楊佳欣，張 濤，淦雨潔，許 佳，王思蘆，郝桂英，徐 睿，鄧 宇

（1.西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西昌 615000；2.涼山州畜科所，西昌 615000）

腸道病毒（Enterovirus，EV）能廣泛地感染牛、羊、豬、雞等家畜家禽及人類。腸道病毒屬共包括15個(gè)種，12個(gè)腸道病毒種（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L），3個(gè)鼻病毒種（A、B、C）[1]。牛腸道病毒（Bovine enterovirus，BEV）屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包含E種腸道病毒和F種腸道病毒，是不含囊膜結(jié)構(gòu)的單股正鏈RNA病毒，其中E種可劃分為E1-E4基因亞型，F(xiàn)種可劃分為F1-F6 基因亞型[2-3]。BEV基因組全長(zhǎng)7.3-7.5kb，包含一個(gè)5' 非編碼區(qū)（5' untranslated region，5'UTR），一個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF），3' 非編碼區(qū)（3' untranslated region，3'UTR），3'UTR的末端含有一個(gè)長(zhǎng)度有差異的多聚腺苷酸尾巴（poly-A），BEV的ORF可以直接作為mRNA翻譯出一個(gè)多聚蛋白，經(jīng)裂解，最終可以得到4種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）[4-6]。BEV在污水、糞便中可存活4～6個(gè)月，環(huán)境溫度越低存活時(shí)間越長(zhǎng)，在pH3.0的酸性環(huán)境中能保持自身活性，對(duì)一些常見的消毒劑如70%乙醇和5%甲酚溶液具有耐受力。但BEV對(duì)堿性環(huán)境和熱敏感，在pH10.0以上、高溫（50℃以上）和紫外線照射等條件下處理30 min會(huì)失去生物活性[7-9]。

攀西地區(qū)位于四川省西南部安寧河平原，轄涼山彝族自治州、攀枝花市等20個(gè)縣、市，屬于典型的高原型內(nèi)陸山區(qū)，以農(nóng)牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展為主，近年來該地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)在不斷調(diào)整，畜牧業(yè)產(chǎn)值占比持續(xù)上升，畜牧業(yè)生產(chǎn)中以奶牛和黑山羊養(yǎng)殖為主[10]。BEV呈世界范圍流行，在攀西地區(qū)迄今尚未見BEV感染報(bào)道，本研究通過對(duì)牛糞便樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)及遺傳進(jìn)化分析，初步揭示攀西地區(qū)BEV流行情況，為BEV的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 引物合成 根據(jù)GenBank中BEV 5'UTR序列，參考文獻(xiàn)[11]，合成1對(duì)引物，上游引物BEV-TUP-F：5'-GGGGAGTAGTCCGACTCCGC-3'，下游引物BEV-TDN-R：5'-CRGAGCTACCACYGGGDW TGTGG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小272 bp。

1.2 樣品的采集及處理 采集攀西地區(qū)牛新鮮糞樣本共93份，分別標(biāo)記暫存于冰盒內(nèi)，存于-20℃?zhèn)溆?。將新鮮牛糞樣品與生理鹽水按質(zhì)量與體積（W/V）1∶3稀，釋充分震蕩混勻，部分呈液狀的糞便樣本按體積之比1∶3，用生理鹽水進(jìn)行稀釋混勻。反復(fù)凍融3次，8500×g離心10 min，收集上清液，分別用0.22 μm微孔 PVDF濾膜過濾除菌，過濾后的樣本-80℃長(zhǎng)期保存。

1.3 主要儀器試劑 主要儀器：5804R低溫差速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)艾本德公司（Eppendorf），漩渦式混合器VORTEX-5，Eppendorf PCR儀，瓊脂糖凝膠電泳儀，BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)，藍(lán)光切膠儀，-80℃超低溫冰箱。主要試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑盒AccuPower?RocketScriptTM RT PreMix購(gòu)于BIONEER公司。UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、5×TBE buffer緩沖溶液、4S Green Plus無毒核酸染料、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker、瓊脂糖凝膠購(gòu)自上海生工公司。

1.4 RT-PCR擴(kuò)增 將處理后的糞便樣本上清分別用Trizol UNIQ-10柱式總RNA試劑提取試劑盒參照說明書提取樣本中的總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以下游引物（BEV-TDN-R)作為反轉(zhuǎn)錄引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40次循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳 用TBE緩沖液與瓊脂糖制備濃度為1%瓊脂糖凝膠，往膠孔中分別加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（6 μL）與marker（8 μL），105 mV電泳30～35 min，凝膠成像。

1.6 PCR產(chǎn)物回收 用干凈的手術(shù)刀片快速將疑似目的片段切割分離至1.5 mL離心管中，并稱重，切膠時(shí)要盡量去除不含有目標(biāo)片段的瓊脂糖凝膠。根據(jù)SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒說明書進(jìn)行DNA回收。

1.7 克隆測(cè)序 用T4 DNA連接酶將回收的DNA片段連接到T載體上，16℃過夜連接。將目的片段通過熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，37℃培養(yǎng)45 min，取菌液涂布于LB氨芐平板上，并加X-gal和IPTG，將平板于37℃培養(yǎng)16 h，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選試驗(yàn)，挑白色克隆菌群于LB液體培養(yǎng)基（含氨芐）中培養(yǎng)12 h，應(yīng)用PCR檢驗(yàn)菌液是否含有目的片段，將陽性質(zhì)粒送至上海杰李生物科技有限公司測(cè)序。

1.8 遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用 Lasergene DNA Star和MEGA-X軟件將樣本序列與國(guó)內(nèi)外其他地區(qū) BEV 代表性毒株5'UTR序列進(jìn)行同源性分析，繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 運(yùn)用RT-PCR方法對(duì)攀西地區(qū)采集的93份糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，1%瓊脂糖凝膠電泳成像，見圖1。結(jié)果顯示：攀西地區(qū)采集的93份牛糞便樣本中，13份樣本呈BEV陽性，感染率13.98%。

圖1 樣品 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR-amplified BEV 5'UTR from samples

2.2 同源性分析 將測(cè)定的樣本序列與 GenBank上國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的BEV基因序列，采用Cluster W算法進(jìn)行多序列比對(duì)，運(yùn)用Lasergene DNA Star進(jìn)行同源性分析，見表1。結(jié)果顯示：攀西地區(qū)牛場(chǎng)同一奶牛場(chǎng)存在 E種和F種BEV感染；攀西地區(qū)BEV分離株P(guān)X-161、PX-162、PX-163、PX-164與E種BEV代表病毒株具有較高的同源性，其中與國(guó)內(nèi)代表株HY12[7]同源性最高，其同源性為88.4%。

表1 攀西地區(qū)BEV分離株與國(guó)內(nèi)外BEV代表株同源性分析Table1 Homology analysis of BEV isolates in Panxi region with the representative BEV strains in China and abroad

攀西地區(qū)BEV分離株P(guān)X206、PX8311、PX8312、PX8313、PX8306、PX8307、PX8308、PX8268、PX8269與 F種EV代表株具有較高的同源性，部分毒株與國(guó)內(nèi)代表株BEV-HeN-YR91株[5]同源性最高，其同源性高達(dá)96.3%～96.6%。PX8268、PX8269與國(guó)內(nèi)代表株BJ001[18]株同源性最高達(dá)83.9%。攀西地區(qū)BEV分離株之間的同源性為75.5%～99.8%。

2.3 遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建 運(yùn)用MEGA-X軟件將比對(duì)后的序列采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，見圖2。結(jié)果顯示：分離株P(guān)X161、PX162、PX163、PX164與HY12[18]同屬一個(gè)分支，初步判斷這些分離株屬于E種EV。分離株P(guān)X206、PX8311、PX8312、PX8313、PX8306、PX8307、PX8308 與參考株BEV-HeN-YR91同屬一個(gè)分支，初步判定這些分離株為F種EV。PX8268、PX8269與BJ001[7]毒株分支長(zhǎng)度接近，同屬一個(gè)分支，初步判定為F種EV，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在攀西地區(qū)同一奶牛場(chǎng)內(nèi)存在E種和F種EV感染。

圖2 攀西地區(qū)BEV分離株與國(guó)內(nèi)外BEV代表株遺傳進(jìn)化樹Fig2.Genetic evolution tree of BEV isolates in Panxi area and representative BEV strains at home and abroad

3 討論

BEV 5'UTR是一段相對(duì)比較保守穩(wěn)定的基因序列，與其他種的腸道病毒5'UTR相比,在三葉草結(jié)構(gòu)與核糖體結(jié)合位點(diǎn)之間多了一個(gè)100個(gè)核苷酸左右的二級(jí)RNA結(jié)構(gòu)，常以此區(qū)域的特異性對(duì)不同種的腸道病毒進(jìn)行分子學(xué)鑒定[11-12]。同時(shí)有研究表明BEV 5'UTR、病毒衣殼蛋白VP1-VP4 與3D非結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸序列的差異，是BEV分型的重要參考依據(jù)[13]。BEV5'UTR中通過折疊形成的特異的空間結(jié)構(gòu)能與宿主細(xì)胞中一些蛋白子因子特異性結(jié)合，對(duì)病毒的復(fù)制翻譯轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生調(diào)控作用[14-15]，影響B(tài)EV的毒力及易感動(dòng)物的范圍。

Moll等[16]首次發(fā)表了BEV感染的相關(guān)報(bào)道，李英利等[17]在內(nèi)蒙古腹瀉犢牛體內(nèi)分離到我國(guó)第1 株F種BEV。2012年邢澤黎等[7]從吉林長(zhǎng)春某發(fā)病牛群中首次在我國(guó)牛群中分離出E種EV HY12毒株與本研究所分離的E種EV同源性高達(dá)88.4%。彭小薇等[18]在北京分離出的BJ001與本次分離的PX8268、PX8269同屬F種，有較高的同源性達(dá)88.4%，2018年錢明珠[5]在河南省分離了兩株F種EV毒株，其中BEVHeN-YR2毒株與攀西地區(qū)分離的F種毒株的同源性高達(dá)96.3%～96.6%。這些報(bào)道表明BEV在我國(guó)多個(gè)省市的牛群中存在著普遍感染現(xiàn)象，報(bào)道中不同的省市地區(qū)多呈現(xiàn)BEV單種感染，但在本研究中，攀西地區(qū)BEV感染率13.98%，存在E種和F種EV感染，其中以F種EV感染為主。

目前關(guān)于BEV的致病性還存在部分爭(zhēng)議，致病機(jī)制也尚未明確。部分學(xué)者認(rèn)為BEV和其他的小RNA腸道病毒屬的病毒一樣，是導(dǎo)致宿主誘發(fā)消化道和呼吸道疾病的相關(guān)病原體，牛群在感染BEV后可引起食欲減退，下痢和呼吸道癥狀，嚴(yán)重的還會(huì)出現(xiàn)便血、產(chǎn)奶量大幅度降低等臨床癥狀[4]，有的學(xué)者認(rèn)為BEV的致病機(jī)制主要是誘導(dǎo)宿主體內(nèi)產(chǎn)生了大量有害的炎癥因子，對(duì)機(jī)體的生理功能造成損害[19]。但之前也有部分報(bào)道稱BEV廣泛存在于自然界中，是牛腸道中原有的棲居者，在牛的腸道中增殖，致病性不明顯，常呈隱性感染或只引起輕度腹瀉。本研究中BEV陽性牛無明顯臨床癥狀。但BEV感染在我國(guó)還屬于新發(fā)傳染病，其致病性有待后續(xù)進(jìn)一步研究。