低磷脅迫下內(nèi)生真菌對(duì)臺(tái)灣相思葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2022-09-20 08:59何晨陽王耘籽周艷芬吳承禎
何晨陽，陳 瓏，王耘籽，周艷芬，李 鍵，吳承禎,2，洪 滔*
(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)過程與經(jīng)營(yíng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 南平 354300)
磷元素是植物生命過程中重要的營(yíng)養(yǎng)元素之一，其通過參與植物體各部分的生理過程，調(diào)控植物的光合作用[1]，在碳水化合物、含氮化合物、脂肪、糖類的代謝[2-4]過程中對(duì)植物的信號(hào)傳導(dǎo)起關(guān)鍵作用，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性有著重要影響[5].現(xiàn)有研究表明磷素的匱乏會(huì)導(dǎo)致植物葉片中總氮含量和可溶性蛋白含量下降，葉片中色素缺乏，葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[6]，引起潛在的光氧應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致葉綠體中活性氧濃度增加，損害植物的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害[7].人工林因密度種植和連栽[8]，對(duì)土壤有效磷含量需求極大[9]，而我國(guó)南方林區(qū)普遍存在土壤磷素礦化現(xiàn)象，磷素難以被有效利用[10]，極大地限制了人工林光合效率的提高，制約著人工林的可持續(xù)經(jīng)營(yíng).
臺(tái)灣相思(Acaciaconfusa)為含羞草科金合歡屬常綠喬木，產(chǎn)于中國(guó)臺(tái)灣，廣泛分布在福建、廣東等地區(qū)，因其具有生長(zhǎng)快、耐貧瘠、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，已取代連栽后防護(hù)效益下降的木麻黃林，逐步成為東南沿海地區(qū)海岸防護(hù)林的重要改造樹種[11].現(xiàn)有研究表明，臺(tái)灣相思為磷素受限樹種[12]，栽植臺(tái)灣相思的沙跡地土壤磷素匱乏[13].因此，如何在低磷條件下提高臺(tái)灣相思對(duì)有效磷的利用效率，以促進(jìn)其在沿海防護(hù)林體系建設(shè)中的應(yīng)用極為重要.
為改善林木應(yīng)對(duì)低磷環(huán)境的脅迫，前人已從植物根系形態(tài)[14]及根系分泌物[15]、植物生長(zhǎng)及生理生化特性[16]等方面做了大量研究，雖取得一定成效，但囿于成本或生境復(fù)雜，目前還未形成低成本的高效方法.因此，近年來利用微生物與植物互利共生特性來提升植物的環(huán)境適應(yīng)性已成為研究熱點(diǎn)，在杉木篩選及其適應(yīng)磷脅迫的離子流機(jī)制[17]、叢枝菌根真菌和根際細(xì)菌群落的跨界互作網(wǎng)絡(luò)[18]、不同混播方式的燕麥(Avenasativa)與箭筈豌豆(Viciasativa)混植草地對(duì)磷利用效率的影響[19]的研究中，已成功利用微生物提升了磷的利用效率.前人發(fā)現(xiàn)利用植物內(nèi)生真菌能有效提升尾巨桉(E.urophylla×E.grandis)、黑麥草(Loliumperenne)和杉木(Cunninghamialanceolata)的光合作用效率[20-22]，但對(duì)臺(tái)灣相思是否存在與其內(nèi)生真菌有互利共生特性，及其對(duì)提升植物光合適應(yīng)性的作用，目前尚未見報(bào)道.因此，本研究在前期篩選臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌[11]的基礎(chǔ)上，通過磷脅迫方式分析臺(tái)灣相思的光合作用相關(guān)指標(biāo)變化，以解析低磷條件下內(nèi)生真菌對(duì)臺(tái)灣相思葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?，初步了解?nèi)生真菌與宿主臺(tái)灣相思協(xié)同應(yīng)對(duì)磷素脅迫的生理機(jī)制，以期為臺(tái)灣相思促生工程菌的開發(fā)提供參考，亦為東南沿海海岸防護(hù)林可持續(xù)改造提供基礎(chǔ)依據(jù).
1 材料與方法
1.1 材 料
試驗(yàn)用苗為一年生臺(tái)灣相思幼苗(福建漳州林業(yè)局提供)，苗木采用土培方式定植于塑料盆(高20 cm、直徑21 cm)，每盆裝3 kg黃壤(土壤類別為二類)，等量甲醛熏蒸消毒，定植后緩苗30 d.土壤化學(xué)性質(zhì)經(jīng)測(cè)定，含有機(jī)質(zhì)8.311 mg/g、全氮0.107 mg/g、水解氮0.035 mg/g、全磷0.353 mg/g、有效磷0.019 mg/g、全鉀2.889 mg/g、速效鉀0.025 mg/g.
試驗(yàn)菌株為前期從臺(tái)灣相思中篩選并鑒定的溶磷效果較好的4株內(nèi)生真菌[11]：絲黑粉菌屬F (Filobasidiumsp.)、青霉屬I (Penicilliumsp.)、青霉屬E (Penicilliumsp.)、青霉屬N (Penicilliumsp.).因預(yù)試驗(yàn)中菌株F與I產(chǎn)生較大溶磷圈，故設(shè)置菌株FI混合菌組，進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)勢(shì)菌株結(jié)合的溶磷效果.菌種均保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，F(xiàn)、I、E、N菌種保藏號(hào)分別為CGMCC 12102、CGMCC 11914、CGMCC 11913、CGMCC 11907.
1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
1.2.1 菌液制備與接種
將供試菌種F、I、E、N分別接入40 mL的菌液培養(yǎng)基，恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，采用血球計(jì)數(shù)法，用無菌水稀釋成密度為5.5×106mL-1的菌液.FI菌液由F菌液與I菌液按質(zhì)量比1∶1混合制得.連續(xù)3 d 在苗木根際施加100 mL上述菌液，以加入同體積滅活的稀釋培養(yǎng)基溶液為對(duì)照(CK)，共F、I、E、N、FI、CK 6個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù).
1.2.2 低磷脅迫處理
試驗(yàn)均于玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行，室溫18～28 ℃，濕度75%，光照時(shí)長(zhǎng)14 h/d.生長(zhǎng)季節(jié)早晚各淋水1次，每次淋水淋透基質(zhì)[23].試驗(yàn)期間均勻澆施1次無磷1/3 Hoagland/7d 營(yíng)養(yǎng)液[24]，每盆每次澆施30 mL[25].接菌15 d后開始低磷脅迫處理，采用KH2PO4作為磷肥，設(shè)置4個(gè)磷處理水平[23,26]，分別為無磷處理(0 mg/kg)、重度磷脅迫(10 mg/kg)、輕度磷脅迫(20 mg/kg)和適量供磷(40 mg/kg)，每個(gè)水平3個(gè)重復(fù)，并分別對(duì)應(yīng)F、I、E、N、FI、CK 6個(gè)接菌方式，共計(jì)72盆.分別于脅迫30，50，70，90 d時(shí)進(jìn)行葉綠素含量取樣測(cè)定[27].
1.3 測(cè)定方法
1.3.1 葉綠素含量測(cè)定
采用丙酮乙醇提取法測(cè)定葉綠素含量[28]，取大小相對(duì)一致的健康葉片，洗凈吸干水分后，稱取0.1 g鮮葉放入試管，加入15 mL混合液(丙酮與乙醇體積比為1∶1).在室溫下暗反應(yīng)24 h后，分別于663 nm和645 nm測(cè)定上清液的吸光度(A663和A645)，葉綠素含量(mg/g)計(jì)算公式如下：
葉綠素含量=(8.04×A663+20.3×A645)×
V/(1 000×W)，
式中，V為提取液總體積(mL)，W為葉鮮質(zhì)量(g).各樣品重復(fù)測(cè)定3次后取平均值.
1.3.2 葉綠素?zé)晒馓匦詼y(cè)定
采用Os-5p型便攜式葉綠素?zé)晒鈨x(Opti-science，USA)于晴朗無云天氣連續(xù)3 d(上午9：00—11：00)進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定：選擇植株中上部陽向枝條上展開的葉齡一致的葉片，用暗反應(yīng)夾對(duì)葉片進(jìn)行暗適應(yīng)30 min后，測(cè)定待測(cè)葉片的初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)和可變熒光(Fv)，并計(jì)算光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的活性(Fv/Fo)及最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm).
1.4 數(shù)據(jù)處理與分析
數(shù)據(jù)整理與作圖均采用Excel 2007軟件，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)不同處理之間的方差顯著性，并用Duncan法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著.
2 結(jié)果與分析
2.1 低磷脅迫下各菌種對(duì)葉綠素含量的影響
各菌株處理后臺(tái)灣相思隨脅迫時(shí)間增加，葉綠素含量變化表現(xiàn)出差異性(表1)：無磷處理下，隨脅迫時(shí)間增加，菌株I處理組的葉綠素含量始終保持上升趨勢(shì)；菌株FI與E處理組的葉綠素含量均隨脅迫時(shí)間增加呈先升后降趨勢(shì)，70 d時(shí)達(dá)最高值；其他處理組的葉綠素含量則均在50 d時(shí)達(dá)最低值.
重度磷脅迫下，菌株F與N處理組的葉綠素含量始終高于CK組，隨脅迫時(shí)間增加總體呈先升后降趨勢(shì)，70 d 時(shí)達(dá)最高值；其余組的葉綠素含量也均在70 d時(shí)達(dá)最高值，且高于CK組該時(shí)間點(diǎn)的值.
輕度磷脅迫下，菌株F、E和FI處理組的葉綠素含量始終高于CK組，其中菌株F與FI處理組的葉綠素含量均在70 d時(shí)達(dá)最高值，菌株E處理組的葉綠素含量則在50 d時(shí)達(dá)最低值.
適量供磷下，只有菌株I、N和FI處理組在30 d時(shí)葉綠素含量低于CK組，其他各處理組在各脅迫時(shí)間點(diǎn)的葉綠素含量均高于CK組，且除菌株I處理組外，均在70 d時(shí)達(dá)最高值；菌株FI處理組的葉綠素含量在70 d時(shí)最高，為3.543 mg/g，較CK組該時(shí)間點(diǎn)的值高73.68%.
菌株FI處理組在50 d的適量供磷下葉綠素含量高于其他處理組，在70 d的無磷處理、輕度磷脅迫及適量供磷下葉綠素含量均高于其他處理組，在90 d的輕度磷脅迫和適量供磷下葉綠素含量也高于其他處理組；菌株F處理組在50 d的輕、重度磷脅迫下葉綠素含量均高于其他處理組，菌株FI處理組在70 d的輕度磷脅迫下葉綠素含量最高，為3.644 mg/g.可見，菌株FI在適量供磷條件下整個(gè)脅迫期均可促進(jìn)臺(tái)灣相思葉綠素含量的提高，而菌株F和FI在低磷脅迫中后期均表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用.
表1 不同內(nèi)生真菌在不同試驗(yàn)天數(shù)及不同磷脅迫下對(duì)臺(tái)灣相思幼苗葉片中葉綠素含量的影響Tab.1 Effects of different endophytic fungi on chlorophyll contents in the leaves of A.confusa seedlings under different experimental days and different phosphorus stress
2.2 低磷脅迫下各菌種對(duì)葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>
植物葉綠素?zé)晒馓匦詤?shù)包含光合作用中許多重要信息，相較于氣體交換指標(biāo)(凈光合速率、蒸騰速率等)，這些參數(shù)能迅速并且準(zhǔn)確地反映植物光合系統(tǒng)的內(nèi)在特性[29-30]，被視為無損傷探針，廣泛應(yīng)用于植物逆境生理和光合生理研究[31-32].
2.2.1 對(duì)PSⅡFv/Fo的影響
低磷脅迫下，各菌種處理組幼苗葉片的PSⅡFv/Fo在相同時(shí)間點(diǎn)未產(chǎn)生顯著差異(P>0.05)，說明各菌種對(duì)PSⅡFv/Fo的影響較小；在不同的低磷脅迫下，各菌種處理組50 d時(shí)的Fv/Fo最大，且與30，70和90 d時(shí)的Fv/Fo相比差異顯著(P<0.05)，說明50 d時(shí)各菌種對(duì)PSⅡFv/Fo的干擾效應(yīng)最強(qiáng)(表2).
表2 不同內(nèi)生真菌在不同試驗(yàn)天數(shù)及不同磷脅迫下對(duì)臺(tái)灣相思幼苗葉片PSⅡFv/Fo的影響Tab.2 Effects of different endophytic fungi on PSⅡFv/Fo in the leaves of A.confusa seedlings under different experimental days and different phosphorus stress
差異顯著(P<0.05)，表3同.
2.2.2 對(duì)PSⅡFv/Fm的影響
各處理組Fv/Fm在低磷脅迫下的表現(xiàn)如表3所示：無磷處理下，菌株F、N、FI處理組在50 d時(shí)Fv/Fm顯著高于CK組(P<0.05)；重度磷脅迫下，僅菌株FI處理組在70 d時(shí)Fv/Fm顯著高于CK組(P<0.05)；輕度磷脅迫下，僅菌株F處理組在70 d時(shí)Fv/Fm顯著低于CK組(P<0.05)；適量供磷下，菌株E、N處理組在50和70 d時(shí)Fv/Fm顯著高于CK組(P<0.05).
結(jié)果表明，接種菌株N在無磷處理和適量供磷的中前期對(duì)提高臺(tái)灣相思PSⅡFv/Fm有明顯的促進(jìn)作用，接種菌株FI則在重度磷脅迫的中后期有明顯的促進(jìn)作用.
表3 不同內(nèi)生真菌在不同試驗(yàn)天數(shù)及不同磷脅迫下對(duì)臺(tái)灣相思幼苗葉片PSⅡFv/Fm的影響Tab.3 Effects of different endophytic fungi on the PSⅡ Fv/Fm in the leaves ofA.confusa seedlings under different experimental days and different phosphorus stress
2.3 不同葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的多因素方差分析
以菌株種類、試驗(yàn)天數(shù)和脅迫條件為處理因子，對(duì)臺(tái)灣相思的葉綠素含量、Fv/Fo、Fv/Fm進(jìn)行多因素方差分析，結(jié)果見表4：對(duì)于葉綠素含量，脅迫條件、菌株種類與試驗(yàn)天數(shù)的兩兩交互作用均有顯著影響(P<0.05)；對(duì)于Fv/Fo，除試驗(yàn)天數(shù)有極顯著影響(P<0.01)外，其他因素均無顯著影響；對(duì)于Fv/Fm，菌株種類和試驗(yàn)天數(shù)有極顯著影響(P<0.01)，三者交互作用有極顯著影響(P<0.05)，其他因素則均無顯著影響.
表4 菌株種類、試驗(yàn)天數(shù)和脅迫條件對(duì)臺(tái)灣相思葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響的多因素方差分析Tab.4 Multivariate analysis of the influence of strain types,test days and stress conditions on the chlorophyll contents and chlorophyll fluorescence parameters of A.confusa
3 討論與結(jié)論
長(zhǎng)期處于低磷脅迫條件下的植物，為維持葉光合作用等生理功能，通過優(yōu)化葉綠素含量等磷利用機(jī)制來適應(yīng)土壤低磷環(huán)境[33]，而葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)是直接影響植物光合作用最重要的生理指標(biāo)[34].本研究中接種內(nèi)生真菌能有效緩解低磷條件給臺(tái)灣相思帶來的不良影響，不同程度促進(jìn)臺(tái)灣相思幼苗的葉綠素含量增加，其中菌株F和FI作用相對(duì)明顯，說明內(nèi)生真菌可緩解低磷脅迫對(duì)臺(tái)灣相思幼苗葉綠素合成的抑制，通過提高合成葉綠素的能力增強(qiáng)光合作用，這與湯智德等[21]在低磷脅迫下內(nèi)生真菌對(duì)植物生長(zhǎng)及光合作用有正向影響的研究結(jié)論相同，暗示內(nèi)生真菌具有與植物通過互作促進(jìn)光合作用的能力[35].另有研究表明杉木(Cunninghamialanceolata)和水稻(Oryzasativa)等植物在低磷條件下，接菌苗較無菌苗葉片的葉綠素含量也均有明顯提高[36-37].本研究所用的內(nèi)生真菌是否有助于增加植物表面積吸收磷量，從而增強(qiáng)植物吸收含磷肥料的能力還有待進(jìn)一步研究.
低磷脅迫對(duì)植物光合作用的影響不存在一致性規(guī)律，但內(nèi)生真菌可使宿主所在土壤內(nèi)的磷元素轉(zhuǎn)化為可利用形式以提高植物抗性[38].本研究中，不同低磷脅迫下，各菌株處理組臺(tái)灣相思幼苗的Fv/Fo無明顯差異，但重度磷脅迫下70和90 d時(shí)各菌株處理組的Fv/Fo基本大于對(duì)照組，可能是50 d后各菌株開始發(fā)揮明顯作用；除適量供磷條件外，90 d時(shí)各菌株處理組的Fv/Fm大部分高于對(duì)照組，表明接種內(nèi)生真菌可以緩解低磷脅迫下臺(tái)灣相思幼苗PSⅡ受到的損傷，進(jìn)而提高光能轉(zhuǎn)化效率.這與高婷[39]研究?jī)?nèi)生真菌侵染水稻幼苗后葉片的Fv/Fo、Fv/Fm均提高的結(jié)果相似.已有研究發(fā)現(xiàn)非脅迫條件下，F(xiàn)v/Fm值的變化很小，一般為0.75～0.85[40]，本研究中臺(tái)灣相思幼苗的Fv/Fm值范圍為0.814～0.856，且在不同低磷脅迫下變化不大，說明磷缺乏對(duì)臺(tái)灣相思光合特性的影響相對(duì)較小，與前人研究磷缺乏對(duì)落葉松(Larixgmelinii)Fv/Fm值影響不大的結(jié)論一致[41]；但也存在低磷脅迫下杉木Fv/Fm值明顯升高的報(bào)道[21].可見不同樹種在缺磷環(huán)境下代謝調(diào)節(jié)能力存在差異，如不同樹種磷酸丙糖的轉(zhuǎn)化能力直接影響卡爾文循環(huán)中二磷酸核酮糖再生環(huán)節(jié)[42].通常Fv/Fm值降低被認(rèn)為光合作用受光抑制[43]，而本研究中Fv/Fm值未產(chǎn)生明顯降低趨勢(shì)，表明缺磷環(huán)境未對(duì)臺(tái)灣相思幼苗產(chǎn)生光抑制作用.
本研究通過內(nèi)生真菌回接不同低磷處理的臺(tái)灣相思幼苗，對(duì)內(nèi)生真菌與臺(tái)灣相思共生體的葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測(cè)定分析，明晰了臺(tái)灣相思中4種優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌對(duì)低磷脅迫下臺(tái)灣相思葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊懹兴町?，其中菌株F、FI的促進(jìn)作用最佳，可為改良臺(tái)灣相思林分生長(zhǎng)提供參考.然而，僅從優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌對(duì)臺(tái)灣相思光合特性促進(jìn)角度開展研究并不能系統(tǒng)地改良我國(guó)南方低磷生境中臺(tái)灣相思的生長(zhǎng)狀況，進(jìn)一步分析內(nèi)生真菌對(duì)臺(tái)灣相思根際酸度、有機(jī)酸分泌、磷酸酶釋放及其對(duì)土壤磷活化的促進(jìn)機(jī)制是后續(xù)研究的重點(diǎn).
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磷元素是植物生命過程中重要的營(yíng)養(yǎng)元素之一，其通過參與植物體各部分的生理過程，調(diào)控植物的光合作用[1]，在碳水化合物、含氮化合物、脂肪、糖類的代謝[2-4]過程中對(duì)植物的信號(hào)傳導(dǎo)起關(guān)鍵作用，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性有著重要影響[5].現(xiàn)有研究表明磷素的匱乏會(huì)導(dǎo)致植物葉片中總氮含量和可溶性蛋白含量下降，葉片中色素缺乏，葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[6]，引起潛在的光氧應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致葉綠體中活性氧濃度增加，損害植物的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害[7].人工林因密度種植和連栽[8]，對(duì)土壤有效磷含量需求極大[9]，而我國(guó)南方林區(qū)普遍存在土壤磷素礦化現(xiàn)象，磷素難以被有效利用[10]，極大地限制了人工林光合效率的提高，制約著人工林的可持續(xù)經(jīng)營(yíng).
臺(tái)灣相思(Acaciaconfusa)為含羞草科金合歡屬常綠喬木，產(chǎn)于中國(guó)臺(tái)灣，廣泛分布在福建、廣東等地區(qū)，因其具有生長(zhǎng)快、耐貧瘠、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，已取代連栽后防護(hù)效益下降的木麻黃林，逐步成為東南沿海地區(qū)海岸防護(hù)林的重要改造樹種[11].現(xiàn)有研究表明，臺(tái)灣相思為磷素受限樹種[12]，栽植臺(tái)灣相思的沙跡地土壤磷素匱乏[13].因此，如何在低磷條件下提高臺(tái)灣相思對(duì)有效磷的利用效率，以促進(jìn)其在沿海防護(hù)林體系建設(shè)中的應(yīng)用極為重要.
為改善林木應(yīng)對(duì)低磷環(huán)境的脅迫，前人已從植物根系形態(tài)[14]及根系分泌物[15]、植物生長(zhǎng)及生理生化特性[16]等方面做了大量研究，雖取得一定成效，但囿于成本或生境復(fù)雜，目前還未形成低成本的高效方法.因此，近年來利用微生物與植物互利共生特性來提升植物的環(huán)境適應(yīng)性已成為研究熱點(diǎn)，在杉木篩選及其適應(yīng)磷脅迫的離子流機(jī)制[17]、叢枝菌根真菌和根際細(xì)菌群落的跨界互作網(wǎng)絡(luò)[18]、不同混播方式的燕麥(Avenasativa)與箭筈豌豆(Viciasativa)混植草地對(duì)磷利用效率的影響[19]的研究中，已成功利用微生物提升了磷的利用效率.前人發(fā)現(xiàn)利用植物內(nèi)生真菌能有效提升尾巨桉(E.urophylla×E.grandis)、黑麥草(Loliumperenne)和杉木(Cunninghamialanceolata)的光合作用效率[20-22]，但對(duì)臺(tái)灣相思是否存在與其內(nèi)生真菌有互利共生特性，及其對(duì)提升植物光合適應(yīng)性的作用，目前尚未見報(bào)道.因此，本研究在前期篩選臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌[11]的基礎(chǔ)上，通過磷脅迫方式分析臺(tái)灣相思的光合作用相關(guān)指標(biāo)變化，以解析低磷條件下內(nèi)生真菌對(duì)臺(tái)灣相思葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?，初步了解?nèi)生真菌與宿主臺(tái)灣相思協(xié)同應(yīng)對(duì)磷素脅迫的生理機(jī)制，以期為臺(tái)灣相思促生工程菌的開發(fā)提供參考，亦為東南沿海海岸防護(hù)林可持續(xù)改造提供基礎(chǔ)依據(jù).
1 材料與方法
1.1 材 料
試驗(yàn)用苗為一年生臺(tái)灣相思幼苗(福建漳州林業(yè)局提供)，苗木采用土培方式定植于塑料盆(高20 cm、直徑21 cm)，每盆裝3 kg黃壤(土壤類別為二類)，等量甲醛熏蒸消毒，定植后緩苗30 d.土壤化學(xué)性質(zhì)經(jīng)測(cè)定，含有機(jī)質(zhì)8.311 mg/g、全氮0.107 mg/g、水解氮0.035 mg/g、全磷0.353 mg/g、有效磷0.019 mg/g、全鉀2.889 mg/g、速效鉀0.025 mg/g.
試驗(yàn)菌株為前期從臺(tái)灣相思中篩選并鑒定的溶磷效果較好的4株內(nèi)生真菌[11]：絲黑粉菌屬F (Filobasidiumsp.)、青霉屬I (Penicilliumsp.)、青霉屬E (Penicilliumsp.)、青霉屬N (Penicilliumsp.).因預(yù)試驗(yàn)中菌株F與I產(chǎn)生較大溶磷圈，故設(shè)置菌株FI混合菌組，進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)勢(shì)菌株結(jié)合的溶磷效果.菌種均保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，F(xiàn)、I、E、N菌種保藏號(hào)分別為CGMCC 12102、CGMCC 11914、CGMCC 11913、CGMCC 11907.
1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
1.2.1 菌液制備與接種
將供試菌種F、I、E、N分別接入40 mL的菌液培養(yǎng)基，恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，采用血球計(jì)數(shù)法，用無菌水稀釋成密度為5.5×106mL-1的菌液.FI菌液由F菌液與I菌液按質(zhì)量比1∶1混合制得.連續(xù)3 d 在苗木根際施加100 mL上述菌液，以加入同體積滅活的稀釋培養(yǎng)基溶液為對(duì)照(CK)，共F、I、E、N、FI、CK 6個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù).
1.2.2 低磷脅迫處理
試驗(yàn)均于玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行，室溫18～28 ℃，濕度75%，光照時(shí)長(zhǎng)14 h/d.生長(zhǎng)季節(jié)早晚各淋水1次，每次淋水淋透基質(zhì)[23].試驗(yàn)期間均勻澆施1次無磷1/3 Hoagland/7d 營(yíng)養(yǎng)液[24]，每盆每次澆施30 mL[25].接菌15 d后開始低磷脅迫處理，采用KH2PO4作為磷肥，設(shè)置4個(gè)磷處理水平[23,26]，分別為無磷處理(0 mg/kg)、重度磷脅迫(10 mg/kg)、輕度磷脅迫(20 mg/kg)和適量供磷(40 mg/kg)，每個(gè)水平3個(gè)重復(fù)，并分別對(duì)應(yīng)F、I、E、N、FI、CK 6個(gè)接菌方式，共計(jì)72盆.分別于脅迫30，50，70，90 d時(shí)進(jìn)行葉綠素含量取樣測(cè)定[27].
1.3 測(cè)定方法
1.3.1 葉綠素含量測(cè)定
采用丙酮乙醇提取法測(cè)定葉綠素含量[28]，取大小相對(duì)一致的健康葉片，洗凈吸干水分后，稱取0.1 g鮮葉放入試管，加入15 mL混合液(丙酮與乙醇體積比為1∶1).在室溫下暗反應(yīng)24 h后，分別于663 nm和645 nm測(cè)定上清液的吸光度(A663和A645)，葉綠素含量(mg/g)計(jì)算公式如下：
葉綠素含量=(8.04×A663+20.3×A645)×
V/(1 000×W)，
式中，V為提取液總體積(mL)，W為葉鮮質(zhì)量(g).各樣品重復(fù)測(cè)定3次后取平均值.
1.3.2 葉綠素?zé)晒馓匦詼y(cè)定
采用Os-5p型便攜式葉綠素?zé)晒鈨x(Opti-science，USA)于晴朗無云天氣連續(xù)3 d(上午9：00—11：00)進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定：選擇植株中上部陽向枝條上展開的葉齡一致的葉片，用暗反應(yīng)夾對(duì)葉片進(jìn)行暗適應(yīng)30 min后，測(cè)定待測(cè)葉片的初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)和可變熒光(Fv)，并計(jì)算光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的活性(Fv/Fo)及最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm).
1.4 數(shù)據(jù)處理與分析
數(shù)據(jù)整理與作圖均采用Excel 2007軟件，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)不同處理之間的方差顯著性，并用Duncan法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著.
2 結(jié)果與分析
2.1 低磷脅迫下各菌種對(duì)葉綠素含量的影響
各菌株處理后臺(tái)灣相思隨脅迫時(shí)間增加，葉綠素含量變化表現(xiàn)出差異性(表1)：無磷處理下，隨脅迫時(shí)間增加，菌株I處理組的葉綠素含量始終保持上升趨勢(shì)；菌株FI與E處理組的葉綠素含量均隨脅迫時(shí)間增加呈先升后降趨勢(shì)，70 d時(shí)達(dá)最高值；其他處理組的葉綠素含量則均在50 d時(shí)達(dá)最低值.
重度磷脅迫下，菌株F與N處理組的葉綠素含量始終高于CK組，隨脅迫時(shí)間增加總體呈先升后降趨勢(shì)，70 d 時(shí)達(dá)最高值；其余組的葉綠素含量也均在70 d時(shí)達(dá)最高值，且高于CK組該時(shí)間點(diǎn)的值.
輕度磷脅迫下，菌株F、E和FI處理組的葉綠素含量始終高于CK組，其中菌株F與FI處理組的葉綠素含量均在70 d時(shí)達(dá)最高值，菌株E處理組的葉綠素含量則在50 d時(shí)達(dá)最低值.
適量供磷下，只有菌株I、N和FI處理組在30 d時(shí)葉綠素含量低于CK組，其他各處理組在各脅迫時(shí)間點(diǎn)的葉綠素含量均高于CK組，且除菌株I處理組外，均在70 d時(shí)達(dá)最高值；菌株FI處理組的葉綠素含量在70 d時(shí)最高，為3.543 mg/g，較CK組該時(shí)間點(diǎn)的值高73.68%.
菌株FI處理組在50 d的適量供磷下葉綠素含量高于其他處理組，在70 d的無磷處理、輕度磷脅迫及適量供磷下葉綠素含量均高于其他處理組，在90 d的輕度磷脅迫和適量供磷下葉綠素含量也高于其他處理組；菌株F處理組在50 d的輕、重度磷脅迫下葉綠素含量均高于其他處理組，菌株FI處理組在70 d的輕度磷脅迫下葉綠素含量最高，為3.644 mg/g.可見，菌株FI在適量供磷條件下整個(gè)脅迫期均可促進(jìn)臺(tái)灣相思葉綠素含量的提高，而菌株F和FI在低磷脅迫中后期均表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用.
表1 不同內(nèi)生真菌在不同試驗(yàn)天數(shù)及不同磷脅迫下對(duì)臺(tái)灣相思幼苗葉片中葉綠素含量的影響Tab.1 Effects of different endophytic fungi on chlorophyll contents in the leaves of A.confusa seedlings under different experimental days and different phosphorus stress
2.2 低磷脅迫下各菌種對(duì)葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>
植物葉綠素?zé)晒馓匦詤?shù)包含光合作用中許多重要信息，相較于氣體交換指標(biāo)(凈光合速率、蒸騰速率等)，這些參數(shù)能迅速并且準(zhǔn)確地反映植物光合系統(tǒng)的內(nèi)在特性[29-30]，被視為無損傷探針，廣泛應(yīng)用于植物逆境生理和光合生理研究[31-32].
2.2.1 對(duì)PSⅡFv/Fo的影響
低磷脅迫下，各菌種處理組幼苗葉片的PSⅡFv/Fo在相同時(shí)間點(diǎn)未產(chǎn)生顯著差異(P>0.05)，說明各菌種對(duì)PSⅡFv/Fo的影響較小；在不同的低磷脅迫下，各菌種處理組50 d時(shí)的Fv/Fo最大，且與30，70和90 d時(shí)的Fv/Fo相比差異顯著(P<0.05)，說明50 d時(shí)各菌種對(duì)PSⅡFv/Fo的干擾效應(yīng)最強(qiáng)(表2).
表2 不同內(nèi)生真菌在不同試驗(yàn)天數(shù)及不同磷脅迫下對(duì)臺(tái)灣相思幼苗葉片PSⅡFv/Fo的影響Tab.2 Effects of different endophytic fungi on PSⅡFv/Fo in the leaves of A.confusa seedlings under different experimental days and different phosphorus stress
差異顯著(P<0.05)，表3同.
2.2.2 對(duì)PSⅡFv/Fm的影響
各處理組Fv/Fm在低磷脅迫下的表現(xiàn)如表3所示：無磷處理下，菌株F、N、FI處理組在50 d時(shí)Fv/Fm顯著高于CK組(P<0.05)；重度磷脅迫下，僅菌株FI處理組在70 d時(shí)Fv/Fm顯著高于CK組(P<0.05)；輕度磷脅迫下，僅菌株F處理組在70 d時(shí)Fv/Fm顯著低于CK組(P<0.05)；適量供磷下，菌株E、N處理組在50和70 d時(shí)Fv/Fm顯著高于CK組(P<0.05).
結(jié)果表明，接種菌株N在無磷處理和適量供磷的中前期對(duì)提高臺(tái)灣相思PSⅡFv/Fm有明顯的促進(jìn)作用，接種菌株FI則在重度磷脅迫的中后期有明顯的促進(jìn)作用.
表3 不同內(nèi)生真菌在不同試驗(yàn)天數(shù)及不同磷脅迫下對(duì)臺(tái)灣相思幼苗葉片PSⅡFv/Fm的影響Tab.3 Effects of different endophytic fungi on the PSⅡ Fv/Fm in the leaves ofA.confusa seedlings under different experimental days and different phosphorus stress
2.3 不同葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的多因素方差分析
以菌株種類、試驗(yàn)天數(shù)和脅迫條件為處理因子，對(duì)臺(tái)灣相思的葉綠素含量、Fv/Fo、Fv/Fm進(jìn)行多因素方差分析，結(jié)果見表4：對(duì)于葉綠素含量，脅迫條件、菌株種類與試驗(yàn)天數(shù)的兩兩交互作用均有顯著影響(P<0.05)；對(duì)于Fv/Fo，除試驗(yàn)天數(shù)有極顯著影響(P<0.01)外，其他因素均無顯著影響；對(duì)于Fv/Fm，菌株種類和試驗(yàn)天數(shù)有極顯著影響(P<0.01)，三者交互作用有極顯著影響(P<0.05)，其他因素則均無顯著影響.
表4 菌株種類、試驗(yàn)天數(shù)和脅迫條件對(duì)臺(tái)灣相思葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響的多因素方差分析Tab.4 Multivariate analysis of the influence of strain types,test days and stress conditions on the chlorophyll contents and chlorophyll fluorescence parameters of A.confusa
3 討論與結(jié)論
長(zhǎng)期處于低磷脅迫條件下的植物，為維持葉光合作用等生理功能，通過優(yōu)化葉綠素含量等磷利用機(jī)制來適應(yīng)土壤低磷環(huán)境[33]，而葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)是直接影響植物光合作用最重要的生理指標(biāo)[34].本研究中接種內(nèi)生真菌能有效緩解低磷條件給臺(tái)灣相思帶來的不良影響，不同程度促進(jìn)臺(tái)灣相思幼苗的葉綠素含量增加，其中菌株F和FI作用相對(duì)明顯，說明內(nèi)生真菌可緩解低磷脅迫對(duì)臺(tái)灣相思幼苗葉綠素合成的抑制，通過提高合成葉綠素的能力增強(qiáng)光合作用，這與湯智德等[21]在低磷脅迫下內(nèi)生真菌對(duì)植物生長(zhǎng)及光合作用有正向影響的研究結(jié)論相同，暗示內(nèi)生真菌具有與植物通過互作促進(jìn)光合作用的能力[35].另有研究表明杉木(Cunninghamialanceolata)和水稻(Oryzasativa)等植物在低磷條件下，接菌苗較無菌苗葉片的葉綠素含量也均有明顯提高[36-37].本研究所用的內(nèi)生真菌是否有助于增加植物表面積吸收磷量，從而增強(qiáng)植物吸收含磷肥料的能力還有待進(jìn)一步研究.
低磷脅迫對(duì)植物光合作用的影響不存在一致性規(guī)律，但內(nèi)生真菌可使宿主所在土壤內(nèi)的磷元素轉(zhuǎn)化為可利用形式以提高植物抗性[38].本研究中，不同低磷脅迫下，各菌株處理組臺(tái)灣相思幼苗的Fv/Fo無明顯差異，但重度磷脅迫下70和90 d時(shí)各菌株處理組的Fv/Fo基本大于對(duì)照組，可能是50 d后各菌株開始發(fā)揮明顯作用；除適量供磷條件外，90 d時(shí)各菌株處理組的Fv/Fm大部分高于對(duì)照組，表明接種內(nèi)生真菌可以緩解低磷脅迫下臺(tái)灣相思幼苗PSⅡ受到的損傷，進(jìn)而提高光能轉(zhuǎn)化效率.這與高婷[39]研究?jī)?nèi)生真菌侵染水稻幼苗后葉片的Fv/Fo、Fv/Fm均提高的結(jié)果相似.已有研究發(fā)現(xiàn)非脅迫條件下，F(xiàn)v/Fm值的變化很小，一般為0.75～0.85[40]，本研究中臺(tái)灣相思幼苗的Fv/Fm值范圍為0.814～0.856，且在不同低磷脅迫下變化不大，說明磷缺乏對(duì)臺(tái)灣相思光合特性的影響相對(duì)較小，與前人研究磷缺乏對(duì)落葉松(Larixgmelinii)Fv/Fm值影響不大的結(jié)論一致[41]；但也存在低磷脅迫下杉木Fv/Fm值明顯升高的報(bào)道[21].可見不同樹種在缺磷環(huán)境下代謝調(diào)節(jié)能力存在差異，如不同樹種磷酸丙糖的轉(zhuǎn)化能力直接影響卡爾文循環(huán)中二磷酸核酮糖再生環(huán)節(jié)[42].通常Fv/Fm值降低被認(rèn)為光合作用受光抑制[43]，而本研究中Fv/Fm值未產(chǎn)生明顯降低趨勢(shì)，表明缺磷環(huán)境未對(duì)臺(tái)灣相思幼苗產(chǎn)生光抑制作用.
本研究通過內(nèi)生真菌回接不同低磷處理的臺(tái)灣相思幼苗，對(duì)內(nèi)生真菌與臺(tái)灣相思共生體的葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測(cè)定分析，明晰了臺(tái)灣相思中4種優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌對(duì)低磷脅迫下臺(tái)灣相思葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊懹兴町?，其中菌株F、FI的促進(jìn)作用最佳，可為改良臺(tái)灣相思林分生長(zhǎng)提供參考.然而，僅從優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌對(duì)臺(tái)灣相思光合特性促進(jìn)角度開展研究并不能系統(tǒng)地改良我國(guó)南方低磷生境中臺(tái)灣相思的生長(zhǎng)狀況，進(jìn)一步分析內(nèi)生真菌對(duì)臺(tái)灣相思根際酸度、有機(jī)酸分泌、磷酸酶釋放及其對(duì)土壤磷活化的促進(jìn)機(jī)制是后續(xù)研究的重點(diǎn).
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