張旭財(cái)，李燕紅，陸毅興，常 依，謝龍飛，曾振靈，熊文廣

（1.廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2.國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)（環(huán)境評(píng)估）實(shí)驗(yàn)室（華南農(nóng)大），廣州 510642；3.國(guó)家獸醫(yī)微生物耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；4.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

鴨疫里氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一種革蘭陰性、無芽孢、無鞭毛的桿狀細(xì)菌。在受感染動(dòng)物中能夠引起以纖維素性心包炎、肝周炎和腦膜炎等炎癥反應(yīng)為主要病變的鴨疫里氏桿菌病[1]。該病傳染性強(qiáng)、病死率高，在世界范圍內(nèi)引起養(yǎng)鴨業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

疫苗免疫是防控鴨疫里氏桿菌病的主要手段之一，然而目前的研究證明RA的血清型眾多，并且不同血清型之間無明顯的交叉保護(hù)。此外，部分疫苗的研制還面臨成本較高和推廣困難的問題，極大的提升了用疫苗來防控鴨疫里氏桿菌病的難度[3-4]。目前，我國(guó)仍廣泛使用抗菌藥物治療鴨疫里氏桿菌病。但是，隨著抗菌藥物的廣泛使用甚至是濫用，細(xì)菌耐藥性問題也隨之產(chǎn)生[5-6]。不同地區(qū)分離株的耐藥狀況存在差異，為了在養(yǎng)殖過程中有效防控鴨疫里氏桿菌病，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)我國(guó)水禽養(yǎng)殖場(chǎng)RA耐藥性監(jiān)測(cè)。

本研究以廣東省肇慶市4個(gè)鴨場(chǎng)作為研究對(duì)象，采集疑似感染鴨疫里氏桿菌的病鴨進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、耐藥基因檢測(cè)、毒力基因檢測(cè)和ERIC-PCR分型研究，為了解RA流行病學(xué)分布和指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 14株鴨疫里氏桿菌分離自廣東省肇慶市的4個(gè)鴨場(chǎng)，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；新生胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；革蘭氏染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DNA marker、2×TaqPCR Master Mix均購(gòu)自東盛生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）、10×PCR buffer（Mg+plus）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖購(gòu)自西班牙Biowest公司；慶大霉素（含量590 IU/mg）、頭孢喹肟（含量98%）、安普霉素（含量99%）、阿莫西林（含量99%）、頭孢噻肟（含量98%）、新霉素（含量92%）、黏菌素（6500 IU/mg）、環(huán)丙沙星（含量99%）購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司；頭孢他啶（含量98%）、氟苯尼考（含量95%）、阿米卡星（含量97%）、恩諾沙星（含量98.5%）、多西環(huán)素（含量97%）、替加環(huán)素（含量98%）均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；磺胺甲噁唑（含量99.0%）、甲氧芐啶（含量98.0%）購(gòu)于廣東翔博生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng) 用滅菌的接種環(huán)蘸取疑似感染RA的病死鴨的腦組織、肺臟、心臟，劃線接種于含有5%新生牛血清的TSA平板上，置于5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24～48 h。挑取呈圓形突起、表面光滑、邊緣整齊的單菌落接種于含有5% 新生牛血清的TSA平板上，置于5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24～48 h，選取疑似單菌落接種于含有5%新生牛血清的TSB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜后進(jìn)行純化培養(yǎng)和鑒定。

1.4 細(xì)菌染色鏡檢 蘸取純化培養(yǎng)后的菌液涂布于載玻片中，經(jīng)革蘭染色，鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5 細(xì)菌PCR鑒定 取200 μL純化培養(yǎng)后的菌液于2 mL的無菌EP管中，使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組。根據(jù)文獻(xiàn)[7]合成鑒定引物ompA基因序列，（RA-F：5'-CTTGGTATCCAAG GGGATTATGTTT-3'；RA-R：5'-TTTAACT GAGATGGGTTAACACCTC-3'）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以細(xì)菌DNA為模板，反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，10.5 μL ddH2O，1 μL模板。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s, 72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存圖片，且將PCR陽性產(chǎn)物送至測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。

1.6 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（clinical and laboratory standards institute，CLSI）的指導(dǎo)原則，采用瓊脂稀釋法對(duì)14株分離菌進(jìn)行15種抗菌藥物最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定，試驗(yàn)過程中每種藥板設(shè)置三個(gè)平行，以ATCC25922作為質(zhì)控菌株。由于缺少CLSI批準(zhǔn)的適用于RA的藥物敏感折點(diǎn)值，本試驗(yàn)所用藥物的質(zhì)控范圍及敏感折點(diǎn)值主要參考CLSI-2018中大腸桿菌、巴氏桿菌的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)鴨疫里氏桿菌耐藥性的相關(guān)文獻(xiàn)。

1.7 耐藥基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[8-9]合成氨基糖苷類(aac(6')-Ib、aph(3')-Ⅱ)、β-內(nèi)酰胺類(blaSHV、blaDHA)、喹諾酮類(qnrA、qnrB)、四環(huán)素類(tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(X))、磺胺類(sul1、sul2)以及酰胺醇類(floR)，6大類 13對(duì)耐藥基因引物，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/ L）各0.5 μL，10.5 μL ddH2O，1 μL模板。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火（退火溫度詳見表）30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1% 瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存圖片。

表1 耐藥基因引物序列信息Table 1 Sequence information of drug resistance gene primers

1.8 毒力基因檢測(cè) 以利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取的DNA為模板，用表2所示引物[10]分別擴(kuò)增CAMP、wza、AS87_04050、Fur、SIP、TbdR1和luxE基因。PCR反應(yīng)體系及條件同1.7。

表2 毒力基因引物序列信息Table 2 Sequence information of virulence gene primers

1.9 ERIC-PCR分型 參考文獻(xiàn)[11]合成通用引物ERIC-1R（5'-ATGTAACTCCTGGGGATTCAC-3'）和ERIC-2R（5'-AAGTAAGTGACTGGGGTA GCG-3'），構(gòu)建25 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol) 2 μL，上下游引物各0.5 μL，E×Taq酶0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 17 μL。經(jīng)過優(yōu)化的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性7 min；95℃變性45 s，52℃退火60 s，65℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，拍照保存，并對(duì)其進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與鏡檢結(jié)果 分離菌在含有5%新生牛血清的TSA平板表現(xiàn)為圓形突起、邊緣整齊光滑、奶油狀菌落。分離菌經(jīng)革蘭氏染色后，顯微鏡下呈革蘭氏陰性，不能運(yùn)動(dòng)，短桿狀，單個(gè)或成對(duì)排列（圖1）。

圖1 分離菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.1 Gram staining results of isolated strains

2.2 PCR鑒定結(jié)果 以疑似菌株的DNA作為模板，使用鴨疫里氏桿菌OmpA基因特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物條帶大小約為707 bp（圖2），序列經(jīng)比對(duì)后確定為鴨疫里氏桿菌。采用“菌株種屬+鴨場(chǎng)編號(hào)+序號(hào)”的方式命名。以GDRA-A-1為例，其為廣東肇慶A鴨場(chǎng)分離得到。

圖2 細(xì)菌OmpA基因鑒定電泳圖Fig.2 Identification of OmpA gene

2.3 藥物敏感性的測(cè)定 以瓊脂稀釋法測(cè)定14株RA對(duì)15種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明（表3），14株RA對(duì)新霉素、安普霉素、恩諾沙星、替加環(huán)素和復(fù)方新諾明耐藥率最高，耐藥率均達(dá)100%；對(duì)阿莫西林、頭孢他啶、環(huán)丙沙星敏感性較高，分別為100%、100%和92.86%。

表3 分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Drug susceptibility test results of isolated strains

2.4 耐藥基因的檢測(cè) 使用PCR對(duì)分離得到的RA進(jìn)行13種耐藥基因檢測(cè)，RA攜帶耐藥基因情況見表4。14株RA均攜帶四環(huán)素類耐藥基因tet(X)和酰胺醇類耐藥基因floR。其次，四環(huán)素類耐藥基因中，除了tet(B)的檢出率為64.29%以外，其余的2種耐藥基因tet(A)、tet(C)均未被檢出。磺胺類耐藥基因中，sul1的檢出率為50.00%，而sul2未被檢出；在所有分離的RA中，氨基糖苷類耐藥基因aac(6')-Ib、aph(3')-Ⅱ，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaSHV、blaDHA，喹諾酮類qnrA、qnrB均未被檢出。

表4 分離菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection rate of resistance genes of isolated strains

2.5 毒力基因檢測(cè)結(jié)果 利用PCR檢測(cè)分離株攜帶的毒力基因，14株RA的毒力基因檢出率如圖3所示。其中，毒力基因AS87 _04050、wza和luxE的檢出率分別高達(dá)100%、100%和92.86%。此外，毒力基因CAMP、SIP、Fur的檢出率分別為7.14%、50.00%和85.71%，但14株RA中均未檢測(cè)出毒力基因TbdR1。

圖3 14株分離株毒力基因檢出率Fig.3 Virulence genes detection rate of 14 isolates

2.6 ERIC-PCR及聚類分析結(jié)果 14株RA分離株ERIC-PCR結(jié)果顯示（圖4），所有分離株均能擴(kuò)增出條帶，數(shù)目在1～9條不等，擴(kuò)增片段濃度存在差異。聚類分析結(jié)果顯示（圖4），按90%的相似性可分為7個(gè)基因型，相同地區(qū)分離的菌株大部分聚集在同一分支。

圖4 14株RA ERIC-PCR電泳結(jié)果聚類分析Fig.4 Cluster analysis of electrophoresis results of 14 RA ERIC-PCR strains

3 討論

目前，抗菌藥物在治療鴨疫里氏桿菌病中仍然發(fā)揮著重要作用。但長(zhǎng)期不合理使用甚至濫用抗菌藥使得細(xì)菌耐藥性問題愈發(fā)嚴(yán)重。因此，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)有效治療鴨疫里氏桿菌至關(guān)重要。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，安徽省部分地區(qū)分離株對(duì)新霉素、慶大霉素、卡那霉素表現(xiàn)高度耐藥；對(duì)頭孢拉定、頭孢他啶、大觀霉素表現(xiàn)敏感[12-13]。董洪燕等[14]在江蘇省地區(qū)分離的RA均對(duì)新霉素、慶大霉素、卡那霉素耐藥；對(duì)頭孢曲松、頭孢拉定、氟苯尼考敏感，敏感率達(dá)90%。貴州省分離株對(duì)慶大霉素、阿奇霉素、紅霉素耐藥；對(duì)頭孢氨芐、頭孢曲松敏感[10,15]。廣東分離株對(duì)卡那霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、慶大霉素的耐藥率81.25%～91.67%，其中54.17%的分離株多重耐藥數(shù)目達(dá)9耐和10耐[16]。本研究藥敏結(jié)果顯示，所有分離株對(duì)氨基糖苷類藥物（新霉素、慶大霉素、安普霉素）高度耐藥；對(duì)阿莫西林、頭孢他啶、環(huán)丙沙星高度敏感；分離株多重耐藥數(shù)目最高達(dá)10耐。本研究分離株主要耐藥藥物與上述不同省份的結(jié)果大致相同，但主要敏感藥物卻不同。因此，加強(qiáng)不同地區(qū)水禽養(yǎng)殖場(chǎng)RA藥敏監(jiān)測(cè)十分重要。同時(shí)值得注意的是，替加環(huán)素目前僅批準(zhǔn)用于人醫(yī)臨床，但近些年已有報(bào)道在不同動(dòng)物源細(xì)菌中出現(xiàn)替加環(huán)素耐藥[17]，本次分離的RA均對(duì)替加環(huán)素耐藥也暗示了應(yīng)該采取措施防止重要抗菌藥物的耐藥菌在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中傳播與擴(kuò)散。

耐藥基因檢測(cè)是當(dāng)前研究細(xì)菌耐藥性傳播的重要手段。本研究中，13種耐藥基因僅檢測(cè)出4種，耐藥表型與耐藥基因的相關(guān)性不盡相同。14株RA分離株對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥表型為高度耐藥，而所有分離株均未檢測(cè)出氨基糖苷類耐藥基因aac(6')-Ib、aph(3')-Ⅱ，這與肖琨等[18]的研究結(jié)果相似。這可能是菌株通過其他機(jī)制介導(dǎo)耐藥或同類的其他耐藥基因介導(dǎo)有關(guān)[19]。此外，除了β-內(nèi)酰胺類耐藥基因陽性率與耐藥率相關(guān)性較高外，喹諾酮類、磺胺類、酰胺醇類耐藥基因陽性率與耐藥率的相關(guān)性較差，這可能是基因隱性表達(dá)、基因不表達(dá)或其他外界環(huán)境因素所致。值得注意的是，14株RA均攜帶tet(X)耐藥基因，這與吳彩艷等[16]研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥株的tet(X)耐藥基因高攜帶率相似。有研究發(fā)現(xiàn)，RA可以攜帶多種tet型耐藥基因，并且可能是tet(X)耐藥基因的儲(chǔ)存庫。tet(X)亞型至今已發(fā)現(xiàn)約48種，不同的tet(X)亞型可能從鴨傳播到其他動(dòng)物以及人類身上[20-21]。對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)從業(yè)人員來說，長(zhǎng)期暴露在攜帶tetX細(xì)菌污染的環(huán)境中是存在風(fēng)險(xiǎn)的。

菌株攜帶毒力基因的數(shù)量對(duì)細(xì)菌的致病性與毒力產(chǎn)生影響。近些年來，越來越多RA相關(guān)毒力基因的研究報(bào)道，有關(guān)RA毒力基因的研究也為研制新型疫苗以及防控措施提供新思路[22-24]。本研究共檢測(cè)了7種RA相關(guān)毒力基因，同一鴨場(chǎng)分離的RA攜帶不同的毒力基因，不同鴨場(chǎng)分離的菌株也有攜帶相同毒力基因的情況，但是，14株分離株中均未檢測(cè)出TonB1依賴受體TbdR1，這其中的復(fù)雜機(jī)制有待進(jìn)一步研究。對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，攜帶毒力基因最多的GDRA-A-3并不是多重耐藥數(shù)目最多的菌株。同時(shí)，簡(jiǎn)單對(duì)比菌株多重耐藥與攜帶毒力基因數(shù)量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者間并不存在明顯相關(guān)。

ERIC-PCR是一種快速、可靠的基因分型方法，可在RA流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)揮作用[25]。本研究中，14株分離株均成功分型?？梢园l(fā)現(xiàn)，GDRA-B-1、GDRA-C-1和GDRA-D-2來自不同鴨場(chǎng)，其相似性大于90%，這揭示其可能具有相同的起源，隨后通過鴨苗、人員等其他途徑在不同的鴨場(chǎng)中傳播，這也證實(shí)了耐藥菌的傳播風(fēng)險(xiǎn)。此外，分離自同一鴨場(chǎng)的RA擁有不同的基因型，證明了一個(gè)鴨場(chǎng)存在著多種基因型的RA，這也給臨床防控帶來困難。

科學(xué)防控鴨疫里氏桿菌與遏制細(xì)菌耐藥性問題已刻不容緩，因此需加強(qiáng)對(duì)不同地區(qū)鴨疫里氏桿菌的耐藥性監(jiān)測(cè)，進(jìn)而為臨床合理用藥提供依據(jù)。同時(shí)，加強(qiáng)細(xì)菌耐藥機(jī)制研究和研發(fā)抗菌藥替代品尤為重要。