陳劍霖，郭暉（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院器官移植研究所，器官移植教育部重點實驗室，國家衛(wèi)生健康委員會器官移植重點實驗室，中國醫(yī)學科學院器官移植重點實驗室，湖北 武漢 430030）

隨著2015 年我國全面進入公民逝世后器官捐獻（donation after citizen's death，DCD）時代以及隨后擴大標準供腎（extended criteria donor，ECD）被逐漸接納使用［1-3］，供器官的病理組織學評估結(jié)果對供器官取舍的選擇起到至關重要的作用。在病理評估中對供器官進行取材是第一個關鍵環(huán)節(jié)，取材的質(zhì)量決定病理醫(yī)生是否能對供器官進行精準的評估［4］。但是目前對于取材部位和取材方式對供器官評估影響的研究較少，針對供器官取材操作的指南和規(guī)范也尚未出臺。雖然各個移植中心的獲取團隊對于活檢標本獲取有各自的方式，但是對于很多穿刺操作的細節(jié)目前還沒有相關文獻進行具體探究。因此我們利用本中心經(jīng)評估后棄用腎臟，針對腎臟不同部位取材并模擬評估，探究不同取材部位對DCD 供腎評估結(jié)果的影響。通過與供器官獲取時評估結(jié)果對比，尋找現(xiàn)有方法獲取的穿刺組織可能存在的問題。該項研究可為今后供器官活檢取材操作的指南和規(guī)范的制定提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象：收集華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院器官移植研究所在2019 — 2022 年10 例經(jīng)評估后棄用的腎臟標本。

1.2方法

1.2.1活檢取材：將棄用腎臟經(jīng)充分解剖剝離腎周脂肪及纖維組織后，將棄用腎臟沿中軸剖開并在被膜表面于腎臟上級，中部和下級分別選擇2 個活檢取材位點，用手術尖刀在皮質(zhì)部按前述定位點分別切取邊長約5 mm，厚度約3 mm 的正方形塊狀腎活檢標本?；顧z標本及時置于Bouin’s 固定液中。

1.2.2常規(guī)石蠟切片：將組織按如下步驟處理。Bouin’s 固定液12 h，75%乙醇2 h，85%乙醇2 h，95%乙醇2 h，無水乙醇3 h，二甲苯Ⅰ 40 min，二甲苯Ⅱ 40 min，浸蠟2 h。浸蠟后將組織包埋，然后進行2 μm 厚度石蠟切片。

1.2.3染色方法：制片完成后執(zhí)行常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。

1.3制片結(jié)果分析

1.3.1解剖標本活檢評估：本科室移植病理學醫(yī)師模擬供器官評估，統(tǒng)計標本中腎小球數(shù)量及硬化率、小動脈數(shù)量、小動脈內(nèi)膜增厚數(shù)量及其比例和小動脈透明樣變數(shù)量及其比例，并根據(jù)Banff 評分、Remuzzi 評分、Maryland 評分以及Pirani 評分對組織進行模擬評估［5-8］。最后將結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。

1.3.2解剖標本與穿刺標本評估結(jié)果的比較：將上述解剖標本活檢評估的結(jié)果與供腎獲取時穿刺標本評估的結(jié)果對比并進行統(tǒng)計學分析。

1.3.3單位面積下解剖標本與穿刺標本的腎小球與小動脈數(shù)量的比較：通過統(tǒng)計取材標本及供器官獲取評估時穿刺標本的面積，按如下方法計算每平方厘米標本中腎小球和小動脈獲得率。

單位面積腎小球獲得率＝腎小球數(shù)量×（1/標本面積）

單位面積小動脈獲得率＝小動脈數(shù)量×（1/標本面積）

1.4統(tǒng)計學分析：結(jié)果采用Excel 軟件對獲取的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較的分析方式采用t 檢驗，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 供者資料：本研究中，10 例棄用供腎來自6 例不同的供者，具體資料如表1 所示。其中男性供者4 例，女性供者2 例。供者平均年齡為47.2（38 ～63）歲，平均BMI 為24.1（17.6 ～30.9）。供者高血壓病史1 例，糖尿病病史1 例。死亡原因腦出血5 例，缺血缺氧性腦病1 例。供者捐獻前行心肺復蘇術2 例。

表1 供者一般資料

2.2 不同部位取材標本的組織病理學形態(tài)比較：不同取材部位標本的HE 染色結(jié)果如圖1 所示。我們發(fā)現(xiàn)從棄腎3 個不同部位取材的切片中均存在一定程度的腎小球硬化、小動脈內(nèi)膜增厚以及小動脈透明樣變的病變，病變范圍及表現(xiàn)較為一致。其中小動脈病變程度普遍較重。另外3 個不同部位取材切片的腎組織間質(zhì)均表現(xiàn)出局灶性纖維組織增生，同時3 個不同部位取材切片中腎小管上皮細胞均存在脫落壞死的情況。

圖1 不同取材部位腎臟病理組織形態(tài)學比較（HE ×100）

2.3 不同部位取材標本評估結(jié)果的比較：為了探究棄用腎臟不同取材部位的具體病變程度的差異，我們對其進行量化比較，結(jié)果如圖2 所示。從圖中我們發(fā)現(xiàn)從腎臟不同部位獲取的標本中可觀察到的腎小球數(shù)量、小動脈數(shù)量及其相對應的病變組織的數(shù)量均沒有統(tǒng)計學差異。模擬供腎評估對不同部位標本進行評分發(fā)現(xiàn)不同取材部位標本的Banff 評分、Remuzzi 評分、Maryland 評分和Pirani 評分均沒有統(tǒng)計學差異。結(jié)果表明從不同部位對腎臟進行取材活檢對評估結(jié)果沒有顯著影響。

圖2 棄用腎臟不同部位取材標本腎小球和小動脈數(shù)量以及慢性病變程度及不同評分系統(tǒng)中分數(shù)的比較

2.4 解剖標本與穿刺標本評估結(jié)果的比較：進一步探究了解剖標本與對應的供腎獲取時穿刺標本評估結(jié)果的差異，結(jié)果如圖3 所示。在組織固有結(jié)構數(shù)量方面，解剖標本中腎小球數(shù)量為（42.9±25.4）個，小動脈數(shù)量為（21.9±13.8）個，穿刺標本中腎小球數(shù)量為（13±3.8）個，小動脈數(shù)量為（9.4±3.8）個，結(jié)果具有顯著統(tǒng)計學差異。兩種活檢標本中腎小球硬化數(shù)量、小動脈內(nèi)膜增厚數(shù)量以及小動脈透明樣變數(shù)量沒有顯著差異。在病變范圍表現(xiàn)方面，解剖標本中腎小球硬化率為25%±23.2%，小動脈內(nèi)膜增厚比例為46.5%±22.8%，小動脈透明樣變比例為59.3%±16.4%，而穿刺標本中腎小球硬化率為42%±8.8%，小動脈內(nèi)膜增厚比例為68%±27%，小動脈透明樣變比例為86%±17.4%，結(jié)果均具有統(tǒng)計學差異。僅Banff 評分中穿刺標本的腎小球硬化評分為（2.2±0.4）分，解剖標本腎小球硬化評分為（1.6±0.9）分，結(jié)果具有統(tǒng)計學差異。其他項評分中兩者均不存在差異。該結(jié)果說明穿刺標本在評估供腎病變范圍方面可能高于供腎實際情況，但是在評分方面穿刺標本結(jié)果基本可以反映腎臟真實慢性病變情況。

圖3 腎臟解剖標本與對應穿刺標本腎小球和小動脈數(shù)量以及慢性病變比例及不同評分系統(tǒng)中分數(shù)的比較

2.5 解剖標本和穿刺標本在單位面積下腎小球和小動脈數(shù)量的比較：由于解剖標本面積大于穿刺標本，所以解剖標本中腎小球和小動脈的數(shù)量多于穿刺標本。因此為了消除因面積而產(chǎn)生的差異，我們計算單位面積（1 cm2）下，兩種標本的腎小球和小動脈數(shù)量，結(jié)果如圖4 所示。通過計算我們發(fā)現(xiàn)每個單位面積中穿刺標本的腎小球數(shù)量小于解剖標本，數(shù)量分別為（199.3±50.7）個/cm2和（240.6±57.4）個/cm2。但是穿刺標本的小動脈數(shù)量大于解剖標本，數(shù)量分別為（153.5±76.9）個/cm2和（114.9±43.7）個/cm2。結(jié)果具有統(tǒng)計學差異。

圖4 腎臟解剖標本與對應穿刺標本在單位面積下腎小球和小動脈數(shù)量的比較

3 討 論

在供器官的選擇過程中，組織病理學評估結(jié)果具有非常重要的指導意義。目前相關的供器官評估評分系統(tǒng)多達15 種［9-11］。雖然目前還沒有最佳的供腎評分系統(tǒng)［12］，但是一致的觀點是病理醫(yī)生需要從活檢標本中觀察到足夠數(shù)量的腎臟固有結(jié)構才能使用相關評分系統(tǒng)。然而由于目前對于取材方法尚未有明確的操作規(guī)范和指南，導致現(xiàn)在供器官的病理組織活檢取材量非常有限［13］，并且活檢往往存在采樣誤差［14-16］。Haas 等［17］的研究表明目前在評估動脈纖維內(nèi)膜增厚及動脈硬化時結(jié)果往往不可靠，并且腎小球硬化率和間質(zhì)纖維化的趨勢容易被高估。而目前關于供器官獲取時取材部位和方式的研究較少。因此，本研究旨在探究取材部位和方式對供器官病理組織學評估的影響。

首先為了探究不同部位取材對供器官組織病理學評估的影響，我們利用本中心經(jīng)評估后棄用腎臟，分別針對腎臟不同位置進行活檢取材并通過模擬評估的方式統(tǒng)計活檢結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)不同部位取材的標本中可觀察到的腎小球和小動脈數(shù)量沒有差異，對活檢標本模擬供腎評估后發(fā)現(xiàn)上述標本在Banff 各項評分、Remuzzi 評分、Maryland 評分以及Pirani 評分中均沒有顯著性差異。我們的研究表明，腎臟不同部位的固有結(jié)構數(shù)量相對較為平均，并且腎臟慢性改變在腎皮質(zhì)區(qū)域的表現(xiàn)較為均一，較少出現(xiàn)慢性局灶性病變。

因為解剖標本取材范圍較大，更能反映供腎真實的病理改變，所以我們比較解剖標本與獲取時穿刺標本的差異。結(jié)果表明雖然穿刺標本在腎小球和小動脈病變范圍上大于解剖標本，但是在供腎評分方面僅在Banff 評分的腎小球硬化評分一項中，穿刺標本得分高于解剖標本，其他評分結(jié)果兩者均不存在差異。一直以來對于穿刺活檢標本是否可以真實反映腎臟病變情況的爭論始終較大，Oberholzer等［18］認為穿刺活檢標本足以準確分析腎臟腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化程度，但是Girolami 等［13］利用棄用腎臟做對比實驗后認為活檢結(jié)果不能代替整個器官病變程度，活檢標本可能會高估腎臟病變的程度。我們的結(jié)果更傾向于穿刺標本可以反映供腎真實質(zhì)量。雖然穿刺標本腎小球硬化率、小動脈內(nèi)膜增厚和透明樣本比例高于解剖標本，但是2 種標本的評分沒有差異，而穿刺標本中腎小球和小動脈病變比例高可能與穿刺標本中可觀察到的腎小球和小動脈數(shù)量較少有關。這一結(jié)果也與Muruve 等［19］的實驗結(jié)論一致。

由于穿刺標本面積小于解剖標本，所以兩者腎小球和小動脈數(shù)量并沒有可比性。因此我們計算單位面積下2 種標本的腎小球和小動脈數(shù)量。有趣的是，穿刺標本在單位面積下腎小球數(shù)量少于解剖標本，但是小動脈數(shù)量高于解剖標本。腎實質(zhì)可以分為皮質(zhì)和髓質(zhì)，皮質(zhì)位于腎實質(zhì)淺層，其中85%的腎單位位于皮質(zhì)區(qū)域［20］。根據(jù)血流方向，腎動脈分為5 級，其中位于腎實質(zhì)淺層的血管主要是血供末梢的入球小動脈，該段動脈易收到供者年齡等因素的影響［21］，因此，最佳的穿刺效果是穿刺針獲取的標本主要為腎皮質(zhì)及皮髓質(zhì)交接區(qū)域，此時可以觀察到更多的腎小球和更多供腎深部的小血管分支。我們的結(jié)果說明在取材時，穿刺針進針角度往往過大，穿刺深度過深，導致一部分穿刺針獲取的標本為髓質(zhì)部分，所以在穿刺標本中觀察到更少的腎小球和更多的小動脈。因此，該結(jié)果也提示今后在進行穿刺取材時應適當減小進針角度。

本實驗中，我們探究了不同部位取材對供腎評估的影響以及目前穿刺活檢取材的問題。但是由于研究標本量較少，今后還需要擴大標本量進行進一步研究，另外今后也可以通過計算明確最佳穿刺角度，從而為醫(yī)生取材提供數(shù)據(jù)參考。