陸晨陽(yáng)，張 婷，任超超，包旦奇，馬天馨，牛世奇，李雪松，楊建美，滕巧泱，李澤君，劉芹防

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV），屬于黃病毒科黃病毒屬，遺傳物質(zhì)由單股正鏈RNA組成。該病毒最早是在中國(guó)的東南地區(qū)發(fā)現(xiàn)并分離到毒株，之后此病毒在南亞地區(qū)快速傳播[1]。臨床上DTMUV感染后的主要癥狀有高熱、食欲下、生長(zhǎng)遲緩、產(chǎn)蛋下降，甚至造成鴨只死亡，給我國(guó)的養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。坦布蘇病毒與其他黃病毒屬病毒，如登革熱病毒（Dengue virus, DENV）[3]、日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）[4]的傳播途徑類似，都是以節(jié)肢動(dòng)物為傳播媒介，通過(guò)叮咬的方式來(lái)感染宿主[5]。這些以昆蟲(chóng)為傳播媒介的病毒在防控方面存在很大的難度，一方面隨著季節(jié)變化，溫度的上升，導(dǎo)致攜帶病毒的吸血昆蟲(chóng)大量繁殖[6]，導(dǎo)致傳播途徑無(wú)法得到有效的控制。另一方面，自然界中存在大量的潛在宿主或攜帶宿主，導(dǎo)致傳染源也無(wú)法得到有效確定并控制[7]。因此目前對(duì)于這類疾病的防控主要途徑是疫苗免疫[8]。

目前對(duì)坦布蘇病毒的疫苗研究進(jìn)展較快，從滅活苗、弱毒苗等基本疫苗再到亞單位疫苗、重組疫苗，各個(gè)種類的疫苗均有不同程度的研究進(jìn)展[9]。滅活苗作為最常用的防治病毒病的常規(guī)疫苗，具有安全有效、制造簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)勢(shì)，但是也存在著一些方面的不足，例如接種劑量較大，并且對(duì)病毒滅活要求較高，免疫周期短，到達(dá)保護(hù)效價(jià)時(shí)間長(zhǎng)等[10]。相對(duì)的弱毒苗在兼具滅活苗的所有優(yōu)點(diǎn)的前體下能夠達(dá)到更長(zhǎng)的免疫周期，更快的達(dá)到保護(hù)效價(jià)，病毒的擴(kuò)增也更加方便，是目前預(yù)防鴨坦布蘇病常用的手段[11]。而亞單位疫苗、重組疫苗目前的研究進(jìn)展還未能夠完全投入臨床應(yīng)用[12]。

疫苗佐劑，一種用于提高疫苗中抗原免疫原性的輔助物質(zhì)，在疫苗中添加能夠增強(qiáng)疫苗免疫原性以達(dá)到增強(qiáng)疫苗保護(hù)性的做法已被證實(shí)非常的高效且安全。隨著科學(xué)的進(jìn)步，新的分析方法和工具的問(wèn)世，大大的加快了免疫佐劑發(fā)展的進(jìn)程。我們現(xiàn)在添加在疫苗中的物質(zhì)，從無(wú)機(jī)的化合物到有機(jī)化合物，再到現(xiàn)在的生物蛋白質(zhì)、多肽、甚至是核酸，極大的豐富了疫苗佐劑方面的選擇[13]。目前，疫苗佐劑通常使用于亞單位疫苗和滅活疫苗中，而適用于活疫苗的佐劑較少。CpG寡核苷酸（oligodeoxynucleotides containing CpG motifs, CpG ODN）作為一種人工合成寡聚脫氧核苷酸，常被應(yīng)用于滅活疫苗佐劑，其是否具有增強(qiáng)弱毒活疫苗的免疫效果方面研究較少。本研究將CpG ODN作為免疫佐劑添加至鴨坦布蘇弱毒疫苗（FX2010-180P株）中，研究其對(duì)弱毒活疫苗的免疫效果的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和毒種 DF-1細(xì)胞由本團(tuán)隊(duì)保存，用于病毒滴度的測(cè)定。鴨坦布蘇病毒病活疫苗（FX2010-180P）由本實(shí)驗(yàn)室制備與保存；DTMUV病毒FX2010原始毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離與保存。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自hyclone公司；南美胎牛血清購(gòu)自PAN公司；抗TMUV E蛋白單克隆抗體1F5由本實(shí)驗(yàn)室制備與保存；山羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自Sigma公司；TMB顯色液購(gòu)自武漢博士德科技有限公司。

1.3 pUC18-CpG Xiao等[14]的研究表明，將20拷貝的CpG ODN 2006（序列為：5'-TCGTCGTTTTGTCG TTTTGTCGTT-3'）串聯(lián)插入至pUC-18的多克隆位點(diǎn)上，所構(gòu)建的pUC18-CpG質(zhì)粒按40 μg/只的劑量能夠有效提升坦布蘇病毒HB株滅活疫苗性能。本次實(shí)驗(yàn)所用pUC18-CpG來(lái)自北京農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所Shaohua Hou課題組，保存在滅菌PBS中，濃度為2 mg/mL。

1.4 免疫實(shí)驗(yàn) 將24只10周齡鴨坦布蘇抗體陰性麻鴨隨機(jī)分成四組，每組6只。第一組接種無(wú)佐劑添加的FX2010-180P弱毒疫苗。第二組接種以40 μg/只CpG ODN作為佐劑添加入FX2010-180P中的混合疫苗。接種方式均采用腿部肌肉注射方式。每只鴨按照103.5TCID50劑量接種0.2 mL FX2010-180P弱毒株疫苗。第三組同樣以腿部肌肉注射方式接種0.2 mL PBS作為未免疫對(duì)照組。第四組不做免疫處理以與3組免疫鴨子同樣的飼養(yǎng)方式養(yǎng)殖，作為MOCK對(duì)照組。從免疫后第3 d開(kāi)始，對(duì)進(jìn)行免疫的3組鴨連續(xù)7 d采血并分離血清，通過(guò)阻斷ELISA試驗(yàn)檢測(cè)不同組合疫苗免疫后鴨只體內(nèi)的抗體效價(jià)變化與轉(zhuǎn)陽(yáng)率的情況。

1.5 疫苗保護(hù)力實(shí)驗(yàn) 免疫后18 d，對(duì)接種FX2010-180P組、FX2010-180P+CpG ODN組、無(wú)免疫對(duì)照組進(jìn)行攻毒，按照103.5TCID50滴度接種FX2010株病毒，肌肉注射接種0.2 mL/只。未進(jìn)行疫苗免疫的第四組健康鴨以0.2 mL/只的量肌肉接種的滅菌PBS，作為MOCK對(duì)照。連續(xù)3 d觀察各組鴨的感染情況。

1.6 剖檢各組鴨子病理變化 攻毒3 d后，將所有4組實(shí)驗(yàn)鴨放血剖殺，檢查各臟器主要病理變化，取卵巢、腦、脾臟、腎臟、肺臟制作病理切片。

1.7 臟器滴定 滴定前1 d將DF-1細(xì)胞以1.0×105個(gè)/mL鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞飽滿度在80%左右。各組織臟器分別取1 g，加入1 mL添加10×青霉素鏈霉素的PBS進(jìn)行研磨，8000 ×g、4℃離心15 min取上層清澈液體為臟器研磨液。將各組鴨子的各器官臟器研磨液進(jìn)行10倍倍比稀釋至10-6，將不同濃度的各臟器研磨液按濃度加入鋪至96孔板中的DF-1細(xì)胞中，每孔100 μL，作用2.5 h后將臟器研磨液吸棄，用200 μL滅菌PBS清洗2次后，加入100 μL的細(xì)胞維持液，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)4 d后，以Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

2 結(jié)果

2.1 不同疫苗的轉(zhuǎn)陽(yáng)率差異 使用阻斷ELISA對(duì)采集到的免疫鴨血清進(jìn)行DTMUV抗體檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)免疫FX2010-180P的鴨子最早于免疫后3 d即出現(xiàn)了抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，免疫后第6 d所有的免疫鴨轉(zhuǎn)陽(yáng)。而添加CpG ODN佐劑組的鴨子則在免疫后5 d出現(xiàn)抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，在第6 d全部免疫鴨呈現(xiàn)抗體陽(yáng)性，抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)效率低于未添加免疫佐劑的FX2010-180P組。未免疫組的鴨抗體都是陰性。

圖1 不同免疫組鴨只血清轉(zhuǎn)陽(yáng)率變化結(jié)果Fig.1 Seroconversion rate of immunized ducks at different time points

2.2 不同疫苗阻斷率差異 對(duì)各組鴨血清抗體阻斷ELISA所得數(shù)據(jù)進(jìn)行two-ways ANOVA分析，ttest檢測(cè)，兩組免疫不同疫苗鴨子血清中抗體阻斷率無(wú)明顯差異（P＞0.05）（圖2），不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同免疫組鴨子血清抗體效價(jià)水平變化結(jié)果Fig.2 Antibody titers of immunized ducks at different time points

2.3 各組攻毒后臨床表現(xiàn) 攻毒后24 h觀察各組鴨子，發(fā)現(xiàn)無(wú)免疫組鴨子出現(xiàn)食欲下降、帶血稀糞、精神萎靡等癥狀。陰性對(duì)照組與兩種免疫組鴨子均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，精神狀況、飲食情況、排便情況均無(wú)異常。

2.4 各組鴨臟器病理變化 攻毒后3 d剖檢不同免疫組以及空白對(duì)照組的鴨子，空白對(duì)照組和兩個(gè)疫苗免疫組鴨只的卵巢、腦、脾臟、肺臟、腎臟外形正常，無(wú)典型DTMUV病變；無(wú)免疫對(duì)照攻毒組的鴨只均出現(xiàn)脾臟腫大，卵巢出現(xiàn)膿腫卵泡，腦組織粘膜輕微出血充血。

2.5 各組鴨臟器病毒含量滴定 對(duì)四個(gè)實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組各鴨只臟器進(jìn)行臟器病毒滴度檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在未免疫鴨子各臟器中均可以檢測(cè)到DTMUV，然而兩組FX2010-180P株免疫組與添加CpG ODN的免疫組鴨子，在FX2010野毒株感染后，各臟器中均檢測(cè)不到病毒（圖3）。說(shuō)明兩種疫苗免疫后都可以保護(hù)鴨子不受野毒株的感染，保護(hù)率均達(dá)到100%。添加CpG ODN對(duì)疫苗免疫效果無(wú)明顯影響。

圖3 不同免疫佐劑組鴨子臟器病毒滴度Fig.3 Virus titers in different organs of fected ducks

2.6 各組鴨臟器臟器病理切片觀察 觀察經(jīng)HE染色制作的不同組鴨子的脾臟、卵巢、肺臟、腎臟切片，陰性對(duì)照組鴨子的脾臟可以清晰觀察到脾臟的被摸、實(shí)質(zhì)以及形成的小梁結(jié)構(gòu)，脾臟細(xì)胞無(wú)病變，組織間無(wú)出血充血（圖4A）；卵巢細(xì)胞無(wú)病變，組織間無(wú)出血充血，卵泡結(jié)構(gòu)完整飽滿（圖4B）；肺臟肺泡邊界清晰，細(xì)胞無(wú)明顯病變，少量噬堿性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4C）；腎臟細(xì)胞無(wú)明顯病變，腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)清晰，組織間無(wú)出血充血（圖4D）。FX2010-180P組和添加CpG組各臟器組織與無(wú)感染陰性對(duì)照組相似，未見(jiàn)明顯組織細(xì)胞病變。觀察未免疫攻毒組鴨子脾臟被膜結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞松散、不完整，實(shí)質(zhì)組織間有充血出血，嗜酸性粒細(xì)胞增多，小梁結(jié)構(gòu)消失（圖4M）；卵巢組織出現(xiàn)壞死，卵泡結(jié)構(gòu)不完整有干酪樣滲出物（圖4N）；肺泡邊界消失，組織間有出血充血（圖4O）；腎臟嗜酸性粒細(xì)胞增多，部分腎小管細(xì)胞變性、小管結(jié)構(gòu)破壞，與實(shí)質(zhì)部分細(xì)胞間隙不清晰（圖4P）。

圖4 各實(shí)驗(yàn)組鴨子臟器HE染色切片F(xiàn)ig.4 HE staining of sections of different organs of infected ducks

3 討論

CpG ODN對(duì)于免疫系統(tǒng)的主要作用機(jī)理是在進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)后會(huì)作為一種病原相關(guān)分子模式與細(xì)菌DNA所產(chǎn)生的免疫刺激活性相似，主要誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答。其主要作用模式為免疫細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞的方式捕獲CpG ODN，與模式識(shí)別受體TLR-9結(jié)合，刺激機(jī)體的NF-κB、AP-1、IRF-7轉(zhuǎn)錄因子通路，促使細(xì)胞表達(dá)炎癥基因、趨化因子以及抗菌肽，分泌多種細(xì)胞因子，通過(guò)炎癥反應(yīng)完成對(duì)入侵病原微生物的清除[15]。

同時(shí)CpG ODN刺激免疫信號(hào)通路對(duì)于其他各種免疫細(xì)胞也有著重要的影響，能夠在不依賴T淋巴細(xì)胞直接激活B淋巴細(xì)胞，上調(diào)B細(xì)胞表面MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)，快速活化的B淋巴細(xì)胞迅速完成抗原的呈遞進(jìn)而提高抗體的分泌[16]。另一方面通過(guò)活化DC細(xì)胞，上調(diào)MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)促使其分泌多種細(xì)胞因子，IFN-α和TNF-α可以活化T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，進(jìn)而提高IFN-γ的分泌，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答[17]。

目前CpG ODN作為免疫佐劑添加在人用乙型肝炎疫苗中的研究已經(jīng)通過(guò)了三期臨床階段，添加進(jìn)入其他人用疫苗的研究也已經(jīng)在二期、三期臨床實(shí)驗(yàn)階段[15]。作為人用疫苗佐劑具有提升免疫性能明顯，與疫苗中抗原物質(zhì)不發(fā)生沖突的提升非特異性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的方式，能夠有效的提高機(jī)體對(duì)于病原物質(zhì)的免疫作用以及抗腫瘤作用，生產(chǎn)成本低，貯存、緩釋等方面具有比目前市面上一些常用的佐劑更加優(yōu)秀。有研究顯示，CpG ODN在豬的抗細(xì)菌感染方面有著良好的免疫輔助效果[18]。在禽病防治方面，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CpG ODN可以增強(qiáng)ALV-J亞單位疫苗的免疫活性[19]，但目前大多數(shù)獸用疫苗佐劑的應(yīng)用均還停留在實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)階段，因此具有廣泛的市場(chǎng)前景。

本研究結(jié)果表明，CpG ODN作為免疫佐劑添加的FX2010-180P弱毒疫苗中與未添加的疫苗相比較都能產(chǎn)生足夠的免疫保護(hù)能力，使其免受鴨坦布蘇病毒的感染。但CpG ODN的添加與否并不影響疫苗的保護(hù)性能，兩組疫苗在保護(hù)性能上并無(wú)明顯差距。本研究認(rèn)為疫苗本身是弱毒活疫苗，進(jìn)入體內(nèi)后刺激一套完整的免疫應(yīng)答程序，而CpG ODN的加入在短時(shí)間內(nèi)提高了Th1型細(xì)胞免疫，使部分活病毒在還沒(méi)有被B淋巴細(xì)胞識(shí)別便被天然免疫或粘膜免疫所殺死，所以并未出現(xiàn)提升抗體分泌水平的現(xiàn)象。