張 立， 王 杰

(1.懷化職業(yè)技術學院，湖南懷化 418000； 2.湖南糧安科技股份有限公司，湖南邵陽 422008)

鎘(Cd)是一種在農(nóng)田土壤中廣泛存在的重金屬元素，Cd具有高移動性、高毒害性以及不可生物降解等特性，且研究發(fā)現(xiàn)，Cd對植物光合作用、養(yǎng)分吸收及生理代謝具有顯著影響，低濃度下Cd可誘導植物活性氧(ROS)累積造成氧化應激損傷，從而導致植株發(fā)育遲緩，而高Cd濃度下植物可能會直接死亡，目前土壤Cd污染已成為威脅農(nóng)作物安全生產(chǎn)的全球問題。油菜(L.)作為最具代表性的十字花科蕓薹屬植物，是我國種植面積最廣的油料作物，Cd脅迫可導致油菜籽產(chǎn)量銳減，菜籽油是居民日常的膳食輔料，超過每日攝入量限制的Cd含量會對人類健康造成危害。因此，降低油菜的Cd累積對保護人們免受Cd的威脅具有重要意義。

硒(Se)是人類和動物所必需的微量營養(yǎng)元素，盡管Se對高等植物來說不是必需的，但大量研究表明，一定劑量的Se對植物生長和提高非生物脅迫耐受性具有積極影響。近年來，Se在減輕植物重金屬(例如Cd)毒性方面的作用已越來越受到關注。周健等研究表明，外源硒代甲硫氨酸、硒酸鹽[Se(Ⅵ)]和亞硒酸鹽[Se(Ⅳ)]作為3種形態(tài)的硒源皆可有效提高小油菜的抗氧化酶活性，激活谷胱甘肽代謝，從而降低Cd脅迫對小油菜的應激損傷。徐境懋等研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鹽[Se(Ⅳ)]處理可降低細胞可溶物質(zhì)組分和細胞器組分的Cd含量，改變根系Cd的亞細胞分布，從而減少Cd向莖葉的轉(zhuǎn)運，降低地上部的膜脂過氧化程度。Lin等研究表明，外源Se(Ⅳ)可通過增加葉綠素含量和提高抗氧化活性來減少辣椒中的鎘積累，且Se有利于Cd脅迫下細胞膜和葉綠體結(jié)構(gòu)的恢復和重建。上述研究表明，Cd脅迫下不同硒形態(tài)尤其是Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)對植物具有良好的解毒作用。

土壤中存在不同形態(tài)的Se源，Se(Ⅳ)是淹水環(huán)境的主要形式，Se(Ⅵ)主要存在于堿性或通氣狀況良好的環(huán)境中。有機形式的Se是土壤硒的主要組成部分，與N、P等養(yǎng)分的有機形態(tài)不同，有機硒容易被植物根系吸收，研究發(fā)現(xiàn)小麥、油菜對硒代甲硫氨酸(SeMet)的吸收率是硒(Ⅵ)或硒(Ⅳ)的10～20倍。此外，隨著農(nóng)業(yè)技術發(fā)展，通過生物或非生物途徑還原硒氧陰離子形成的納米級硒元素(SeNPs)已越來越多的應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。目前已知Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeMet及SeNPs皆可被植物吸收，且關于Se對植物Cd吸收和轉(zhuǎn)運的影響已有較多報道，然而關于不同Se形態(tài)對重金屬脅迫的效果尚不清楚?；诖耍狙芯客ㄟ^沙培試驗探索4種Se形態(tài)對油菜Cd累積、化學形態(tài)及生理特性的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2021年3—5月在湖南糧安科技園(27°14′28″N，110°22′48″E)進行。供試油菜品種為中雙11，種子購自湖南糧安科技股份有限公司。種子采用5%HO進行表面滅菌5 min，采用蒸餾水沖洗，然后放置于鋪滿基質(zhì)的園藝育苗盤中，在光照培養(yǎng)室(光—暗周期為12 h—12 h)中培養(yǎng)15 d。

供試土壤取自湖南省懷化市某電子拆卸區(qū)附近廢棄的油菜田。將土壤自然風干后采用溴甲烷(CH-Br)對土壤進行化學熏蒸，之后過4 mm網(wǎng)篩備用。供試土壤理化性質(zhì)如下：有機質(zhì)含量為28.26 g/kg、全磷含量為1.95 g/kg、堿解氮含量為96.40 mg/kg、速效磷含量為22.18mg/kg、速效鉀含量為141.72 mg/kg，pH值為6.27，鎘含量為 4.58 mg/kg。根據(jù)GB 15618—2018《土壤環(huán)境質(zhì)量 農(nóng)用地土壤污染風險管控標準(試行)》，當土壤pH值為5.5～6.5時，農(nóng)田土壤污染Cd風險臨界值為0.30 mg/kg，供試土壤Cd超標14.27倍。

供試亞硒酸鈉(NaSeO)、硒酸鈉(NaSeO)、硒代甲硫氨酸(CHNOSe)均購自北京百靈威科技有限公司；納米硒(SeNPs)，粒徑25～45 nm，購自奧格生物技術(上海)有限公司。供試N、P、K肥分別為分析純的尿素、磷酸二氫鈣、硫酸鉀，均購自湖南化學試劑總廠。

1.2 試驗設計

試驗設置5個處理：對照(CK)，污染土培養(yǎng)；SeNPs，污染土培養(yǎng)中施用納米硒；Se(Ⅵ)，污染土培養(yǎng)中施用硒酸鈉；Se(Ⅳ)，污染土培養(yǎng)中施用亞硒酸鈉；SeMet，污染土培養(yǎng)中施用硒代甲硫氨酸。各處理重復3次。上述硒處理皆采用超純水進行高速攪拌，Se濃度為36 μmol/L。

盆栽裝置為桶形塑料制品，每盆裝土2.5 kg，將肥料(N=1.0 g，(N) ∶(PO) ∶(KO)=2 ∶1 ∶1)與土壤充分混合，保持70%土壤持水量，平衡6 d。之后每盆移入油菜幼苗3株，待幼苗進入生根期(10 d后)間苗至1株。之后加入相關硒溶液，為避免高劑量的硒對幼苗造成沖擊效應，采用多次分施，即每次施入30 mL相應硒溶液，連續(xù) 10 d，總量為300 mL。其他管理措施同作物培育方法，盆栽培育時間為38 d。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 油菜植株生物量、Cd濃度及Se濃度測定 培養(yǎng)38 d后，將油菜植株小心整株取出，將植株地上部、根系分開，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒質(zhì)量并記錄。將烘干的植株進行粉碎處理封裝待測，稱取0.50 g待測樣品，用HNO消解2 min，之后加入濃鹽酸進行酸解萃取，借助電感耦合等離子體光譜儀(ICAPQc，賽默飛世爾科技公司)采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定樣品中的Cd、Se濃度。

1.3.2 植株Cd亞細胞分布、Cd化學形態(tài)測定 Cd的亞細胞分布采用差速離心法分離測定，分為細胞壁、細胞器、細胞膜和可溶性部分，相關方法參考閆秀秀等所述略作修改。即準確稱取0.50 g新鮮油菜植株樣品，并用在4 ℃環(huán)境下預冷的40 mL混合提取液[250 mmol/L蔗糖、1 mmol/L二硫代甲狀腺素醇(DTT)、50mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH值為7.5]速研磨提取樣品，將勻漿采用 80 μm 孔徑的有機膜過濾，殘留濾渣記為細胞壁組分。將所得濾液在 3 000 r/min 離心30 min，沉淀物即為細胞器組分；隨后上清液以15 000 r/min進一步離心30 min后，上清液溶液、沉淀物分別為可溶性組分、細胞膜組分。

Cd不同化學形態(tài)分為乙醇提取態(tài)、水提取態(tài)、氯化鈉提取態(tài)、醋酸提取態(tài)、鹽酸提取態(tài)及殘渣提取態(tài)，上述提取分離參考Fu等所述采用逐步提取法測定，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測量每個提取步驟中獲得的Cd濃度。

1.3.3 植株光合色素測定 葉綠素、類胡蘿卜素總量皆采用丙酮-乙醇混合浸提，采用紫外分光光度法分別在650、470 nm處測定，具體步驟參照李合生所述。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2013進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 19.0進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(=0.05)，采用Origin 9進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硒形態(tài)對鎘脅迫下油菜生物量累積及色素含量的影響

由圖1-a可知，地上部干物質(zhì)累積中，與CK相比，硒處理[SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet]變幅-35.43%～75.39%，其中Se(Ⅵ)處理累積量最低，顯著小于其他處理；以Se(Ⅳ)處理累積量最高，SeMet處理其次，二者間差異顯著，同時CK、SeNPs、Se(Ⅵ)處理較Se(Ⅳ)和SeMet處理分別顯著降低42.98%、45.12%、63.19%和28.94%、31.61%、54.12%。由圖1-b可知，各處理根系干物質(zhì)累積量表現(xiàn)為Se(Ⅵ)

2.2 不同硒形態(tài)對鎘脅迫下油菜硒累積的影響

由圖2-a可知，各處理地上部Se濃度表現(xiàn)為CK

2.3 不同硒形態(tài)對鎘脅迫下油菜鎘累積及轉(zhuǎn)運的影響

由圖3-a可知，根系Cd濃度皆整體大于地上部。地上部Cd濃度中，與CK處理相比，硒處理[SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet]顯著降低32.94%～42.92%，硒處理中，以SeMet處理Cd濃度最低，其顯著低于SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)處理，此外，后三者處理間差異較小且差異不顯著；根系Cd濃度中，各處理呈SeMet

2.4 不同硒形態(tài)對鎘脅迫下油菜鎘亞細胞分布的影響

由圖4可知，使用差異離心法將植物亞細胞Cd組分分為4個部分：細胞壁、細胞器、細胞膜和可溶性部分。各處理不同組分中Cd累積比例差距較大，在根系中，CK處理中的Cd主要分布于細胞壁(49.91%)和可溶性部分(40.15%)，一小部分分布于細胞器(2.18%)和細胞膜(7.76%)中；同時，在硒處理[SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet]中，大部分Cd則存在于可溶性部分(47.51%～58.73%)中，這意味著硒處理下使Cd主要分布于可溶性部分，其中SeMet處理可溶性部分的Cd比例最高，較CK處理增加18.58%。

Cd在地上部中的亞細胞分布規(guī)律與根系趨于一致。由圖4可知，CK處理的油菜植株中Cd在細胞壁和可溶性部分中的比例較高，其中CK處理細胞壁比例高于SeNPs處理、Se(Ⅳ)處理和SeMet處理；而在可溶性組分中，硒處理的比例皆大于CK處理。然而，對于根系和地上部的Cd亞細胞分布，CK處理和各硒處理[SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet]之間，細胞器和細胞膜中Cd比例波動較小。

2.5 不同硒形態(tài)對鎘脅迫下油菜鎘化學形態(tài)組成的影響

Cd在根系中的化學形態(tài)如圖5所示，各處理中的醋酸提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)的Cd形態(tài)在根系中占據(jù)主要地位，兩者Cd化學形態(tài)分別占總Cd累積量的20.17%～23.18%和17.35%～31.86%，而殘渣提取態(tài)的化學形態(tài)比例整體較低(9.05%～12.65%)。根系中，CK處理的水提取態(tài)的Cd占總Cd的19.09%，均高于硒處理(7.25%～13.77%)；而鹽酸提取態(tài)和乙醇提取態(tài)的Cd化學形態(tài)分別以 Se(Ⅵ) 處理(16.67%)、CK處理(20.63%)最高。

在地上部中，各處理的Cd化學形態(tài)規(guī)律與根系趨勢相似。即氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)的Cd組分在地上部中也占據(jù)主導地位，分別占總Cd含量的23.09%～38.61%和20.67%～26.96%。此外，在所有形式的硒處理中，氯化鈉提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)的Cd比例均高于CK處理，而硒處理的乙醇提取態(tài)與水提取態(tài)Cd比例皆低于CK處理。

3 討論與結(jié)論

土壤Cd污染已成為制約農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)的重要因素，已有研究表明，外源施用Se可有效降低植物對Cd的累積。本研究中，在Cd污染土壤中培養(yǎng)35 d后，與CK處理相比，除Se(Ⅵ)處理外，其他硒處理[SeNPs、Se(Ⅳ)、SeMet]均促進了油菜地上部、根系干物質(zhì)累積，同時硒處理的葉綠素總量和類胡蘿卜素含量整體大于CK處理。葉綠素是光合作用的主要色素，參與光能的吸收、轉(zhuǎn)移、分配以及轉(zhuǎn)化過程，類胡蘿卜素是重要的抗氧化劑，逆境環(huán)境下兩者皆可激發(fā)PSⅡ光反應系統(tǒng)的活性從而維持植物養(yǎng)分代謝。Ahmad等研究表明，在重金屬脅迫下硒可提高植物葉綠體中的淀粉積累、抑制葉綠體降解，從而維持植株生理代謝。因此，本研究中Cd脅迫下硒可能是通過提高光合色素含量從而保證油菜植株的生長發(fā)育。

污染土壤中，Cd容易從土壤轉(zhuǎn)移至植物體內(nèi)。前人研究表明，外源無機形態(tài)Se可降低污染土壤中小白菜、水稻、小麥等作物的Cd累積。本研究中，SeNPs、Se(Ⅳ)和SeMet處理均顯著降低了油菜地上部和根系的Cd濃度，并且有機態(tài)硒處理(SeMet)效果最佳，而Se(Ⅵ)處理中地上部Cd濃度顯著下降，但在根系中沒有顯著變化。這些結(jié)果表明不同硒形態(tài)對植株吸收Cd的阻遏能力不同，這可能是因為不同硒形態(tài)進入植物體的機制、數(shù)量以及在植株體內(nèi)的同化差異所致。此外，本研究中，所有硒處理均顯著降低了Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)，即亞硒酸鈉、硒酸鈉、硒代甲硫氨酸及納米硒4種形態(tài)硒皆可有效阻隔Cd向上運動。進一步研究表明，與無機形式的Se相比，有機硒處理(SeMet)的油菜植株硒含量最高；前人研究表明：有機硒是油菜作物吸收的主要硒形態(tài)，該研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。以往的研究表明，硒主要通過水分吸收途徑被植物根系吸收，因此直徑越小的硒形態(tài)越容易穿過細胞壁，從而到達植株體內(nèi)，因此植株的納米硒吸收量最高。然而本研究發(fā)現(xiàn)，SeNPs與Se(Ⅵ)的吸收量相當且皆顯著小于Se(Ⅳ)、SeMet，這意味著Se直徑并不是Se進入根系的先決條件。

在根系中，Cd在不同亞細胞組分比例表現(xiàn)為細胞壁>可溶性部分>細胞膜>細胞器，這種分布模式可能與植物緩解Cd脅迫的相應機制有關。在植物中，細胞壁是阻止Cd進入植物的首道屏障，但細胞壁對Cd的劫持能力有限，當細胞壁飽和后，可溶性部分的谷胱甘肽螯合Cd形成復合物，從而減少對細胞器的損傷。本研究表明，外源硒處理均降低了細胞壁中Cd比例，增加了可溶性部分中鎘的比例，這些結(jié)果表明，Se可以促進根系細胞壁和液泡螯合Cd；這一發(fā)現(xiàn)與Yu等的研究結(jié)果一致。Se的化學性質(zhì)與硫相似，兩者皆可能通過刺激植物中GSH(谷胱甘肽)和PC(植物螯合素)的合成來促進Cd螯合。在植物中Cd首先被根系吸收然后轉(zhuǎn)移到地上部，因此植物中存在的Cd形態(tài)可直接影響遷移能力和活性。在本研究中，醋酸提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)的Cd比例在油菜植株中占主導地位，該結(jié)果與Wang等的研究結(jié)論一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，Se的添加降低了根系中乙醇提取態(tài)和水提取態(tài)Cd的比例。這些結(jié)果表明，硒通過抑制根系到地上部的Cd易位來減少地上部中Cd的積累。綜上所述，硒增加了Cd在細胞壁和液泡中的螯合，降低了活性Cd的化學形式，從而減少了地上部Cd的積累。