張彥紅 高凌云 李穎斌 馬莉 劉日明

耳聾是我國(guó)常見的出生缺陷之一，給患者帶來了巨大的痛苦和生活不便。我國(guó)耳聾在新生兒中的發(fā)病率為1‰～3.47‰，遺傳因素致聾比例高達(dá)50%～60%[1]。目前，遺傳性耳聾相關(guān)基因很多，我國(guó)人群中耳聾基因的突變70%來源于GJB2、GJB3、SLC26A4和mt DNA 12S rRNA[2～6]。為了解煙臺(tái)地區(qū)新生兒耳聾基因的突變情況，本研究采用微陣列基因芯片方法篩查，并聯(lián)合Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，探討耳聾基因篩查在預(yù)防新生兒遺傳性耳聾發(fā)生的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年11月1日～2021年6月30日煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院正常分娩的3785例新生兒作為研究對(duì)象，該研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，監(jiān)護(hù)人接受新生兒遺傳性耳聾基因檢測(cè)，并簽署知情同意書。按照《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范（2010 版）》和采血常規(guī)要求[7]，采取新生兒足跟血制備濾紙干血斑，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

采用15項(xiàng)遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測(cè)試劑盒（微陣列芯片法）（北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，國(guó)械注準(zhǔn)20173401343）。芯片洗干儀（北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，晶芯SlideWasher 24），微陣列芯片掃描儀（北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，晶芯LuxScan 10K-B）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 采用打孔器取1個(gè)直徑6 mm干血斑標(biāo)本，采用濾紙干血斑核酸提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 按照被檢樣品數(shù)的3倍準(zhǔn)備200 μl八聯(lián)排管，并在管上標(biāo)記樣品編號(hào)，3套管一一對(duì)應(yīng)。將融化后混勻的PCR擴(kuò)增試劑A、B、C按20 μl/管分別裝到3個(gè)PCR擴(kuò)增管中。向A、B、C3管擴(kuò)增試劑中分別加入5 μl樣品基因組DNA，作為PCR擴(kuò)增的模板，每份PCR反應(yīng)體系總體積為25 μl，在ABI 9700上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：階段1：活化37℃ 10 min，95℃ 15 min；階段2：35個(gè)循環(huán)（95℃30 s；變溫速度 0.4 ℃/s；57 ℃ 30 s；變溫速度0.2 ℃/s；70℃ 45 s）；降溫60 ℃ 10 min，12 ℃ 1 h。

1.3.3 芯片檢測(cè) 將PCR產(chǎn)物純化、雜交、芯片洗滌干燥（開啟芯片洗干儀，設(shè)置參數(shù)：洗滌Ⅰ，42 ℃，洗滌1次，2 min，力度3；洗滌Ⅱ，42 ℃，洗滌2次，每次1 min，力度3）、使用晶芯?LuxScan?10K-B微陣列芯片掃描儀和晶芯?15項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)分析系統(tǒng)（微陣列芯片法）進(jìn)行信號(hào)讀取及判斷和結(jié)果判讀檢測(cè)結(jié)果由晶芯?十五項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)分析系統(tǒng)（微陣列芯片法）自動(dòng)判讀。

1.3.4 結(jié)果驗(yàn)證 對(duì)基因芯片檢測(cè)出現(xiàn)突變位點(diǎn)的樣本使用一代測(cè)序法（Sanger測(cè)序法）進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。組間比較采用Pearson和似然比卡方檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonferroni法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耳聾基因突變?cè)谛詣e中的分布情況

3785例新生兒遺傳性耳聾基因檢測(cè)，總共檢出255例突變，總突變率為6.74%。3785例新生兒包括2135例男孩和1650例女孩，其突變攜帶率分別為6.93%（148/2135）和6.48%（107/1650），男孩略高于女孩，但無顯著差異（χ2=0.296，P=0.586）。

2.2 耳聾基因單基因突變檢測(cè)情況

3785例新生兒中，單基因雜合突變242例，突變率6.39%。其中GJB2突變攜帶者134例，攜帶率3.55%（134/3785）；SLC26A4突變攜帶者85例，攜帶率2.25%（85/3785）；GJB3突變攜帶者12例，攜帶率0.32%（12/3785）；線粒體耳聾基因相關(guān)突變攜帶者11例，攜帶率0.29%（11/3785），其中8例1555 A＞G同質(zhì)突變和3例1555 A＞G異質(zhì)突變。對(duì)于煙臺(tái)地區(qū)新生兒耳聾基因單基因突變，GJB2突變率最高，其次是SLC26A4，GJB3和mt DNA 12S rRNA突變率最低，見表1。

表1 3785例新生兒耳聾基因單基因突變位點(diǎn)篩查結(jié)果

2.3 耳聾基因多位點(diǎn)突變檢測(cè)情況

3785例新生兒中，有13例耳聾基因雙位點(diǎn)突變，突變率0.34%（13/3785）。其中，6例非等位基因復(fù)合雜合突變（1例c.235delC/c.538 C＞T、2例c.299_300delAT/IVS 7-2 A＞G、1例c.299_300delAT/c .2168 A＞G、1例c.235delC/IVS15+5 G＞A和1例c.235delC/IVS 7-2 A＞G），5例等位基因復(fù)合雜合突變（1例c.235delC/c.299_300delAT、3例c.2168 A＞G/IVS 7-2 A＞G和1例c.2168 A＞G/C.1975G＞C），2例核基因與線粒體基因復(fù)合變異（2例c.235delC/m.1555 A＞G），見表2。

表2 3785例新生兒耳聾基因雙位點(diǎn)突變篩查結(jié)果

2.4 與山東省耳聾基因突變情況比較

為了解煙臺(tái)地區(qū)新生兒耳聾基因在山東省的突變情況，本研究匯總山東省各地區(qū)（煙臺(tái)、東營(yíng)、濟(jì)寧、淄博、濟(jì)南、威海）近5年新生兒耳聾基因的情況[6，8～11]。山東省各地區(qū)累計(jì)檢測(cè)102903例新生兒，共檢出耳聾基因 突變攜帶者5703例，總突變率5.54%，分別檢出2781例GJB2、2143例SLC26A4、414例GJB3、303例mtDNA 12S rRNA和62例多位點(diǎn)復(fù)合變異，其突變率分別是2.70%、2.08%、0.40%、0.29%和0.06%。對(duì)于新生兒耳聾基因總突變率和GJB2突變率，煙臺(tái)地區(qū)（6.74%，3.55%）顯著高于山東省平均突變情況(5.54%，2.70%；χ2=32.20，P＜0.001)；而SLC26A4、GJB3和mtDNA 12S rRNA基因突變率煙臺(tái)地區(qū)與山東省平均突變情況相比無顯著性差異（P＞0.05）。針對(duì)相同的檢測(cè)方法（微陣列芯片檢測(cè)法）和篩查位點(diǎn)（4個(gè)基因15個(gè)位點(diǎn)），煙臺(tái)地區(qū)耳聾基因突變率與淄博地區(qū)比較，有顯著差異（χ2=81.22，P＜0.001）。對(duì)于新生兒耳聾基因總突變率，煙臺(tái)地區(qū)（6.74%）明顯高于淄博地區(qū)（5.20%）(P＜0.05)。對(duì)于GJB2基因突變率，煙臺(tái)地區(qū)(3.55%)與淄博地區(qū)（2.63%）相比，有顯著差異(P＜0.05)。對(duì)于SLC26A4、GJB3和mtDNA 12S rRNA基因突變率，煙臺(tái)地區(qū)與淄博地區(qū)相比，均無顯著性差異（P＞0.05）。總體而言，對(duì)于新生兒耳聾基因總突變率和GJB2基因突變率，煙臺(tái)地區(qū)明顯高于山東省平均突變率；對(duì)于SLC26A4、GJB3和mtDNA 12S rRNA基因突變率，與山東省平均突變率相比無差異(P＞0.05)，見表3。

表3 山東省各地區(qū)耳聾基因突變情況匯總[%（n）]

3 討論

耳聾是一種常見的感覺障礙性疾病，遺傳、環(huán)境因素或兩者共同作用，60%以上與遺傳因素有關(guān)[1]。遺傳性耳聾基因很多，截止目前耳聾基因至少有121個(gè)[2]，其變異位點(diǎn)和遺傳模式存在高度異質(zhì)性，導(dǎo)致病因診斷的困難。因此，開展新生兒耳聾基因篩查，可早診斷、早治療，有效干預(yù)耳聾的發(fā)生，尤其是母系遺傳的藥物性耳聾基因和遲發(fā)型耳聾基因所致。

GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體mt DNA 12S rRNA是遺傳性耳聾常見的致病基因[2，12]。本研究利用微陣列芯片法檢測(cè)4個(gè)基因15個(gè)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)3785新生兒中有255例耳聾基因突變，突變率為6.74%，高于山東省耳聾基因平均突變情況（5.54%），也高于淄博地區(qū)報(bào)道的4個(gè)基因15個(gè)位點(diǎn)的耳聾突變率（5.20%）[9]?？傮w上，煙臺(tái)地區(qū)新生兒耳聾基因的突變率高于山東省平均突變率，為煙臺(tái)地區(qū)新生兒預(yù)防遺傳性耳聾有一定指導(dǎo)意義。

我國(guó)人群中，GJB2基因是最常見的非綜合征型遺傳性耳聾突變基因，該基因位于13q11～q12，編碼縫隙連接蛋白26，屬于常染色體隱性遺傳[13]。GJB2基因突變導(dǎo)致聽力損失的個(gè)體化差異較大，但大部分患者可通過植入人工耳蝸改善聽力。本研究，煙臺(tái)地區(qū)GJB2基因突變率（3.55%），明顯高于淄博地區(qū)（2.63%）該基因的突變率[9]，也高于山東省平均突變率水平（2.70%），也高于國(guó)內(nèi)人群流調(diào)GJB2基因突變率（2.42%）[1]。其中，以c.235delC檢出率最高，而c.35delG位點(diǎn)在本研究中僅檢測(cè)出1例。同時(shí)，還檢出6例非等位基因復(fù)合雜合突變、2例核基因與線粒體復(fù)合突變和1例等位基因復(fù)合雜合突變。

SLC26A4基因位于7q31，含21個(gè)外顯子，編碼穿膜蛋白Pendrin，屬于常染色體隱性遺傳，其突變會(huì)導(dǎo)致先天性或遲發(fā)性耳聾，通常伴有前庭水管擴(kuò)大[14]。本研究篩查發(fā)現(xiàn)85例SLC26A4單基因雜合突變（2.25%），與山東省平均突變率（2.08%）無顯著差異；與淄博地區(qū)（1.88%）相比無顯著差異[9]。其中，煙臺(tái)地區(qū)IVS 7-2 A＞G位點(diǎn)檢出率（1.32%）最高，這與國(guó)內(nèi)流調(diào)檢出率（1.34%）相一致[1]，而c.1229 C＞T位點(diǎn)僅檢出1例。同時(shí)，檢出4例SLC26A4等位基因復(fù)合雜合突變（3例c.2168 A＞G/IVS 7-2 A＞G和1例c.2168 A＞G/C.1975G＞C）。

GJB3基因位于1p33～35，編碼縫隙連接蛋白31，該基因突變可導(dǎo)致高頻聽力損失或后天性耳聾[15]。攜帶GJB3基因c.538C＞T位點(diǎn)雜合突變的35例攜帶者（年齡23～37歲）聽力正常[16]。本研究發(fā)現(xiàn)12例攜帶GJB3基因c.538C＞T位點(diǎn)雜合的新生兒（0.32%），與山東省該基因的平均突變率（0.40%）相比無顯著性差異（P＞0.05），與淄博地區(qū)報(bào)道相一致[9]。遺傳性耳聾基因篩查規(guī)范認(rèn)為，如果攜帶該基因變異者通過新生兒聽力初篩，建議進(jìn)入常規(guī)兒童保健流程，除非有聽力下降的表現(xiàn)，否則不需要進(jìn)行定期聽力檢查[1]。因此，攜帶GJB3基因的新生兒聽力正常，可以不需要定期監(jiān)測(cè)聽力情況；若未通過，則需要進(jìn)一步行診斷性聽力檢查，以明確耳聾的病因。

線粒體耳聾相關(guān)基因變異（均質(zhì)性變異或異質(zhì)性變異）受檢者及母系家族成員均為藥物敏感個(gè)體，應(yīng)終生慎用氨基糖苷類抗生素，以避免藥物性耳聾的發(fā)生[17]。目前線粒體耳聾相關(guān)基因研究最多位點(diǎn)是mtDNA12S rRNA的mt.1555A＞G和mt.1494C＞T位點(diǎn)。本研究共檢出13例線粒體相關(guān)耳聾基因突變，均是mt.1555A＞G位點(diǎn)的突變，mt.1494C＞T位點(diǎn)未檢出。本研究mtDNA12S rRNA基因突變率（0.29%），與山東省該基因平均突變率（0.29%）相一致，與淄博地區(qū)報(bào)道的突變率也無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異[9]。其中包括11例線粒體突變（8例均質(zhì)性突變和3例異質(zhì)性突變）和2例核基因與線粒體復(fù)合突變。對(duì)于線粒體耳聾相關(guān)基因突變的患者，避免使用氨基糖苷類抗生素，以防止藥物性耳聾的發(fā)生。

綜上所述，本研究通過對(duì)煙臺(tái)地區(qū)3785例新生兒進(jìn)行耳聾基因篩查，初步確定煙臺(tái)地區(qū)常見遺傳性耳聾基因的突變類型和突變率。發(fā)現(xiàn)煙臺(tái)地區(qū)耳聾基因總突變率明顯高于山東省平均突變率，尤其是GJB2基因的突變率要高于山東省其他地區(qū)，將考慮擴(kuò)大研究新生兒的數(shù)量，結(jié)合聽力篩查，明確煙臺(tái)地區(qū)新生兒的耳聾情況。及時(shí)干預(yù)和治療，有效預(yù)防和減少耳聾的發(fā)生。