雷 菲， 王 莉， 劉海林， 林清火， 吳宇佳， 張冬明

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與土壤研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海南耕地保育科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/海南省耕地保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 571100；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究中心，海南?？?571101)

肥料是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中極為關(guān)鍵的生產(chǎn)物資，肥料對(duì)作物增產(chǎn)的貢獻(xiàn)率接近50%，其中氮肥的貢獻(xiàn)率約30%。我國(guó)是世界主要的氮肥產(chǎn)銷國(guó)，氮肥生產(chǎn)量超過了消費(fèi)量，消費(fèi)量超過作物最高產(chǎn)量需求量。由于氮肥易通過揮發(fā)、淋溶等途徑損失，肥料過量施用將導(dǎo)致養(yǎng)分利用率低，且容易造成環(huán)境污染。而通過使用新材料、新工藝或者新技術(shù)賦予常規(guī)肥料新功能和新特性，研制新型肥料被認(rèn)為是提高肥料利用率、減少養(yǎng)分損失的有效方法之一。腐殖酸是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然高分子有機(jī)聚合物，含有大量的羧基、酚羥基和羰基等活性基團(tuán)。腐殖酸具有促進(jìn)作物生長(zhǎng)、調(diào)控肥料養(yǎng)分轉(zhuǎn)化以及提高肥料利用率等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起到了重要作用。目前，腐殖酸已被廣泛用于制備新型氮肥，大量研究也表明腐殖酸氮肥可起到減少氨揮發(fā)、提高氮肥利用率和促進(jìn)作物增產(chǎn)等作用。當(dāng)前腐殖酸氮肥主要通過腐殖酸與尿素的絡(luò)合反應(yīng)制備，而腐殖酸-尿素-甲醛共聚物由于速效和緩效相結(jié)合，也被認(rèn)為是很有開發(fā)前景的緩釋氮肥，但是關(guān)于腐殖酸-尿素-甲醛共聚物施用效果的研究少有報(bào)道。本研究將緩釋與增效結(jié)合，以腐殖酸、尿素、甲醛為原料，利用腐殖酸類物質(zhì)中存在的大量羧基和酚羥基等活性基團(tuán)，與尿素、甲醛在一定工藝條件下反應(yīng)制備腐殖酸-尿素-甲醛共聚物(腐殖酸緩釋氮肥)，通過田間微小區(qū)試驗(yàn)，研究腐殖酸緩釋氮肥對(duì)糯玉米產(chǎn)量、氮肥利用率以及土壤細(xì)菌多樣性的影響，以期為新型腐殖酸氮肥的研制提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試糯玉米品種為海玉糯2000，來源于海南海亞南繁種業(yè)有限公司。

供試肥料：腐殖酸緩釋氮肥，自制，含氮量31.16%，冷水不溶氮含量為17.80%，熱水不溶氮含量為7.87%，活性系數(shù)為55.79%(參照中國(guó)化工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HG/T 4137—2010《脲醛緩釋肥料》的方法測(cè)定)；腐殖酸脲，自制，含氮量41.22%；普通尿素(U)，含氮量46.4%；過磷酸鈣，PO15%；氯化鉀，KO 60%。其中，腐殖酸緩釋氮肥是將風(fēng)化煤、尿素和甲醛在一定pH值溶液中分階段反應(yīng)、干燥制備而成，腐殖酸脲工藝參數(shù)與腐殖酸緩釋氮肥一致，但不添加37%甲醛溶液。

供試土壤：中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所土壤肥料試驗(yàn)基地磚紅壤，土壤具體理化性質(zhì)見表1。

表1 試驗(yàn)點(diǎn)土壤理化性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)布置于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所土壤肥料試驗(yàn)基地，試驗(yàn)時(shí)間為2017年11月至2018年3月。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別為不施氮肥處理(CK)、普通尿素處理(U)、腐殖酸脲處理(UHA)、腐殖酸緩釋氮肥處理(NF)，施肥量為N 210 kg/hm、PO105 kg/hm、KO 210 kg/hm，采用田間微小區(qū)試驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次，共12個(gè)微小區(qū)(1 m×1 m)，每個(gè)小區(qū)種植9株糯玉米，各小區(qū)周圍均種植糯玉米作為保護(hù)行。試驗(yàn)中氮肥為尿素、腐殖酸脲、腐殖酸緩釋氮肥，各處理磷肥和鉀肥均為過磷酸鈣和氯化鉀，普通尿素、腐殖酸脲、過磷酸鈣和氯化鉀均分為2次施用(基肥和追肥)，第1次作為基肥施肥，第2次施肥為在糯玉米大喇叭口期作為追肥施用，而腐殖酸緩釋氮肥則作為基肥一次性施用。糯玉米種植其余管理措施與日常管理保持一致。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 糯玉米產(chǎn)量和生物量測(cè)定 糯玉米成熟期采集各微小區(qū)收獲的玉米穗，計(jì)算各小區(qū)糯玉米鮮穗產(chǎn)量。然后將玉米根系、莖、葉分開，和玉米穗一起洗凈，在105 ℃下殺青，然后烘干至恒質(zhì)量，稱量。

1.3.2 植株氮含量和土壤氮含量測(cè)定 將烘干的玉米根系、莖、葉和玉米穗樣品粉碎，用于測(cè)定植株氮含量。采集各微小區(qū)0～20、20～40、40～60 cm 土壤，每個(gè)小區(qū)采集5個(gè)點(diǎn)，混合作為一個(gè)土樣，風(fēng)干，用于測(cè)定土壤全氮含量，土壤和植株樣品均采用常規(guī)方法分析測(cè)定。

1.3.3 糯玉米氮肥利用率 氮素利用效率相關(guān)參數(shù)計(jì)算方法：

氮收獲指數(shù)=鮮穗氮吸收量/地上部氮吸收量×100%；

氮肥偏生產(chǎn)力(kg/kg)=施肥區(qū)玉米鮮穗產(chǎn)量/施氮量；

氮肥利用率=(施肥區(qū)氮吸收量-對(duì)照區(qū)氮吸收量)/施氮量×100%。

1.3.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) 在糯玉米植株根系區(qū)域(距玉米莖5～10 cm處)用土鉆取0～20 cm土層的土壤樣品用于測(cè)定土壤細(xì)菌多樣性，土壤總DNA采用DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌16S rRNA區(qū)域引物(5′-G T G C C A G C M G C C G C G G-3′，5′-C C G T C A A T T C M T T T R A G T T T-3′)進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化后的樣品送至上海凌恩生物科技有限公司利用Illumina PE250高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。Illumina PE250測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OTU聚類分析結(jié)果對(duì)OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析以及對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè)；基于分類學(xué)信息在門水平上進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

采用Excel 2007對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理計(jì)算、繪制圖表，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐殖酸緩釋氮肥對(duì)糯玉米鮮穗產(chǎn)量的影響

由圖1可知，施肥可以顯著增加糯玉米鮮穗產(chǎn)量，U、UHA、NF處理的糯玉米鮮穗產(chǎn)量分別較CK增加了46.81%、47.52%和68.79%。UHA處理的糯玉米鮮穗產(chǎn)量較U處理僅增加了0.48%，這2個(gè)處理間差異不顯著。NF處理的糯玉米鮮穗產(chǎn)量顯著大于U、UHA處理，較U處理增加了14.98%，而且腐殖酸緩釋氮肥處理是一次性施用，可節(jié)省勞動(dòng)成本投入。

2.2 腐殖酸緩釋氮肥對(duì)糯玉米氮素吸收量的影響

從圖2可見，UHA、NF處理的根系氮素吸收量顯著小于U處理，UHA處理與NF處理差異不顯著。3個(gè)施肥處理糯玉米莖的氮素吸收量均顯著大于CK，但是3個(gè)施肥處理間差異不顯著。3個(gè)施肥處理糯玉米葉氮素吸收量均大于CK，但是僅UHA處理顯著大于CK。NF處理玉米穗的氮素吸收量顯著大于其他處理，CK和U處理分別增加了0.79、0.32 g/株。

2.3 腐殖酸緩釋氮肥對(duì)氮肥利用率的影響

由表2可知，NF處理糯玉米干物質(zhì)累積量和氮素吸收量均顯著大于U、UHA處理，糯玉米干物質(zhì)累積量較U處理增加了27.91 g/株，氮素吸收量增加了0.31 g/株，而U處理與UHA處理的干物質(zhì)累積量和氮素吸收量均差異不顯著。UHA、NF處理的氮收獲指數(shù)、氮肥偏生產(chǎn)力、氮肥利用率均高于UHA和U處理，但UHA處理與U處理之間差異不顯著。NF處理的氮收獲指數(shù)、氮肥偏生產(chǎn)力分別達(dá)到67.89%、113.39 kg/kg，氮肥利用率為44.81%，較U處理提升了41.49%。

表2 不同施肥處理糯玉米氮肥吸收利用效率

2.4 腐殖酸緩釋氮肥對(duì)土壤全氮含量的影響

從圖3可見，3個(gè)施肥處理糯玉米收獲后的0～20 cm土壤全氮含量均大于CK，各處理0～20 cm土壤全氮含量大小順序?yàn)镹F>UHA>U>CK，其中UHA、NF處理0～20 cm土壤全氮含量顯著高于CK，但與U處理差異不顯著。各處理20～40、40～60 cm土壤全氮含量均無顯著差異。

2.5 腐殖酸緩釋氮肥對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

從表3可知，4個(gè)處理的糯玉米根系區(qū)域土壤細(xì)菌的測(cè)序深度指數(shù)均在0.986 2以上，且處理間差異不顯著。Chao1指數(shù)代表細(xì)菌群落豐富度，數(shù)值越大表明物種豐度越高；Shannon指數(shù)表示細(xì)菌群落多樣性，數(shù)值越大表明細(xì)菌群落多樣性越高。由表3可見，各處理的Chao1和Shannon指數(shù)在統(tǒng)計(jì)上均無顯著差異，說明腐殖酸緩釋氮肥對(duì)糯玉米根系區(qū)域土壤細(xì)菌多樣性無顯著性影響。由圖4可知，在基于門分類水平上，4個(gè)處理的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門類似。主要包括酸桿菌門、變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門、GAL15門、擬桿菌門、己科河菌門、硝化螺旋菌門，其中4個(gè)處理土壤中的酸桿菌門、變形菌門、綠彎菌門的總占比均在60%以上。

表3 不同施肥處理對(duì)土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)的影響

3 討論與結(jié)論

尿素是我國(guó)應(yīng)用最廣泛、用量最大的氮肥，以尿素與腐殖酸制備腐殖酸尿素可以減緩尿素在土壤中的分解速率，提高氮肥利用率。在本研究中，通過將尿素與腐殖酸，尿素、腐殖酸與甲醛在一定工藝條件下反應(yīng)制備腐殖酸氮肥，在糯玉米上施用后可提高糯玉米鮮穗產(chǎn)量，增加糯玉米氮素吸收量，提高氮肥利用率。腐殖酸脲和腐殖酸緩釋氮肥處理糯玉米鮮穗產(chǎn)量分別較普通尿素處理增加了0.48%和14.98%，而氮素吸收量分別為1.85、2.11 g/株，氮肥利用率分別達(dá)到了33.74%和44.81%，均高于普通尿素處理。其中，腐殖酸脲具有一定增效作用的原因可能在于腐殖酸的各種活性基團(tuán)與尿素之間發(fā)生反應(yīng)，形成了大量氫鍵和絡(luò)合配位鍵，而這些化學(xué)鍵具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性。但是，從本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腐殖酸脲處理雖能夠提高糯玉米氮素吸收量和氮肥利用率，卻與普通尿素處理差異不顯著，而腐殖酸緩釋氮肥處理糯玉米鮮穗產(chǎn)量、氮素吸收量和氮肥利用率均顯著大于普通尿素處理。其原因可能是腐殖酸緩釋氮肥是由尿素、腐殖酸與甲醛制備而成，除含有腐殖酸和腐殖酸尿素外，還含有腐殖酸-尿素-甲醛共聚物(本研究中自制的腐殖酸緩釋氮肥含有17.80%冷水不溶氮和7.87%熱水不溶氮)。腐殖酸-尿素-甲醛共聚物為微溶性或緩溶性有機(jī)氮肥，從而使得腐殖酸緩釋氮肥性質(zhì)類似于最早實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的緩釋氮肥-脲甲醛，是由速效氮和緩釋氮2個(gè)部分組成，施入土壤后，緩釋氮需要通過微生物的分解，轉(zhuǎn)化成被作物吸收利用的氮素形態(tài)，且主要受土壤性質(zhì)、溫度和微生物活性等因素影響。由于腐殖酸緩釋氮肥不僅含有腐殖酸，同時(shí)氮素能夠速效和緩效相結(jié)合，腐殖酸-尿素-甲醛共聚物在微生物作用下緩慢供氮，能夠使肥料氮素更好地供給糯玉米生長(zhǎng)發(fā)育，從促進(jìn)糯玉米對(duì)氮素的吸收，提高氮肥利用率。

本研究中，雖然腐殖酸脲和腐殖酸緩釋氮肥處理糯玉米吸收氮量高于普通尿素處理，但在糯玉米收獲后，0～20 cm土壤全氮含量仍高于普通尿素處理，各處理0～20 cm土壤全氮含量大小順序?yàn)?NF>UHA>U>CK，而腐殖酸脲和腐殖酸緩釋氮肥處理20～40、40～60 cm土壤全氮含量低于普通尿素處理。說明腐殖酸氮肥可以在一定程度上減少氮損失，提高表層土壤肥料氮?dú)埩袅?，這也與張水勤等的研究結(jié)果相似，而且本研究的腐殖酸緩釋氮肥為一次性施用，腐殖酸脲和普通尿素均分2次施用，更體現(xiàn)了腐殖酸緩釋氮肥的優(yōu)勢(shì)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)腐殖酸緩釋氮肥對(duì)糯玉米根系區(qū)域土壤細(xì)菌多樣性無明顯影響，各處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成類似，均是酸桿菌門、變形菌門、綠彎菌門的總占比在60%以上。