李培謙， 藥 震， 邵元元， 馮寶珍

[1.北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西地表過程與智能模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南寧師范大學(xué))，廣西南寧 530000；2.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城 044000]

黃瓜真菌性枯萎病(Fusarium wilt disease)是黃瓜生產(chǎn)上的毀滅性病害之一，該病害由尖孢鐮刀菌黃瓜?；?f. sp.)引起，該病害在世界黃瓜種植區(qū)廣泛發(fā)生，給黃瓜生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。該病的化學(xué)防治常以多菌靈、咪鮮胺、惡霉靈、代森錳鋅等殺菌劑為主，但高頻次、大劑量使用化學(xué)藥劑給生態(tài)環(huán)境帶來巨大壓力，農(nóng)藥殘留和環(huán)境安全已經(jīng)成了危害人類健康的棘手問題。因而，從環(huán)保生態(tài)角度研究廣譜高效的生防菌對枯萎病防治具有不可替代的作用。

近年來報(bào)道的對黃瓜枯萎病具有拮抗作用的微生物有真菌、細(xì)菌和放線菌。棘孢木霉()、哈茨木霉()和擬康氏木霉()聯(lián)合接種對黃瓜枯萎病防效可達(dá)81.5%，而深綠木霉()的水分散粒劑效果優(yōu)于哈茨木霉。葡萄汁有孢漢遜酵母()菌株 1-101 在固體培養(yǎng)基上對黃瓜枯萎病病菌具有完全抑制作用。芽孢桿菌中巨大芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌等均對黃瓜枯萎病菌具有抑制作用。而放線菌中對黃瓜枯萎病具有良好抑制效果的生防菌以鏈霉菌屬()居多，如黃赭色鏈霉菌()11F菌株對黃瓜枯萎病防效為73.45%，比基尼鏈霉菌() HD-087菌株對黃瓜枯萎病菌具有明顯的抑制效果；對黃瓜枯萎病菌抑制率達(dá)到53.3%；龜裂鏈霉菌() M527菌株發(fā)酵產(chǎn)物黃瓜枯萎病菌的拮抗作用明顯。然而，放線菌資源豐富，種類繁多，已研究報(bào)道的種類有限。而且，由于目前使用的一些化合物的高殘留性以及病原物出現(xiàn)的抗藥性，所以挖掘新抗生素和其他生物活性代謝物仍然是新藥研究的重要目標(biāo)。

本研究以農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上難以防治的黃瓜枯萎病菌為靶標(biāo)，進(jìn)行拮抗放線菌篩選，并對高活性菌株進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩、種類鑒定、室內(nèi)及離體防效研究。本研究旨在為黃瓜枯萎病生物防治提供理論依據(jù)，也為拮抗生防菌資源開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2018年10月至2020年11月在運(yùn)城學(xué)院逸夫?qū)嶒?yàn)樓及智能溫室開展。2018年10月于山西省運(yùn)城市北相鎮(zhèn)黃瓜大棚采集土壤樣品，采用五點(diǎn)取樣法在健康黃瓜根際取土。取50～100 g土樣裝入無菌自封袋備用。供試病原菌黃瓜枯萎病菌(f. sp.)保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。

高氏一號培養(yǎng)基：1 g KNO、0.5 g KHPO、0.5 g MgSO、0.5 g NaCl、0.01 g FeSO、20 g可溶性淀粉，1 000 mL蒸餾水。馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，15 g 葡萄糖，1.5%瓊脂粉，1 000 mL 蒸餾水。10%小米培養(yǎng)基：10 g葡萄糖，3 g蛋白胨，2.5 g NaCl，2 g CaCO，10 g小麥，1 000 mL 蒸餾水，pH值=7.2。

1.2 放線菌的分離與純化

將風(fēng)干土樣研磨成粉，稱取10 g倒入90 mL無菌水中，攪拌溶解后靜置10 min，取上清液。將上清液梯度稀釋后與50 ℃左右高氏一號培養(yǎng)基混勻后倒平板，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周，長出菌落后轉(zhuǎn)接到新的高氏一號平板，具體方法參見文獻(xiàn)[15]。

1.3 拮抗放線菌的篩選

1.3.1 拮抗菌株的初篩 根據(jù)參見文獻(xiàn)[16]的方法，準(zhǔn)備放線菌和黃瓜枯萎病菌菌餅。將黃瓜枯萎病菌菌餅接種于PDA平板中央，同時(shí)將放線菌菌餅接種于距病原菌約2.0 cm的四周，25 ℃培養(yǎng)7 d，對照組只接黃瓜枯萎病菌菌餅。觀察病原菌菌落生長情況，并測量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2 放線菌發(fā)酵液活性測定 放線菌CA-6用高氏一號液體培養(yǎng)基于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h；然后再按6%的接種量接入到裝液量為 200 mL 的10%小米培養(yǎng)基中(500 mL三角瓶)，在上述培養(yǎng)條件下發(fā)酵5 d。發(fā)酵結(jié)束后，用快速定性濾紙抽濾得到發(fā)酵液；所得發(fā)酵液再用0.22 μm的無菌濾器過濾，置于4 ℃冰箱備用。

采用濾紙條法和牛津杯法檢測發(fā)酵液的抑菌活性。濾紙條法：PDA平板正中接病原菌菌餅，然后在菌餅兩側(cè)同等距離處貼濾紙條，然后加入 100 μL 發(fā)酵液浸潤，以無菌水作為對照，試驗(yàn)重復(fù)3次。牛津杯法：制備1.0×10個(gè)/mL黃瓜枯萎病分生孢子懸浮液，將200 μL 孢子懸浮液均勻涂布在PDA平板上，然后將4個(gè)無菌牛津杯均勻放置在PDA平板上，將200 μL發(fā)酵濾液置于牛津杯中，以無菌水為對照，將平板置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)5 d，然后測量抑菌圈寬度，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 拮抗菌株的分類地位

1.4.1 表型特征及生理生化特征 在高氏一號培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10 d，觀察氣生菌絲、基內(nèi)菌絲顏色，可溶性色素的有無，根據(jù)文獻(xiàn)描述的方法對菌株進(jìn)行初步鑒定。采用插片法觀察菌株CA-6在高氏一號培養(yǎng)基的基內(nèi)菌絲形態(tài)和孢子特征。菌株生理生化特性分析參照《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》和《微生物資源學(xué)》中相應(yīng)章節(jié)的描述進(jìn)行。

1.4.2 分子鑒定 利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取CA-6基因組DNA，以細(xì)菌16S rDNA通用引物27F：5′-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3′ 和1492R：5′-G G C T A C C T T G T T A C G A C T T-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系：2×Master Mix 25 μL、基因組DNA 1 μL、引物各1 μL，ddHO補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳初步檢測后，送到生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST 分析比對，并下載模式菌株的16S rDNA 序列。 采用MEGA-X構(gòu)建NJ(Neighbour-Joining)系統(tǒng)發(fā)育樹以明確菌株分類地位。

1.5 CA-6對黃瓜枯萎病的拮抗活性及防效測定

1.5.1 發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌絲生長的影響 25 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)將黃瓜枯萎病病菌在PDA平板上培養(yǎng)1周，用打孔器取菌餅(直徑7 mm)。將無菌發(fā)酵原液與PDA 培養(yǎng)基按一定比例混勻制成含藥平板，使發(fā)酵液稀釋成5、10、50、100、200 倍液；將菌餅接至平板中央，25 ℃下培養(yǎng)7 d 后，以十字交叉法測量菌落直徑大小，計(jì)算菌絲生長抑制率。菌絲生長速率計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。以無菌水的處理為對照，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5.2 發(fā)酵液對黃瓜枯萎病病菌分生孢子萌發(fā)的影響 制備濃度為1.0×10個(gè)/mL的黃瓜枯萎病孢子懸浮液；加入適量上述發(fā)酵液將孢子懸浮液終濃度調(diào)為1.0×10個(gè)/mL，于25 ℃暗培養(yǎng)24 h后鏡檢，每個(gè)處理觀察3個(gè)視野，分別觀察50 個(gè)分生孢子，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。如果分生孢子抽出芽管(芽管長度至少為分生孢子長度的一半)、長出菌絲，則判定分生孢子已萌發(fā)。以無菌水為對照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，參照文獻(xiàn)中方法計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.5.3 CA-6發(fā)酵液對盆栽黃瓜苗的防治效果 利用盆栽黃瓜苗測定CA-6對黃瓜苗期枯萎病的室內(nèi)防效。按上述方法制備黃瓜枯萎病病菌孢子懸浮液10個(gè)/mL，接種感病黃瓜品種(9930)的幼苗。試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理：(1)接種病原菌+CA-6發(fā)酵液原液；(2)接種病原菌分生孢子懸浮液，每個(gè)處理使病原菌分生孢子終濃度調(diào)節(jié)為10CFU/mL，分別移栽20棵黃瓜幼苗并用50 mL接種液灌根處理。具體測試方法參見文獻(xiàn)[23]。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，14 d后測量并記錄發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。病情指數(shù)=Σ(病株數(shù)×相應(yīng)級數(shù))/總株數(shù)×最高級數(shù)×100；防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(Duncan’s新復(fù)極差法，=0.05) 。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株分離

共獲得48株放線菌純培養(yǎng)，編號為CA-1～CA-48。通過形態(tài)觀察，初步去除重復(fù)菌株，根據(jù)平板對峙培養(yǎng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)對黃瓜枯萎病具有明顯拮抗作用的放線菌有5株(表1)，其中菌株CA-6抑菌率達(dá)69.36%，因此本研究選擇CA-6進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(圖1)。

表1 放線菌對黃瓜枯萎病菌的抑制作用初篩結(jié)果

2.2 拮抗放線菌復(fù)篩

對拮抗放線菌進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果表明，發(fā)酵液抑菌活性顯著，牛津杯周圍出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，抑菌圈直徑可達(dá)17.8 mm(圖2-A)；浸潤發(fā)酵液的無菌濾紙條具有明顯的抑制活性，而對照組病原菌能正常生長(圖2-B、圖2-C)。因此，放線菌CA-6發(fā)酵液具有明顯的抑菌活性，可以作為黃瓜枯萎病候選生防菌用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 CA-6菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 放線菌CA-6在高氏一號培養(yǎng)基上菌落呈扁平狀，近圓形，孢子絲乳白色，培養(yǎng)過程中無色素產(chǎn)生(圖3)；其基絲連續(xù)、氣生菌絲發(fā)達(dá)，可產(chǎn)生大量孢子。

2.3.2 生理生化特征 根據(jù)《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》和《微生物資源學(xué)》的相關(guān)章節(jié)方法對菌株生理生化進(jìn)行分析。由表2可知，菌株 CA-6 能使淀粉、纖維素水解，能使牛奶凝固和胨化，能使明膠液化，不能使硝酸鹽還原，不能產(chǎn)生硫化氫。能利用-葡萄糖、-果糖、蔗糖，不能利用麥芽糖、鼠李糖。

表2 菌株CA-6 的生理生化特征

2.3.3 分子鑒定 對放線菌株CA-6進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明，放線菌株CA-6的16S rDNA核苷酸總長為1 433 bp(GenBank登錄號：MW652689)。經(jīng)BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)與菌株 CA-6 同源性高者均屬于鏈霉菌屬。下載16個(gè)典型菌株的16S rDNA 序列用MEGA-X 軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹。圖4結(jié)果表明，菌株CA-6與(FN646641.1)親緣關(guān)系最近，聚為一支，因此將菌株CA-6 初步鑒定為卡那鏈霉菌()。

2.4 放線菌CA-6對黃瓜枯萎病的抑菌活性及盆栽防效

2.4.1 發(fā)酵濾液對黃瓜枯萎病分生孢子萌發(fā)的抑制作用 經(jīng)不同濃度發(fā)酵濾液處理的黃瓜枯萎病分生孢子萌發(fā)率差異明顯，說明CA-6 發(fā)酵濾液對黃瓜枯萎病菌分生孢子萌發(fā)具有明顯的抑制效果。稀釋5倍的發(fā)酵液處理的黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)抑制率達(dá)100.00%。當(dāng)發(fā)酵液稀釋10倍時(shí)對分生孢子的抑制率為87.50%，稀釋100倍時(shí)，對病原菌分生孢子萌發(fā)抑制率仍達(dá)54.80%，而當(dāng)稀釋到200倍時(shí)，抑制效果明顯減弱，分生孢子萌發(fā)抑制率只有13.71%，抑菌活性顯著降低(表3)。

表3 菌株CA-6發(fā)酵濾液對黃瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制作用

2.4.2 發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌生長的抑制效果 由表3可知，CA-6發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌菌絲生長抑制效果明顯。當(dāng)發(fā)酵液稀釋5倍時(shí)，對病原菌菌絲生長抑制率為96.22%；當(dāng)稀釋10倍時(shí)，抑制率為87.61%；當(dāng)稀釋100倍時(shí)，菌絲抑制率下降到50.30%。當(dāng)稀釋200倍時(shí)，菌絲抑制率為10.40%，抑菌活性顯著降低。

2.4.3 發(fā)酵液對黃瓜枯萎病的防效 將CA-6菌株發(fā)酵后進(jìn)行黃瓜枯萎病盆栽防效測定，結(jié)果(表4)表明，接種菌株CA-6發(fā)酵原液有效降低了黃瓜枯萎病的發(fā)病，發(fā)病率明顯降低，防治效果達(dá)67.37%。CA-6發(fā)酵液拮抗黃瓜幼苗枯萎病效果明顯，具有生防菌株的潛力，具有良好的應(yīng)用前景。

表4 菌株CA-6發(fā)酵濾液對盆栽黃瓜苗防病效果

3 討論與結(jié)論

真菌性枯萎病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上重要的土傳病害，主要由鐮孢菌屬真菌尖孢鐮孢菌(Schl.) 引起。據(jù)報(bào)道大田作物、園林花卉、林果及保護(hù)地蔬菜等均能發(fā)生真菌枯萎病，造成嚴(yán)重?fù)p失?？菸〔≡婺芰?qiáng)、 傳播途徑多，一旦發(fā)病很難根治。因此，近年來利用高活性生防菌防治枯萎病是治理該類病害的重要途徑。篩選高防效拮抗微生物菌株是生防制劑開發(fā)的重要基礎(chǔ)，本研究從黃瓜根際土壤中分離到一株對黃瓜枯萎病菌具有強(qiáng)烈拮抗作用的菌株CA-6，該菌株對黃瓜枯萎病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用明顯。目前國內(nèi)外枯萎病拮抗放線菌以鏈霉菌屬生防菌報(bào)道居多，HD-087對黃瓜枯萎病菌具有明顯的抑制效果；菌株S-101()能抑制黃瓜枯萎病菌，而且對尖鐮孢菌黏團(tuán)專化型(f. sp.)有抑制作用；對苦瓜枯萎病具有良好的抑制作用；sp.CB-75 對香蕉枯萎病有較好的抑制作用；這些研究均表明鏈霉菌具有控制土傳病害的巨大潛力。據(jù)報(bào)道，卡那鏈霉菌對苜蓿炭疽病菌及粉紅鐮孢、尖鐮孢等苜蓿根腐病菌均表現(xiàn)出良好的拮抗效果；本研究將菌株CA-6初步鑒定為卡那鏈霉菌，該研究首次報(bào)道了用于枯萎病防治的卡那鏈霉菌。

鏈霉菌應(yīng)用于生物防治主要是利用活體競爭作用，誘導(dǎo)或提高植物抗病性和代謝產(chǎn)物抑菌作用。本研究中濾紙條和牛津杯試驗(yàn)結(jié)果均能證明CA-6發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌拮抗效果顯著。本研究中共同接種黃瓜枯萎病菌與放線菌時(shí)比單一接種病原菌組的黃瓜苗發(fā)病率降低了42.09百分點(diǎn)，溫室條件下，CA-6發(fā)酵液對黃瓜苗期枯萎病的防效達(dá)到67.38%，表明放線菌CA-6對病原菌的生防作用是由于發(fā)酵活性物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，放線菌菌株 S-101發(fā)酵液對黃瓜枯萎病防效達(dá)57.11%，殺結(jié)節(jié)鏈霉菌()的代謝產(chǎn)物對稻瘟病的抑菌作用，都與本研究結(jié)果相似；而鏈霉菌菌株0250菌懸液對盆栽和大田苦瓜枯萎病菌的防效和促生作用明顯，說明放線菌具有抑菌促生作用。而影響放線菌抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的關(guān)鍵因素是發(fā)酵條件，因此優(yōu)化發(fā)酵條件是提高活性成分含量的必經(jīng)途徑。本試驗(yàn)通過小米培養(yǎng)基發(fā)酵，后續(xù)研究將通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，以確定最佳發(fā)酵條件，提高活性成分含量。再者，生防菌能否在植物根部定殖也是決定大田試驗(yàn)效果的重要因素，本研究下一步將通過熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)確定其定殖特性。本研究未確定該放線菌的抑菌活性物質(zhì)，后續(xù)將通過層析技術(shù)、色譜技術(shù)等確定活性物質(zhì)的成分及結(jié)構(gòu)。