呂霞劉歡12

應(yīng)激是由社會(huì)環(huán)境因素引起的非特異性和適應(yīng)性反應(yīng)。適當(dāng)?shù)膽?yīng)激有利于維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)力。然而，長時(shí)間應(yīng)激會(huì)使機(jī)體生理系統(tǒng)和器官發(fā)生改變，導(dǎo)致應(yīng)激損傷，對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生有害影響[1]。大腦是應(yīng)激反應(yīng)的敏感靶器官，長期應(yīng)激刺激會(huì)改變大腦的結(jié)構(gòu)，擾亂下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)，導(dǎo)致神經(jīng)元的丟失，海馬體的萎縮，進(jìn)而使認(rèn)知能力下降[2～4]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)長期處于應(yīng)激狀態(tài)下的人群輕度認(rèn)知障礙和癡呆癥的患病率較同齡非應(yīng)激狀態(tài)人群高2倍以上[5]。腦組織內(nèi)β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積是導(dǎo)致認(rèn)知功能下降的重要原因之一，慢性應(yīng)激可升高糖皮質(zhì)激素水平，促進(jìn)Aβ沉積[6]，也可通過下調(diào)胱硫氨酸β合酶的水平從而升高同型半胱氨酸的濃度，使大腦對(duì)β-淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)處理發(fā)生錯(cuò)誤，增加Aβ沉積，降低認(rèn)知功能[7，8]。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞，占神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)的5%～10%，靜息狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞可在Aβ沉積物周圍形成一個(gè)保護(hù)性屏障，抑制Aβ的擴(kuò)散，也可吸收和清除可溶性Aβ，防止Aβ的聚集[9]。然而，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可通過信號(hào)分子，促進(jìn)Aβ的產(chǎn)生，也可抑制補(bǔ)體激活途徑，降低其吞噬降解Aβ的能力[10]?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞表達(dá)高水平的晚期糖基化受體(Receptor of Advanced Glycation Endproducts，RAGE)、清道夫受體(Scavenger Receptor，SR)和Toll樣受體(Toll-Like Recepetor，TLR)、髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體2(TREM2)，促進(jìn)Aβ進(jìn)入小膠質(zhì)細(xì)胞[11，12]，積累的Aβ可通過一系列反應(yīng)損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致認(rèn)知能力減退[13]。近來對(duì)癡呆患者和動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)[14，15]，Aβ沉積部位存在著活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步說明了活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可能對(duì)Aβ沉積和認(rèn)知能力的減退有影響。 本研究擬探討慢性應(yīng)激是否可影響小膠質(zhì)細(xì)胞功能和Aβ沉積，為探索慢性應(yīng)激影響認(rèn)知功能的機(jī)制提供線索。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠16只，體質(zhì)量(180±20) g，購買于北京斯貝福生物科技有限公司，隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，每組8只。動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度為(25±1) ℃，濕度為70%±2%，12 h晝夜循環(huán)的環(huán)境中。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行慢性不可預(yù)知性刺激(CUMS)造模。

1.2 方法

1.2.1 CUMS模型建立 參考文獻(xiàn)采用CUMS方法制備動(dòng)物模型[6]， 每天從9種應(yīng)激方式(夾尾2 min、墊料潮濕8 h、晝夜顛倒24 h、搖晃鼠籠15 min、束縛2 h、禁食24 h、禁水24 h、60 Hz噪聲1 h、4 ℃冰水游泳5～10 min)中隨機(jī)選擇2種，給予大鼠；為避免大鼠對(duì)應(yīng)激方式產(chǎn)生適應(yīng)性，3 d內(nèi)不重復(fù)采用相同的刺激方式，持續(xù)12周。

1.2.2 曠場實(shí)驗(yàn)(Open-filed test) 使用曠場實(shí)驗(yàn)來評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)能力和認(rèn)知功能。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將大鼠放置于62.5× 74.0× 51.0 cm的黑盒中，自由運(yùn)動(dòng)，記錄5 min內(nèi)大鼠的運(yùn)動(dòng)距離和靜止時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用75%的酒精擦拭儀器。

1.2.3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(Elevated-plus maze) 高架十字迷宮由兩個(gè)開臂(50×10 cm, L×W)和兩個(gè)閉臂(50×10×40 cm, L×W×H)組成，形狀如同一個(gè)十字。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將每只大鼠放于中央，自由運(yùn)動(dòng)5 min，記錄其運(yùn)動(dòng)的距離和靜止的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用75%的酒精擦拭儀器。

1.2.4 取材 行為學(xué)檢測結(jié)束后，采用水合氯醛(0.3 ml /100 g)麻醉，斷頭取出完整的大腦組織，浸沒于4%中性多聚甲醛固定并過夜，梯度脫水，石蠟包埋，沿大腦組織冠狀面進(jìn)行切片，切片厚度約為3～4 μm，包括皮質(zhì)和海馬區(qū)等。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 測定腦組織內(nèi)的Aβ1-40和Aβ1-42使用大鼠Aβ1-40和Aβ1-42的ELISA試劑盒，根據(jù)說明書的方法和操作步驟進(jìn)行操作，將腦組織與PBS緩沖液按1∶9的比例稀釋，裂解組織后，4 ℃離心15 min后取上清液，測量腦組織勻漿中Aβ1-40和Aβ1-42的濃度。使用BCA蛋白定量試劑盒測定腦組織勻漿上清液的總蛋白量。最后根據(jù)蛋白定量的濃度，換算腦組織內(nèi)Aβ的含量。

1.2.6 免疫熒光(immunofluorescence) 腦組織石蠟切片脫蠟后，與原代多克隆鼠抗Iba-1(1∶100)，兔抗Aβ1-40(1∶100)，兔抗Aβ1-42(1∶100)，兔抗TLR4(1∶100)，兔抗RAGE(1∶100)4 ℃孵育12～16 h，然后與熒光偶聯(lián)二抗(山羊抗兔，1∶1 000或山羊抗鼠1∶10 000)常溫孵育1 h后，最后加入4’，6-二氨基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)封片，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0和GraphPad Prism 5.0進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CUMS對(duì)大鼠認(rèn)知能力的影響 與對(duì)照組比較，模型組曠場實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的靜止時(shí)間增加(P<0.01)，運(yùn)動(dòng)距離縮短(P<0.05)。見表1。

表1 兩組認(rèn)知能力比較

2.2 CUMS對(duì)大鼠腦內(nèi)Aβ的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腦內(nèi)Aβ1-40和Aβ1-42水平均升高(P<0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠腦內(nèi)Aβ水平比較

2.3 CUMS對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Aβ含量的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加(P<0.05)；模型組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)中小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的Aβ1-40和Aβ1-42增加(P<0.05)。見表3，表4，圖1。

表3 CUMS對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響

表4 兩組小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Aβ含量比較

2.4 CUMS對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞Aβ吞噬受體RAGE和TLR4表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組海馬和皮質(zhì)區(qū)內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TLR4和RAGE表達(dá)增加(P<0.05)。見表5，圖2。

表5 兩組小膠質(zhì)細(xì)胞Aβ吞噬受體RAGE和TLR4表達(dá)比較

注：海馬冠狀切片圖標(biāo)尺=50 μm(200×)

注：海馬冠狀切片圖標(biāo)尺=50 μm(200×)

3 討論

慢性應(yīng)激是認(rèn)知能力下降和癡呆發(fā)生的強(qiáng)危險(xiǎn)因素，會(huì)增加癡呆的發(fā)病率，提前癡呆的發(fā)病年齡[16]。本研究使用曠場實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮兩種方式驗(yàn)證慢性應(yīng)激對(duì)動(dòng)物認(rèn)知功能的影響，結(jié)果均顯示其探索能力和認(rèn)知運(yùn)動(dòng)能力降低，提示慢性應(yīng)激可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)認(rèn)知能力的下降。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦內(nèi)Aβ含量增加，海馬區(qū)與皮質(zhì)均有沉積。Aβ主要以Aβ1-40和Aβ1-42的形式存在于腦內(nèi)，其中 Aβ1-40作為主要的可溶性Aβ形式，其數(shù)量較Aβ1-42多，但Aβ1-42更易纖維化聚集成斑塊，具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性[17，18]。本研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)Aβ1-42的濃度比Aβ1-40低，與以上研究一致。生理情況下Aβ的生成和降解處于動(dòng)態(tài)平衡，使Aβ1-40和Aβ1-42維持在較低水平[19]。有研究發(fā)現(xiàn)6周CUMS刺激導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)Aβ的輕微增加[8]。更有研究顯示慢性應(yīng)激刺激可導(dǎo)致APP裂解酶的活性異常增高，小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬清除Aβ的能力受損，腦內(nèi)Aβ異常沉積，可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙發(fā)生[20]。海馬和皮質(zhì)是調(diào)控記憶力和認(rèn)知功能的主要腦區(qū)，當(dāng)海馬和皮質(zhì)區(qū)內(nèi)Aβ含量升高時(shí)，尤其Aβ1-42的濃度增加時(shí)，可促進(jìn)老年斑塊的形成，減退認(rèn)知功能[21]。本研究使用12周CUMS刺激，造成慢性應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)大鼠腦組織皮質(zhì)及海馬區(qū)內(nèi)Aβ1-40和Aβ1-42含量均增加，認(rèn)知運(yùn)動(dòng)功能下降。以上現(xiàn)象可能與，在CUMS造模下，大鼠腦組織內(nèi)Aβ不斷累積，進(jìn)一步誘導(dǎo)下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減退認(rèn)知能力有關(guān)[21]。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與神經(jīng)元的正常連接，調(diào)節(jié)正常的認(rèn)知功能[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，CUMS大鼠腦組織皮質(zhì)和海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活。有研究顯示，慢性刺激下，小膠質(zhì)細(xì)胞激活，介導(dǎo)產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，使小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬清除Aβ的能力受損[20]。本研究表明，CUMS造模下，腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Aβ水平升高。細(xì)胞內(nèi)Aβ水平升高可能與細(xì)胞外Aβ生成增多、細(xì)胞內(nèi)降解下降有關(guān)。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌各種信號(hào)分子作用于其他神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)致Aβ生成增多[23]，還可減少腦內(nèi)胰島素降解酶的分泌，抑制Aβ的降解，導(dǎo)致Aβ沉積[12]。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞清除Aβ的能力降低，促進(jìn)Aβ的積累，導(dǎo)致認(rèn)知障礙病理進(jìn)程的發(fā)展[24]。

RAGE和TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，Aβ與小膠質(zhì)細(xì)胞表面的RAGE或TLR4結(jié)合，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，使炎癥水平升高，可能引起神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知能力降低[25]。在AD患者和動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)，腦(包括海馬區(qū))內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中RAGE和TLR4表達(dá)增加，且當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞向Aβ靠攏時(shí)，其將高度表達(dá)細(xì)胞表面受體RAGE和TLR4等，從而使受體能夠識(shí)別Aβ并與之結(jié)合攝入細(xì)胞內(nèi)，使腦內(nèi)Aβ的水平增加[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞在12周慢性刺激下被激活，并可能上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)RAGE和TLR4受體表達(dá)，促進(jìn)對(duì)Aβ的吞噬，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Aβ的積累。

綜上，慢性應(yīng)激可引起腦內(nèi)Aβ含量增加和認(rèn)知能力的減退，這可能與激活腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞Aβ攝取受體RAGE和TLR4表達(dá)上調(diào)，造成小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ的攝取增加、清除減弱有關(guān)。