提取物傳代培養(yǎng)大腸桿菌，在第3代時(shí)氟苯尼考、阿莫西林和諾氟沙星等對(duì)試驗(yàn)菌株的MIC由 640 μg/mL 降至0.625 μg/mL以下，消除效果明顯。本研究通過(guò)試驗(yàn)得出杠板歸提取物和槲皮素對(duì)5株大腸桿菌均有抑制作用，氟苯尼考與提取物和槲皮素聯(lián)合作用后對(duì)5株大腸桿菌的MIC值可下降1/2或1/4，由此可見(jiàn)，聯(lián)合作用多次傳代培養(yǎng)后，提取物和槲皮素對(duì)氟苯尼考的耐藥消除作用明顯。

熒光定量PCR中絕對(duì)和相對(duì)定量法差異明顯，王大濤通過(guò)梅花鹿P21基因的檢測(cè)比較相對(duì)和絕對(duì)熒光定量PCR表明，絕對(duì)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性明顯優(yōu)于相對(duì)定量。由于本試驗(yàn)采用不同方法處理不同樣品從而得到目標(biāo)基因的表達(dá)量有差異，因此本試驗(yàn)采用絕對(duì)定量方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)量，同時(shí)根據(jù)基因序列建立豬熒光定量PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度達(dá)1.0×10拷貝數(shù)，確保基因表達(dá)變化的精確性。在計(jì)算基因表達(dá)量變化時(shí)，2-ΔΔ法必須引入看家基因作為內(nèi)參，檢測(cè)過(guò)程繁瑣且擴(kuò)增效率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果存在較大的影響，2-Δ聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算值方便，最能測(cè)得目的基因的表達(dá)量差異，同時(shí)也能節(jié)省試劑材料。

基因在能量驅(qū)動(dòng)下，細(xì)菌體內(nèi)產(chǎn)生外排泵將藥物或毒物排出體外，從而對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性，在耐藥菌株與敏感菌株間傳遞使得耐藥性廣泛傳播。多種中藥通過(guò)消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒而降低細(xì)菌的耐藥性，研究表明艾葉醇提液對(duì)耐慶大霉素大腸桿菌的耐藥質(zhì)粒消除率可達(dá)69.4%，從而使得慶大霉素對(duì)大腸桿菌有明顯抑制作用。本試驗(yàn)通過(guò)熒光定量方法得出藥品處理后基因表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)杠板歸提取物和槲皮素可使耐藥基因表達(dá)量明顯下降，其表達(dá)量變化大小因菌株而異，杠板歸提取物使5株菌的基因表達(dá)量分別下降13.02%、10.00%、15.21%、10.25%和8.84%，表明大腸桿菌基因表達(dá)量與其耐藥程度具有一定關(guān)系，且杠板歸提取物對(duì)改變大腸桿菌基因表達(dá)量與耐藥性具有一定作用，提示杠板歸提取物可作為大腸桿菌耐藥基因的抑制劑。杠板歸提取物由于是粗組分，很難闡述清楚該中藥對(duì)基因的消除機(jī)制，因此后續(xù)研究應(yīng)集中在藥材處理耐藥細(xì)菌后的代謝途徑、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組學(xué)進(jìn)行研究，深刻探討中藥的藥用機(jī)制，同時(shí)也為杠板歸開(kāi)發(fā)運(yùn)用及消除耐藥機(jī)制研究提供參考。