王 颯，屈 陽，孟春春，仇旭升，廖 瑛，譚 磊，宋翠萍，劉煒瑋，孫英杰，丁 鏟

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100）

先天性免疫是細(xì)胞抵御病毒感染的第一道防線，病毒感染細(xì)胞后，模式識別受體（RIG-I、TLR3、cGAS等）識別病毒的病原相關(guān)分子模式，通過接頭蛋白（MAVS、STING等）、信號傳遞蛋白（TBK1、IKK等）、轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB、IRF-3等）轉(zhuǎn)錄出促炎細(xì)胞因子和干擾素（Type I interferon, IFN），其中IFN通過自分泌或旁分泌途徑與細(xì)胞表面IFN受體（IFN receptor, IFNR）結(jié)合，激活下游JAK-STAT途徑，促使大量干擾素刺激基因的表達，發(fā)揮抗病毒作用[1-2]。IFN是一種分泌性的糖蛋白，家族成員分為三類，即I型、Ⅱ型及Ⅲ型IFN[3]，其中I型干擾素IFN-β是機體重要的細(xì)胞因子，在抗病毒天然免疫中發(fā)揮重要作用[4-5]。IFN-β作為通路激活的效應(yīng)蛋白和指征蛋白，IFN-β啟動子活性則是通路是否激活的重要指標(biāo)，因此含IFN-β啟動子的報告基因系統(tǒng)成為不可或缺的工具。目前普遍采用的報告基因系統(tǒng)是Promega公司的PGL3螢火蟲熒光素酶系統(tǒng)[6]，以此載體為骨架，插入IFN-β啟動子，獲得可用于檢測IFN-β啟動子活性的質(zhì)粒，用于瞬時轉(zhuǎn)染[7]。但這一過程繁瑣，每次實驗都需轉(zhuǎn)染步驟，并且需要裂解細(xì)胞后才能對熒光素酶進行檢測。

Gaussia luciferase（Gluc）是近年來發(fā)現(xiàn)的熒光素酶家族中最小的成員，能夠催化氧化腔腸素，該酶的發(fā)射光譜寬，能夠發(fā)出波長為480 nm的藍(lán)色熒光[8-9]。與螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase,fluc）和海腎熒光素酶（renilla luciferase, Rluc）相比，Gluc的發(fā)光強度更高[9]，檢測靈敏度更好，穩(wěn)定性高，最重要的是Gluc可分泌到細(xì)胞外，無需裂解細(xì)胞，可直接利用上清液進行檢測，操作更為簡便，使Gluc得到廣泛的應(yīng)用，如哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染的檢測[10]、研究蛋白互作和定位、siRNA沉默技術(shù)、啟動子活性的監(jiān)測、評價腫瘤模型藥物的療效、實時監(jiān)測腫瘤發(fā)生發(fā)展情況和高通量藥物篩選等[11-12]。為了建立一種新型、簡易、穩(wěn)定的IFN-β啟動子活性檢測方法，本研究將人IFN-β基因啟動子以及下游Gluc克隆至慢病毒載體中，構(gòu)建穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc的A549細(xì)胞株，進一步通過篩選和功能鑒定獲得IFN-β-Gluc穩(wěn)定誘導(dǎo)性表達的單克隆細(xì)胞株。該細(xì)胞系提供了檢測IFN通路激活的簡易方法，為進一步研究病毒誘導(dǎo)IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄、調(diào)控，動態(tài)監(jiān)測IFN-β啟動子活性，高通量篩選等研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、病毒和細(xì)胞 pHAGE-bsd慢病毒載體購自蘇州金唯智生物科技有限公司；根據(jù)公布的人源IFN-β基因啟動子序列（GenBank登錄號：V00534）起始密碼子上游209 bp的啟動子序列與Gluc基因序列（Genbank登錄號：LC006266.1），將兩者耦聯(lián)序列IFN-β-Gluc交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；質(zhì)粒：p3ⅹFlag-CMV-14、pCMV-HA質(zhì)粒為Clontech公司產(chǎn)品，F(xiàn)lag-V、HAMAVS和HA-TBK1由本實驗室構(gòu)建并保存，pMD2.G、psPAX2為Addgene公司產(chǎn)品。A549、HEK-293T細(xì)胞系購自美國ATCC生物標(biāo)準(zhǔn)品資源中心，用DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific）（含10%胎牛血清），在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）Herts/33毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌DH5α、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小提中量試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒及血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）購自購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 主要試劑SpeI和XbaI內(nèi)切酶為美國NEB公司產(chǎn)品；同源重組試劑盒為蘇州金唯智生物科技有限公司產(chǎn)品；PCR Mix為廣州東盛生物公司產(chǎn)品；Gaussia Luciferase Cellular Assay Kit購自美國Abcam公司；殺稻瘟菌素（Blastincidin, BSD）、Lipofectamine 2000、氨芐青霉素、Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Thermo公司產(chǎn)品；聚凝胺（polybrene）購自美國Sigma公司；胎牛血清購自以色列BI公司。

1.3 重組表達載體pHAGE-IFN-β-Gluc的構(gòu)建 分別用限制性核酸內(nèi)切酶SpeI和XbaI對載體pHAGE-bsd和合成的IFN-β-Gluc片段雙酶切，將酶切后線性載體與IFN-β-Gluc片段通過同源重組進行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR檢測陽性菌落，擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。用限制性核酸內(nèi)切酶SpeI和XbaI酶切鑒定并送測序，測序比對成功后，根據(jù)無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書提取質(zhì)粒備用。

1.4 慢病毒包裝 取對數(shù)生長期HEK-293T細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，細(xì)胞密度約為2×105cells/mL。24 h后待細(xì)胞密度為80%時，替換為Opti-MEM。使用Lipo2000轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的慢病毒重組質(zhì)粒（pHAGEIFN-β-Gluc）及輔助質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染量為pMD2.G為12 μg、psPAX2為10 μg、pHAGE-IFN-β-Gluc為22 μg，培養(yǎng)8 h，換為10% FBS DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞狀態(tài)，分別于48、72 h各收取上清液一次，將兩次所得上清液混勻，1000×g離心5 min，使用0.22 μm微孔濾膜過濾后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc細(xì)胞株的篩選 將A549細(xì)胞接種于6孔板，待第2 d感染時，使細(xì)胞長至60%。感染前棄上清液，使用無菌PBS，清洗1～2遍，換為慢病毒液培養(yǎng)，并加入8 μg/mL的polybrene輔助感染；24 h后更換含10%FBS的完全培養(yǎng)基。感染72 h后，加BSD篩選培養(yǎng)，約3 d后未經(jīng)感染的對照組細(xì)胞全部死亡，感染組細(xì)胞有陽性克隆長出；利用96孔板有限稀釋法將多克隆細(xì)胞進行梯度稀釋至每孔含有0.5～1個細(xì)胞，連續(xù)觀察培養(yǎng)7～10 d，挑選單克隆細(xì)胞，擴大培養(yǎng)后得到穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc的A549細(xì)胞系。

1.6 IFN-β-Gluc單克隆細(xì)胞株的PCR鑒定 收集經(jīng)亞克隆后的IFN-β-Gluc細(xì)胞，使用血液/組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取單克隆細(xì)胞基因組DNA。根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫報道的Gluc（GenBank登錄號：LC006266.1）全長序列，設(shè)計以對引物，正向引物5'-ATGGGAGTCAAAGTTCTG-3'，反向引物為5'-TTAGTCACCACCGGCCCC-3'。進行PCR擴增。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共循環(huán)35次；最后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.7 IFN-β-Gluc單克隆細(xì)胞株熒光素酶活性驗證 將待檢的細(xì)胞按1.5×105cells/mL鋪板，18～24 h后，使用poly(I:C) 處理、NDV感染或轉(zhuǎn)染MAVS等先天性免疫分子。24 h后收集細(xì)胞上清液，離心去除細(xì)胞碎片，根據(jù)Gluc分析試劑盒，用發(fā)光檢測儀測定其相對光強度（relative light unit, RLU）。

1.8 單克隆細(xì)胞株穩(wěn)定性的驗證 復(fù)蘇篩選所得的IFN-β-Gluc陽性克隆細(xì)胞株，進行連續(xù)傳代，利用PCR檢測第3、5、10、15、20代細(xì)胞中Gluc基因，使用NDV感染及poly(I:C) 刺激傳代細(xì)胞，利用Gluc分析試劑盒，檢測細(xì)胞上清液中Gluc酶活性的變化。

1.9 數(shù)據(jù)分析 采用GraphPad Prism 5軟件的one-way ANOVA方法進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05，差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pHAGE -IFN-β-Gluc慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果 為了獲得穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc的慢病毒質(zhì)粒，通過SpeI和XbaI兩個酶切位點，將pHAGE-ISRE質(zhì)粒中的EF-1α啟動子和下游CDS插入位點與IFN-β-Gluc序列同源重組，獲得重組慢病毒質(zhì)粒（圖1A）。經(jīng)SpeI和XbaI雙酶切后得到約6800 bp和800 bp兩條條帶（圖1B），與預(yù)期結(jié)果一致，陽性克隆送至生工生物工程（上海）有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒擴大保存，并命名為pHAGE-IFN-β-Gluc。

圖1 pHAGE-IFN-β-Gluc慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建及PCR鑒定Fig.1 Construction and PCR identification of pHAGE-IFN-β-Gluc lentivirus plasmid

2.2 穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc的A549單克隆細(xì)胞篩選 將pHAGE-IFN-β-Gluc重組表達載體與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞包裝成慢病毒，感染目標(biāo)細(xì)胞A549，經(jīng)殺稻瘟菌素篩選后得到多克隆細(xì)胞；通過有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞；利用試劑盒提取單克隆細(xì)胞的基因組DNA，根據(jù)Gluc序列設(shè)計引物檢測所得單克隆細(xì)胞中Gluc基因片段，PCR結(jié)果顯示篩選到15個疑似陽性克隆，Gluc片段整合到細(xì)胞基因組中（圖2A）。將轉(zhuǎn)染空載的A549細(xì)胞和PCR檢測陽性單克隆細(xì)胞計數(shù)，使用1 MOI的NDV病毒感染或poly(I:C)（2 μg/mL）刺激細(xì)胞30 h后，使用Gluc檢測試劑盒檢測上清液中Gluc活性。從所獲得的15株單克隆細(xì)胞中檢測獲得兩株單克隆細(xì)胞（#13、#14）經(jīng)NDV及poly(I:C) 刺激后與空白組相比，Gluc的表達均顯著上調(diào)（圖2B），相比較之下，盡管其他疑似陽性克隆中有較高水平的Gluc表達，但與對照組相比，病毒和poly(I:C)刺激后未出現(xiàn)顯著上調(diào)，因此將其舍棄。提取#13和#14克隆提取細(xì)胞基因組進一步測序鑒定，設(shè)計引物上游：5'-GGCGACACTGTTCGTGTTGT-3'；下游：5'-TTAGTCACCACCGGCCCCCT-3'。測序結(jié)果與Gluc序列一致性100%，說明外源Gluc序列整合到#13和#14單克隆細(xì)胞基因組中。#13細(xì)胞空白處理組與#14細(xì)胞相比，其空白組Gluc的表達水平相對較低，且與空白組相比，處理組Gluc表達量極顯著升高，因此選擇#13細(xì)胞進行后續(xù)試驗。

圖2 穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc的A549單克隆細(xì)胞篩選Fig.2 Screening of monoclonal cells stably expressing IFN-β-Gluc

2.3 穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc的A549單克隆細(xì)胞功能驗證 為進一步驗證篩選得到的穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc單克隆細(xì)胞的功能，將細(xì)胞經(jīng)傳3代后，首先通過正向誘導(dǎo)實驗驗證：MAVS和TBK1是RIG-I信號通路中重要的信號分子，直接轉(zhuǎn)染MAVS和TBK1能夠顯著誘導(dǎo)下游信號通路的活化，激活I(lǐng)FN-β的表達（圖3A）。因此，首先轉(zhuǎn)染HA-MAVS、HA-TBK1質(zhì)粒后，對Gluc熒光酶活性進行檢測，HA空載體（HA-vec）作為陰性對照。結(jié)果顯示：與對照組相比，MAVS和TBK1均顯著上調(diào)Gluc活性（圖3B）。進一步通過反向抑制實驗驗證：NDV的V蛋白能夠通過降解MAVS抑制下游信號通路的活化。因此，首先轉(zhuǎn)染HA-MAVS刺激干擾素通路激活，同時轉(zhuǎn)染不同濃度Flag-V（0、200、400 ng），對Gluc熒光酶活性進行檢測，結(jié)果顯示，上清液中Gluc酶活性與Flag-V的轉(zhuǎn)染劑量呈負(fù)相關(guān)且具有濃度梯度依賴性（圖3C）。

圖3 穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc的A549單克隆細(xì)胞功能驗證Fig.3 Functional verification of A549 monoclonal cells stably expressing IFN-β-Gluc

2.4 表達IFN-β-Gluc的A549細(xì)胞系穩(wěn)定性驗證 為驗證篩選所得的陽性單克隆細(xì)胞能否穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc，復(fù)蘇篩選所得的#13陽性克隆細(xì)胞，進行連續(xù)傳代，并對第3、5、10、15和20代細(xì)胞分別從基因和蛋白的水平檢測Gluc，以野生型A549細(xì)胞為陰性對照，利用PCR檢測陽性克隆細(xì)胞中Gluc基因，結(jié)果顯示陽性克隆細(xì)胞中Gluc基因在傳代過程中未發(fā)生明顯改變（圖4A）；使用NDV或poly(I:C)作為刺激物，誘導(dǎo)IFN-β的表達，檢測上清液中Gluc熒光酶活性，結(jié)果顯示，連續(xù)傳代細(xì)胞經(jīng)NDV或poly(I:C)刺激后，細(xì)胞上清液中Gluc熒光酶活性未發(fā)生顯著變化（圖4B）。

圖4 穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc的A549細(xì)胞系的穩(wěn)定性驗證Fig.4 Verified of the A549 cell line stably expressing IFN-β-Gluc

3 討論

報告基因是指表達產(chǎn)物容易被鑒定的基因，其工作原理是把報告基因與調(diào)控序列或其他目的基因融合形成嵌合基因，通過檢測分析報告基因的表達產(chǎn)物來標(biāo)定目標(biāo)基因的表達。常用的報告基因有顯示定位的熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP），紅色熒光蛋白（red fluorescent protein, RFP）等[13]，以及能用于定量的熒光素酶基因，例如Fluc，Rluc等[14]。與常用的定量報告基因Fluc、Rluc相比，Gluc屬于分泌型熒光素酶，具有諸多優(yōu)點如：測量酶活性時不需要裂解細(xì)胞，能夠?qū)崿F(xiàn)對實驗對象的連續(xù)觀察；基因片段小，僅有185個氨基酸殘基的單鏈多肽[8]，不影響載體的轉(zhuǎn)化效率；無細(xì)胞毒性，與其他目的片段融合轉(zhuǎn)化細(xì)胞，對細(xì)胞和動物無影響，可進行活細(xì)胞或生物體內(nèi)實時監(jiān)測；具有較高的敏感性，培養(yǎng)基中穩(wěn)定性可達6 d[15]。利用Gluc的自然分泌性，使用慢病毒載體系統(tǒng)將Gluc轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，根據(jù)培養(yǎng)基中Gluc的釋放情況，能夠監(jiān)測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分泌功能[16]。

NDV感染和外源poly(I:C)處理能夠強烈誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，通常作為研究IFN-β信號通路的陽性對照[17-19]，因此本研究中使用NDV和poly(I:C)處理IFN-β-Gluc穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，篩選陽性單克隆細(xì)胞。兩株單克隆細(xì)胞（#13、#14）經(jīng)NDV及poly(I:C)處理后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌型熒光素酶活性均顯著高于對照組，其中#13呈現(xiàn)極顯著，因此，后續(xù)實驗選擇#13細(xì)胞株進行。值得注意的是，雖然其他IFN-β-Gluc單克隆細(xì)胞能夠誘導(dǎo)更高水平的Gluc活性，但空白組Gluc活性過高，且空白組與處理組無統(tǒng)計學(xué)差異，不能進行后續(xù)功能實驗。

MAVS作為重要的接頭蛋白與IRF激酶TBK1在激活天然免疫信號通路中不可或缺[20-21]，在通路中激活的受體通過招募接頭蛋白，觸發(fā)一系列的信號級聯(lián)反應(yīng)，最終激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生I型干擾素。NDV的V蛋白能夠募集E3泛素連接酶RNF5降解MAVS，抑制干擾素信號通路[22]。此次研究中，多次傳代的IFN-β-Gluc細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染MAVS、TBK1，細(xì)胞上清液中Gluc的活性顯著高于空載組，而轉(zhuǎn)染NDV V蛋白，則顯著的抑制細(xì)胞上清液中Gluc的活性，說明通過轉(zhuǎn)染正向調(diào)控或負(fù)向調(diào)控I型干擾素信號通路的外源質(zhì)粒，IFN-β-Gluc細(xì)胞系均能做出正確應(yīng)答，穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc的細(xì)胞系構(gòu)建成功。該細(xì)胞系為深入研究病毒調(diào)控IFN-β信號通路提供技術(shù)支持。

通過連續(xù)傳代陽性克隆細(xì)胞，分別在基因和蛋白水平對細(xì)胞系中IFN-β-Gluc表達的穩(wěn)定性進行驗證。利用PCR檢測不同代次細(xì)胞中Gluc基因，待細(xì)胞傳至20代，Gluc基因仍穩(wěn)定存在，利用NDV和poly(I:C)外源刺激檢測Gluc活性，顯示不同代次間細(xì)胞上清液中Gluc活性未發(fā)生顯著變化，由此說明篩選所得的陽性克隆細(xì)胞系在連續(xù)培養(yǎng)20代IFN-β-Gluc基因能夠穩(wěn)定表達。因此，本文成功構(gòu)建穩(wěn)定表達IFN-β-Gluc的A549細(xì)胞系，該細(xì)胞系提供了檢測IFN通路激活的簡易方法，為進一步研究病毒調(diào)控IFN-β信號通路、動態(tài)監(jiān)測IFN-β啟動子活性以及高通量篩選研究奠定細(xì)胞基礎(chǔ)。