張憲

七味都?xì)馔枋怯纱孜逦蹲?、山茱萸、澤瀉、牡丹皮、熟地黃、茯苓、山藥七味藥材，經(jīng)粉碎、過(guò)篩、制丸、干燥等工序制成的中藥丸劑品種，該產(chǎn)品具有補(bǔ)腎納氣、澀精止遺等功效，臨床主要用于治療腎不納氣所致喘促、胸悶、久咳、氣短、咽干、遺精、盜汗、小便頻數(shù)等病癥［1-2］。方中醋五味子藥材有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心等功效［3-5］，山茱萸藥材有補(bǔ)益肝腎、收澀固脫等功效［6-8］，澤瀉藥材有利水滲濕、泄熱、化濁降脂等功效［9-12］。七味都?xì)馔枧R床應(yīng)用較為廣泛，先收載于《中國(guó)藥典》2015年版中，但其質(zhì)量控制方法中僅針對(duì)五味子醇甲進(jìn)行含量測(cè)定［13］，不能更好地體現(xiàn)該產(chǎn)品的整體質(zhì)量水平，為保障廣大病癥病人的用藥安全，林芳等［14］通過(guò)五味子醇甲含量測(cè)定建立了七味都?xì)馔璧馁|(zhì)量控制方法，胡曉煒通過(guò)五味子酯甲、五味子甲素含量測(cè)定建立了七味都?xì)馔璧馁|(zhì)量控制方法［15］，上述學(xué)者均采用控制五味子藥材活性成分含量建立質(zhì)控方法，研究藥材種類單一，沒有將該產(chǎn)品中起功能作用的主藥成分進(jìn)行含量測(cè)定。本研究于2019年3月至2022年5月進(jìn)行，針對(duì)該產(chǎn)品中的起功能作用的藥材五味子、山茱萸和澤瀉，研究開發(fā)高效液相色譜法檢測(cè)七味都?xì)馔柚谢钚猿煞治逦蹲哟技?、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B含量的分析方法［16-19］。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1200型高效液相色譜儀（配備自動(dòng)進(jìn)樣器、四元泵、二極管陣列檢測(cè)器（PDA）、柱溫箱等，安捷倫科技公司）；Waters X-bridge C18色譜柱（沃特世科技公司）；Sartorious Quintix224-1CN型電子天平（賽多利斯科技公司）；HY-CXJ型數(shù)控超聲波清洗器（長(zhǎng)沙匯一儀器公司）；Milli-Q Advantage A10型純水儀（密理博科技公司）。

1.2 試藥對(duì)照品：五味子醇甲（批號(hào)110857-201815，含量99.7%）；馬錢苷（批號(hào)111640-201808，含量99.0%）；23-乙酰澤瀉B（批號(hào)111846-201705，含量99.7%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；七味都?xì)馔瑁廴葜袃S（集團(tuán)）股份有限公司藥業(yè)公司，批號(hào)20181214、20190112、20190506，規(guī)格為每40丸重3 g］；甲醇、乙腈為色譜純（美國(guó)TEDIA公司）；磷酸為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠）；純化水為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Waters X-bridge C18液相色譜柱（規(guī)格250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.3%磷酸溶液（取3.0 mL濃磷酸，加水至1 000 mL，混勻，超聲脫氣），梯度洗脫 ，洗 脫 程 序 為 ：0～7 min 8%A，7～18 min 8%～60%A，18～28 min 60%～91%A，28～30 min 91%～8%A，30～35min 8%A；流 速 ：1.0 mL/min；柱 溫 ：30℃；進(jìn)樣體積：25 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm。

2.2 溶液配制對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：取五味子醇甲25.08 mg、馬錢苷25.25 mg、23-乙酰澤瀉醇B 25.08 mg，精密稱定，置同一支25 mL容量瓶中，加20 mL 90%甲醇溶液使溶解并定容至刻度，搖勻。

對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加90%甲醇溶液定容，搖勻。

供試品溶液：取七味都?xì)馔铇悠?5 g，研細(xì)，65目篩網(wǎng)篩過(guò)；精密稱取細(xì)粉1.0 g，置20 mL容量瓶中，加90%甲醇溶液約12 mL，超聲提取30 min（功率240 W，頻率45 kHz），放冷，加90%甲醇溶液定容，搖勻，0.22 μm濾膜濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液。

試劑空白溶液：除不加樣品外，其余步驟按供試品溶液處理方法進(jìn)行，制備試劑空白溶液。

陰性供試品溶液：按七味都?xì)馔柚苽浞椒ê退幉呐浔缺壤?，制備缺醋五味子、山茱萸和澤瀉的陰性樣品，陰性供試品按供試品溶液配制方法進(jìn)行前處理，得陰性供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察專屬性試驗(yàn)：取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液、試劑空白溶液、對(duì)照品溶液和陰性供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別上機(jī)分析，采集色譜圖；結(jié)果馬錢苷、五味子醇甲和23-乙酰澤瀉醇B在該色譜條件下分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000，拖尾因子為0.95～1.05，且陰性供試品溶液中無(wú)干擾峰。典型譜圖見圖1

線性關(guān)系考察：取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，制備含馬錢苷、五味子醇甲和23-乙酰澤瀉醇B質(zhì)量濃度依次為：0.2 mg/L、0.4 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L和20.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，加90%甲醇溶液定容至刻度，搖勻；按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別上機(jī)分析，采集色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果三種成分在質(zhì)量濃度為0.2～20.0 mg/L范圍內(nèi)，均具有良好的線性。見表1。

表1 三種成分線性方程、范圍及相關(guān)系數(shù)

精密度試驗(yàn)：取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件上機(jī)分析，連續(xù)進(jìn)樣6針，采集色譜圖；按三種成分峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）；結(jié)果馬錢苷、五味子醇甲和23-乙酰澤瀉醇B峰面積RSD分別為：1.1%、1.2%和0.98%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取七味都?xì)馔铇悠?，按?.2”項(xiàng)下供試品溶液進(jìn)行前處理，得供試品溶液，同法同一批供試品共配制6份；按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別上機(jī)分析，采集色譜圖，分別計(jì)算三種成分的含量，根據(jù)6次檢測(cè)結(jié)果計(jì)算RSD。結(jié)果馬錢苷、五味子醇甲和23-乙酰澤瀉醇B含量RSD分別為：1.7%、2.1%和1.4%，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取七味都?xì)馔铇悠?，按?.2”項(xiàng)下供試品溶液進(jìn)行前處理，得供試品溶液；室溫下分別放置0 h，3 h，6 h，9 h，12 h，18 h，24 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣1次，分別上機(jī)分析，采集色譜圖。結(jié)果馬錢苷、五味子醇甲和23-乙酰澤瀉醇B峰面積RSD分別為：1.4%、1.8%和1.6%，表明在室溫下24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

加標(biāo)回收試驗(yàn)：取已測(cè)定含量的七味都?xì)馔铇悠罚欣徰谐杉?xì)粉，65目篩網(wǎng)篩過(guò)；取細(xì)粉1.0 g，精密稱定，置20 mL容量瓶中，分別加入“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液一定量，后續(xù)按供試品溶液處理，共制備6份加標(biāo)溶液；按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別上機(jī)分析，采集色譜圖，計(jì)算馬錢苷、五味子醇甲和23-乙酰澤瀉醇B加標(biāo)回收率。見表2

表2 樣品加標(biāo)回收率結(jié)果

2.4 市售樣品含量測(cè)定取市售七味都?xì)馔铇悠?，按?.2”項(xiàng)下供試品溶液進(jìn)行前處理，得供試品溶液；按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別上機(jī)分析，采集色譜圖，根據(jù)峰面積計(jì)算馬錢苷、五味子醇甲和23-乙酰澤瀉醇B的含量。見表3

表3 樣品含量檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇實(shí)驗(yàn)選擇的三種待測(cè)成分，馬錢苷、五味子醇甲和23-乙酰澤瀉醇B，均具有強(qiáng)烈的紫外吸收，因此可以選擇分光光度法和液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定。分光光度法由于專屬性較差，且易受到基質(zhì)干擾導(dǎo)致準(zhǔn)確度偏低，尤其對(duì)于多組分同時(shí)測(cè)定，檢測(cè)效率偏低；高效液相色譜法具有專屬性好，尤其對(duì)于多組分的測(cè)定，采用二極管陣列檢測(cè)器，可以針對(duì)不同組分紫外吸收波長(zhǎng)的不同，分別準(zhǔn)確度定量檢測(cè)。因此實(shí)驗(yàn)選擇高效液相色譜法作為檢測(cè)方法。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取馬錢苷對(duì)照品，加90%甲醇溶液制備含馬錢苷質(zhì)量濃度為10 mg/L的波長(zhǎng)檢查溶液同法配制五味子醇甲和23-乙酰澤瀉醇B波長(zhǎng)檢查溶液；上述三種成分標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描；結(jié)果馬錢苷、五味子醇甲和23-乙酰澤瀉醇B分別在239 nm、250 nm和210 nm處有最大吸收，為使三種成分在2.1色譜條件下響應(yīng)零號(hào)，故選擇228 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇實(shí)驗(yàn)分別選擇乙腈-水、乙腈-0.3%磷酸水溶液、甲醇-水和甲醇-0.3%磷酸水溶液作為流動(dòng)相體系，考察上述4種體系對(duì)待測(cè)成分色譜行為的影響；按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，保持其他條件不變，分別采用上述4種流動(dòng)相體系，考察三種成分分離情況。結(jié)果，選擇乙腈-0.3%磷酸水溶液作為流動(dòng)相體系時(shí)，馬錢苷、五味子醇甲和23-乙酰澤瀉醇B分離度最佳，且陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。故實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-0.3%磷酸水溶液作為流動(dòng)相體系。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜法檢測(cè)七味都?xì)馔柚谢钚猿煞治逦蹲哟技?、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B含量的分析方法，考察了方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率等，確定了流動(dòng)相體系和檢測(cè)波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該方法具有前處理簡(jiǎn)單、測(cè)定效率高、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可以用于七味都?xì)馔杵贩N的質(zhì)量控制。